Name: Capsule Estrazione di Plant-based per applicazioni di microincapsulazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 54 s
Description: Scopri un metodo rapido per estrarre capsule di sporopollenina da spore di Lycopodium clavatum per applicazioni di microincapsulazione alimentare e sanitaria. Questa tecnica riduce significativamente i tempi rispetto ai metodi tradizionali.

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Questo lavoro è stato supportato dalla National Research Foundation (NRF-NRFF2011-01) e dal National Medical Research Council (NMRC/CBRG/0005/2012).

1. Estrazione di sporopollenin exine capsule (SEC) da L. clavatum spore Nota: Il processo di estrazione SEC comporta una polvere infiammabile (L. clavatum), acidi corrosivi caldi, e solventi infiammabili, quindi un equipaggiamento di protezione individuale (occhiali, maschera viso, guanti, camice da laboratorio), la valutazione dei rischi approvato il loro utilizzo, e lo smaltimento dei prodotti chimici da personale di laboratorio autorizzato è essenziale. <ol><li> spore sgrassante <ol><li> Preparare un reflusso set-up in una cappa aspirante tramite un condensatore di vetro, sistema di circolazione dell&#39;acqua e bagnomaria (Figura 1). </li><li> Pesare 100 g L. spore clavatum senza creare polvere e lontano da fonti di ignizione. Nota: Le spore utilizzate qui sono state commercialmente ottenuto (vedi Materiali List). </li><li> spore Trasferire lentamente ad una 1 L politetrafluoroetilene (PTFE) pallone a fondo tondo con un agitatore magnetico. </li><li> Aggiungere 500 ml di acetone per le spore delpallone PTFE e scuotere delicatamente il pallone in modo da formare una sospensione omogenea. </li><li> Porre il pallone PTFE nel set bagnomaria a 50 ° C e connettersi al condensatore a riflusso. </li><li> Eseguire riflusso in acetone per 6 ore con agitazione a 200 rpm e poi si lascia raffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Filtrare la sospensione con carta da filtro sotto vuoto e raccogliere le spore sgrassate in grandi (15 cm di diametro) piatti di vetro di Petri. </li><li> Essiccare le spore a temperatura ambiente (cappa) coprendo con un foglio di alluminio con fori per evaporazione del solvente. </li></ol></li><li> acidolisi <ol><li> Preparare 85% (v / v) di acido fosforico con acqua deionizzata (DI) e trasferire spore secco sgrassate in un matraccio PTFE 1 L. </li><li> Aggiungere 500 ml di acido fosforico (85% v / v) alle spore sgrassate. </li><li> Porre il pallone PTFE in un set bagno di acqua a 70 ° C e connettersi al condensatore a riflusso. </li><li> Eseguire dolce riflusso (70 ° C) in acido fosforico per 30 ore e quindi si lascia araffreddare a temperatura ambiente. </li><li> Diluire la sospensione con acqua DI 500 ml caldo e raccogliere i SEC per filtrazione sotto vuoto usando carta da filtro. </li><li> Trasferire il SECs ad un bicchiere di vetro 3 L per eseguire una serie di lavaggi. </li></ol></li><li> SEC lavaggio <ol><li> Posizionare il bicchiere di vetro 3 L contenente SEC in una cappa aspirante. </li><li> Aggiungere (50 ° C) acqua deionizzata 800 ml caldo per le SEC con delicata agitazione per 10 minuti. </li><li> Filtrare la sospensione utilizzando carta da filtro e filtrazione sottovuoto set-up. </li><li> Raccogliere la SEC in un bicchiere di vetro pulito 3 L. </li><li> Ripetere i punti 1.3.1. a 1.3.4. cinque volte. </li><li> Aggiungere 600 ml a caldo (45 ° C) acetone per le SECs con blanda agitazione per 10 min. </li><li> Raccogliere le sec in filtrazione sotto vuoto e trasferire i secondi per un bicchiere di vetro pulito 3 L. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (50 ° C) 2 M di acido cloridrico. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml Hot (50 ° C) 2 M di idrossido di sodio. </li><li> Ripetere i punti 1.3.1 e 1.3.4 otto volte. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. usando 600 ml a caldo (45 ° C) di acetone. