Zika Virus System infettiva coltura cellulare e la

L'obiettivo generale di questo studio è quello di stabilire un sistema di coltura infettiva in vitro basato su cellule di mammifero per lo studio della replicazione del virus Zika, nonché l'utilizzo della piattaforma in vitro per lo sviluppo di farmaci. Questo protocollo dettagliato passo dopo passo del sistema di coltura cellulare infettiva per il virus Zika può contribuire a chiarire il meccanismo di patogenesi delle malattie indotte dal virus Zika e l'evoluzione della virulenza virale. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente la produzione su larga scala del virus Zika per lo sviluppo di farmaci e vaccini.

Iniziare raccogliendo le cellule Vero a una densità cellulare dell'80% in un fiasco colturale T75, aspirando il mezzo dal fiasco e lavando le cellule con due millilitri di soluzione salina tamponata al fosfato. Aggiungere due millilitri di tripsina allo 0,25% e incubare il fiasco a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere otto millilitri di mezzo di crescita contenente siero per inattivare la tripsina. Successivamente, trasferire le cellule in un tubo da 15 millilitri. Prelevare quindi 10 microlitri di cellule e mescolarli con una quantità uguale di blu di tripano allo 0,4%. Caricare la miscela preparata nella camera per il conteggio cellulare e determinare il numero di cellule vitali mediante un contatore cellulare automatico. Seminare un totale di sette milioni di cellule in un fiasco T160 in un volume di 30 millilitri. Il giorno successivo, preparare un'adeguata molteplicità di infezione dell'inoculo del virus Zika in 10 millilitri di mezzo di coltura privo di siero per ogni fiasco.

La manipolazione sicura del virus è fondamentale per prevenire la diffusione dell'infezione.

Rimuovere il mezzo usato dal fiasco T160 e quindi aggiungere tutti i 10 millilitri di inocolo virale appena preparato. Incubare i fiaschi inoculati a 37 gradi Celsius con 5%CO2 per quattro-sei ore. Distribuire l'inoculo inclinando delicatamente il fiasco lateralmente ogni ora durante l'incubazione. Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con 30 millilitri di mezzo di crescita tiepido integrato con siero. Proseguire quindi la coltura virale per le successive 96 ore. Dopo quattro giorni, verificare l'andamento dell'infezione osservando l'aspetto delle placche virali sul monolayer cellulare, utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Acquisire immagini secondo necessità a 40x e 200x di ingrandimento.

Raccogliere i supernatanti della coltura cellulare al tempo di 96 ore e centrifugare il supernatante a 300 ×g per 10 minuti a quattro gradi Celsius per rimuovere i detriti cellulari. Dopo la centrifugazione, rimuovere con attenzione i supernatanti senza disturbare il pellet di detriti e trasferirli in provette da 15 millilitri.

Conservare i supernatanti della coltura virale in aliquote multiple a meno 80 gradi Celsius.

Per titolare il virus, seminare innanzitutto cellule Vero naive in una piastra a 12 pozzetti a una densità di uno per dieci alla quinta cellule per pozzetto, in un volume di due millilitri. Il giorno seguente, preparare diluizioni seriali decrescenti di dieci volte dei supernatanti della coltura virale, raccolti dal flask T160 utilizzando mezzo privo di siero.

Quando si preparano diluizioni seriali del supernatante della coltura virale per la titolazione degli acidi, assicurarsi di manipolare il virus in modo sicuro per prevenire infezioni.

Successivamente, rimuovere il mezzo usato da ogni pozzetto della piastra a 12 pozzetti contenente cellule Vero e aggiungere 400 microlitri dell'inoculo diluito sulle cellule Vero in triplice replicato. Incubare le piastre inoculate nell'incubatore per colture cellulari per quattro-sei ore.