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 600 ml a caldo (45 ° C) di etanolo. </li><li> Ripetere i punti 1.3.6. e 1.3.7. utilizzando 800 ml a caldo (50 ° C) acqua deionizzata. </li><li> Trasferire i SEC pulite a sei grandi piatti in vetro di Petri e secco in una cappa aspirante a temperatura ambiente per 24 ore per rimuovere tutti i contenuti di acqua. </li><li> Essiccare le SECs in stufa da vuoto a 60 ° C e 1 mbar vuoto per 10 ore o fino a peso costante. </li><li> Raccogliere la SEC secca e trasferimento in una bottiglia in polipropilene. </li><li> Conservare la SEC in un armadio asciutto. </li></ol></li></ol> 2. Caratterizzazione di SEC <ol><li> Eseguire elettronico a scansione analisi microscopica 41 con spore e SEC prodotte in diverse fasi. </li><li> Effettuare analisi elementare 41 con spore e SEC prodotte in diverse fasi. Dry tutti i campioni a 60 ° C per almeno 1 ora prima analisi elementare e calcolare il contenuto proteico con azoto per cento, con un fattore di moltiplicazione di 6,25. 11 ottenere risultati utilizzando misurazioni triplicato per ogni campione. </li><li> Condurre micromeritica analisi proprietà utilizzando un analizzatore di immagini di particelle dinamica. 41 </li><li> Scansione non trasformati, elaborati e SEC FITC-BSA-caricati usando la microscopia confocale a scansione laser. 41 </li></ol> 3. Biomacromolecule incapsulamento da vuoto Tecnica Caricamento <ol><li> Preparare 1,2 ml di 125 mg / ml soluzione albumina sierica bovina (BSA) usando acqua deionizzata e trasferire in una provetta di polipropilene da 50 ml. </li><li> Pesare 150 mg di SEC e trasferire alla soluzione BSA. </li><li> Agitare la provetta per 10 minuti per formare una soluzione omogenea. </li><li> Coprire il tubo con carta da filtro. </li><li> Trasferire il tubo in un pallone liofilizzatore e asciugare per 4 ore con vuoto a 1 mbar. </li><li> Eseguire i passaggi 3.1a 3,5. per tre lotti indipendenti. </li><li> Raccogliere il SECs BSA-caricati e rimuovere gli agglomerati utilizzando un mortaio e pestello. </li><li> Trasferire i SEC BSA-caricati ad un tubo da 50 ml e aggiungere acqua DI 2 ml per rimuovere il residuo di BSA. </li><li> Raccogliere le SEC per centrifugazione a 4.704 xg per 5 minuti e scartare il surnatante. </li><li> Ripetere il lavaggio con acqua deionizzata una volta. </li><li> Coprire il tubo contenente SEC BSA-caricati con carta da filtro. </li><li> Trasferire i secondi per un congelatore (-20 ° C) e congelare per 1 ora. </li><li> Congelare asciugare la SEC per 24 ore e conservare in un congelatore fino ulteriore caratterizzazione. </li><li> Preparare i SEC placebo senza BSA utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13. </li><li> Preparare i FITC-BSA SEC caricati utilizzando la stessa procedura nei passaggi 3.1. a 3.13. </li></ol> 4. Determinazione del incapsulamento efficienza <ol><li> Pesare 5 mg di BSA SEC-caricati in 2 ml di tubi di polipropilene. </li><li> Aggiungere 1,4 ml phosphaTE soluzione salina tamponata a pH 7,4 (PBS) e vortex per 5 min. </li><li> Probe Sonicare la sospensione a 40% dell&#39;ampiezza per 3 cicli di 10 sec. </li><li> Filtrare la soluzione con un filtro da 0,45 micron Polietersulfone (PES). </li><li> Eseguire la stessa procedura descritta nella passi 4.1. a 4.4. utilizzando SEC placebo. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 280 nm con placebo, come uno spazio vuoto. </li><li> Quantificare la quantità di BSA incapsulato utilizzando una curva standard BSA (200 a 1.000 mg / ml) in PBS. 42 </li></ol>

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<li>Carr, J., Zhang, L., Davis, M., Ravishankar, S., Flieg, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Scale+Controlling+Chemical+Additives+for+Phosphoric+Acid+Production+Plants%5BTitle%5D)+AND+%22Procedia+Engineering%22%5BJournal%5D)">Scale Controlling Chemical Additives for Phosphoric Acid Production Plants.</a> Procedia Engineering. 83, 233-242 (2014).</li>
<li>Mundargi, R. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Eco-friendly+streamlined+process+for+sporopollenin+exine+capsule+extraction%5BTitle%5D)+AND+%22Sci.+Rep%22%5BJournal%5D)">Eco-friendly streamlined process for sporopollenin exine capsule extraction.</a> Sci. Rep. 6, 1-14 (2016).</li>
<li>Smith, B. C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSmith%2C+BC+%22Fundamentals+of+Fourier+transform+infrared+spectroscopy%22">Fundamentals of Fourier transform infrared spectroscopy</a>. , CRC press. 182(2011).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo lavoro, un&#39;analisi sistematica di estrazione SEC da L. spore clavatum viene presentato e questo rapporto mostra che è possibile produrre capsule di qualità superiore ottenendo anche una semplificazione significativa del preesistente protocollo comunemente utilizzato. 11 Contrariamente al protocollo esistente che richiede una temperatura elevata processo (180 ° C) e durata lungo processo (7 giorni), 11 all&#39;ottimizzazione trasformazione di estrazione corrente SEC è...

C&#39;è un notevole interesse in capsule a base di piante naturali ottenuti da spore di piante e pollini per l&#39;uso in applicazioni di microincapsulazione. 1-15 In natura, spore e polline forniscono protezione per i materiali genetici sensibili nei confronti di condizioni ambientali difficili. La struttura di base di spore vegetali e polline tipicamente comprende uno strato esterno shell (esina), uno strato guscio interno (intine), e il materiale citoplasmatico interna. Il exine comprende un biopolimero chimicamente robusta 1,9,10,13,16 denominato sporopollenin e intine è composto principalmente da materiali cellulosici. 16-18 capsule vuote possono essere isolati da vari processi 7,9 per rimuovere il materiale citoplasmatico , proteine, e lo strato intine. 2,12,16 Queste capsule exine sporopollenin (sec) forniscono una valida alternativa per incapsulanti sintetici a causa della loro distribuzione concentrata dimensioni e morfologia uniforme. 7,9,13,19,20 ilsviluppo di processi standardizzati per ottenere secondi da varie specie vegetali, come Lycopodium clavatum, si apre la possibilità di una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione nei campi della somministrazione dei farmaci, alimenti e cosmetici. 6,10-13,21 Per ottenere SECs, ricercatori prima trattati spore e polline con solventi organici e ricadere in soluzioni alcaline per rimuovere contenuti citoplasmatici. 22-25 Tuttavia, la struttura della capsula rimanente è stato determinato per contenere ancora il livello intine cellulosico. Per eliminare questo, i ricercatori hanno esplorato l&#39;uso di prolungato trattamento idrolisi acida con acido cloridrico, acido solforico caldo, o acido fosforico caldo per diversi giorni, 22-25 con acido fosforico diventando il metodo preferito di rimozione intine SEC. 2 Tuttavia, continua ricerca nel corso degli anni ha dimostrato che i vari spore e pollini hanno diversi gradi di resistenza al me elaborazione durathods comunemente usato. 26,27 Alcune spore e pollini sono completamente degradati e perdono tutto integrità strutturale in soluzioni alcaline forti, o diventano pesantemente danneggiato in forti soluzioni acide. 16 La variabilità in risposta SEC a condizioni di trattamento è dovuta a lievi variazioni nella chimica struttura e la morfologia exine del materiale sporopollenin exine tra le specie. 28 a causa della variabilità nella robustezza dei sporopollenin capsule exine (sec), è necessario ottimizzare le condizioni di elaborazione per ogni specie di spore e polline. Spore pianta dal specie L. clavatum sono diventati la fonte singola più studiati della SEC. Si propone che questo è soprattutto a causa della sua ampia disponibilità, a basso costo, monodispersity, e la robustezza chimica 9,29 Le spore possono essere facilmente raccolto e contiene contenuti sporoplasmic sotto forma di raggruppamenti di 1 -. 2 micron organelli cellulari e Biomolecules. 