Al termine dell'incubazione, sostituire l'inoculo con due millilitri di mezzo supplementato con siero per pozzetto. A 48 ore dall'inoculo, contare le placche virali alle diluizioni appropriate, utilizzando un microscopio a contrasto di fase. Calcolare il titolo virale in unità formanti placca per millilitro.

Dopo aver inoculato cellule Vero in una piastra a 12 pozzetti con titoli elevati e bassi del virus Zika, e averle incubate per 48 e 96 ore, la replicazione del genoma viene valutata mediante PCR quantitativa per l'espressione del genoma virale Zika e mediante immunocitochimica per l'RNA a doppio filamento.

Per l'immunocitochimica, rimuovere il mezzo dalle pozzette della piastra a 12 pozzette e aggiungere un millilitro di metanolo in ciascuna pozzetta. Lasciare fissare le cellule a quattro gradi Celsius per 30 minuti. Successivamente, lavare le cellule fissate tre volte con PBS 1x. Poi aggiungere il buffer di blocco e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Diluire l'anticorpo monoclonale murino anti-RNA a doppio filamento J2 nel buffer di blocco in rapporto 1:100, aggiungerlo alle cellule e incubare le cellule in questa soluzione tutta la notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, diluire l'anticorpo secondario caprino anti-mouse IgG-594 nel buffer di blocco in rapporto 1:1.000 e, dopo aver lavato le cellule con PBS 1x, aggiungerlo alle cellule e incubarle per un'ora a temperatura ambiente. Dopo aver lavato le cellule con PBS 1x, colorare i nuclei utilizzando il colorante Hoechst e osservare le cellule mediante microscopio a fluorescenza con un ingrandimento di 100x.

Six ore dopo aver seminato una piastra a 12 pozzetti con cellule Vero naive, come in precedenza, aggiungere le citochine di interesse alle concentrazioni indicate in duplicati biologici. Dodici ore dopo il trattamento, effettuare l'infezione con il virus Zika e includere pozzetti di controllo negativo senza infezione. Quattro ore dopo l'infezione, sostituire l'inoculo virale con mezzo trattato con citochine, quindi incubare le cellule a 37 gradi Celsius per ulteriori 44 ore. A 48 ore dall'infezione, contare le placche virali utilizzando un microscopio a contrasto di fase e acquisire immagini rappresentative delle cellule infette a un ingrandimento di 40x.

Questo grafico mostra il contenuto genomico del virus Zika misurato mediante RT-qPCR. I primer per il genotipo Pan e per la ceppa PRVABC-59 hanno mostrato uguale sensibilità e specificità. Come previsto, i primer virali per l'epatite C non hanno amplificato alcun prodotto.

Cinetiche di crescita virale del Zika nei punti temporali indicati in cellule infette con titolo basso e alto, confrontate con quelle del controllo non infetto (mock), sono mostrate qui. I risultati del saggio di immunocitochimica mostrano che a 48 ore post-infezione le cellule infette sono presenti in pochi aggregati, mentre a 96 ore post-infezione la maggior parte delle cellule è infetta. Questo grafico mostra la modulazione della crescita virale del Zika da parte di diverse citochine, confrontata con quella del controllo veicolo.

Queste immagini a contrasto di fase mostrano cellule infettate dal virus Zika con o senza trattamento con citochine. Le placche virali formate dalle cellule infettate sono visibili come foci. Si noti che le pozzette trattate con interferone non presentano placche virali.

Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi, come la mappatura ad alta risoluzione di dominii del virus Zika per la localizzazione delle proteine virali e la replicazione nelle cellule di zanzara e umane, al fine di rispondere a ulteriori domande, ad esempio chiarire il meccanismo di patogenesi della malattia e l'evoluzione della virulenza virale. Dopo aver visionato questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come stabilire un sistema di coltura infettiva in vitro basato su cellule di mammifero per lo studio della replicazione del virus Zika, nonché dell'utilizzo della piattaforma in vitro per lo sviluppo di farmaci e vaccini.