11 L. spore clavatum sono stati utilizzati come lubrificante polvere naturale, 30,31 base per cosmetici, 30 e in erboristeria 32-36 per un&#39;ampia gamma di applicazioni terapeutiche. I SEC ottenuti da L. clavatum hanno dimostrato di essere più resistente al trattamento di secondi da altre specie di spore e polline. 2 Dopo l&#39;elaborazione, i SEC risultanti hanno dimostrato di mantenere le loro strutture microridge intricate e un&#39;elevata uniformità morfologica, fornendo una grande cavità interna per l&#39;incapsulamento. 7 Gli studi indicano che L. SEC clavatum possono essere utilizzati per l&#39;incapsulamento dei farmaci, vaccini, 10,13 11 proteine, 7,14 cellule, 8 oli, 5-7,9 e integratori alimentari. 5,15 osservati efficienza di carico SEC sono relativamente alti in confronto ai tradizionali incapsulamento materiali. 7 Non ci sono anche una serie di vantaggi segnalatiSEC incapsulamento come la capacità di mascherare gusti, 6,10 e per fornire un certo grado di protezione naturale contro l&#39;ossidazione. 12 Negli studi esistenti, il metodo di estrazione più comunemente usato SEC per L. clavatum si basa su quattro fasi principali. Passo è riflusso del solvente in acetone per 12 ore a 50 ° C per sgrassare le spore. 11 Fase due è riflusso alcalina in idrossido di potassio 6% fino a 12 ore a 120 ° C per rimuovere citoplasmatica e materiali proteici. 11 Fase tre è riflusso acido in acido fosforico 85% fino a 7 giorni a 180 ° C per rimuovere il materiale intine cellulosiche. 11 Fase quattro è un processo di lavaggio completo con acqua, solventi, acidi e basi per rimuovere materiale non exine restante e residui chimici. Gli obiettivi principali di estrazione SEC in relazione alle applicazioni di incapsulamento sono per la produzione di capsule che sono vuoti di materiale citoplasmatica, gratis from proteine potenzialmente allergeniche, e morfologicamente intatto. 2,37 Tuttavia, dal punto di vista della produzione industriale, è anche importante considerare fattori economici e ambientali, quali l&#39;efficienza energetica, durata della produzione, la sicurezza, ei residui risultanti. Per quanto riguarda l&#39;efficienza energetica, sia ad alte temperature e tempi di lavorazione lunghi incidono sui costi di produzione e impatto ambientale. la durata della produzione e tempi di risposta sono fattori chiave che influenzano l&#39;elaborazione redditività. Di particolare interesse è che il trattamento acido fosforico alta temperatura aumenta i problemi di sicurezza ed è noto per causare incrostazioni corrosivo che porta a un aumento significativo nella manutenzione delle infrastrutture e ritardi nei tempi di consegna dei lotti. 38-40 Ove possibile, riducendo al minimo il numero di passaggi necessari può portare per ridurre significativamente i rifiuti prodotti. Tuttavia, comunemente utilizzati quattro fasi di L. Estrazione clavatum SEC ha semplicemente evolved da decenni di ricerca e ha avuto poca ottimizzazione del processo vero e proprio. Recentemente, Mundargi et al., 41 ha fatto un significativo contributo ai lavori in corso in questo campo, valutando in modo sistematico e ottimizzando una delle tecniche di estrazione SEC più comunemente riportati. Nella prima sezione di questo studio: spore sgrassamento è dimostrata utilizzando trasformazione acetone a 50 ° C per 6 ore; procedure sporoplasm e rimozione intine siano dimostrate utilizzando 85% trattamento acido fosforico a 70 ° C per 30 h; vasta lavaggio con acqua, solventi, acidi, e la base viene usata per dimostrare la rimozione del contenuto sporoplasmic residui; e SEC asciugatura è dimostrato utilizzando la convezione di essiccazione e il vuoto forno di essiccazione. Nella terza sezione, SEC vuoto carico è dimostrata utilizzando loading vuoto di una proteina modello, albumina di siero bovino (BSA), seguita da BSA-caricata-SEC lavaggio e liofilizzazione. Nella quarta sezione, la determinzione del rendimento incapsulamento BSA è dimostrata utilizzando centrifugazione, sonda sonicazione, e UV / Vis spettrometria.

<table><tbody><tr><td>Lycopodium clavatum spore (tipo s)</td><td>Sigma</td><td>19108-500G-F</td><td></td></tr><tr><td>Albumina sierica bovina</td><td>Sigma</td><td>A2153-50G</td><td></td></tr><tr><td>FITC-coniugato BSA</td><td>Sigma</td><td>A9771-250MG</td><td></td></tr><tr><td>Acido fosforico (85% p/v)</td><td>Sigma</td><td>438081-2.5L</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico</td><td>Sigma</td><td>V800202&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Idrossido di sodio</td><td>Sigma</td><td>S5881-1KG&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Acetone</td><td>Sigma</td><td>V800022</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>AcME&nbsp;</td><td></td><td></td>C000356</tr><tr><td>Acqua deionizzata</td><td>Acqua purificata Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro qualitativa (grado n. 1, cellulosa di cotone)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microsfere di polistirene (50 &plusmn; 1 & micro; m)&nbsp;</td><td>Thermoscientific (CA, USA)</td><td>4250A</td><td></td></tr><tr><td>Vectashield&nbsp;</td><td>Vector labs (CA, USA)</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Sticky-slides, D 263 M Schott vetro, No.1.5H (170 &mu; m, 25 mm x 75 mm) vetrino in vetro non sterile</td><td>Ibidi GmbH (Monaco di Baviera, Germania)</td><td>10812</td><td></td></tr><tr><td>Commercial Lycopodium SECs (tipo L)</td><td>Polysciences, Inc. (PA, USA)</td><td>16867-1</td><td></td></tr><tr><td>Piastre riscaldanti</td><td>IKA, Germania</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscopio elettronico a scansione</td><td>Jeol, Giappone</td><td>&nbsp; Analizzatore elementare JFC-1600</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Elementar, Germania</td><td>VarioEL III</td><td></td></tr><tr><td>FlowCam: Il sistema da banco</td><td>Fluid Imaging Technologies, USA</td><td>FlowCamVS</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio a scansione laser confocale</td><td>Carl Zeiss, Germania</td><td>LSM710</td><td></td></tr><tr><td>Liofilizzatore</td><td>Labconco, USA&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Spettrometro UV</td><td>Boeco, Germania</td><td>S220</td><td></td></tr></tbody></table>

capsule estrazione di plant-based per applicazioni di microincapsulazione

Extraction of Plant-based Capsules for Microencapsulation Applications

Microcapsule derivati ​​da spore o pollini vegetali forniscono una solida piattaforma per una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione. capsule sporopollenin exine (sec) si ottengono quando spore o polline sono trattati in modo da rimuovere il contenuto sporoplasmic interne. Le microcapsule risultanti cave presentano un elevato grado di uniformità micromeritica e conservano intricate caratteristiche microstrutturali relative alle particolari specie vegetali. Qui, dimostriamo un processo semplificato per la produzione di secondi da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi sec. L&#39;attuale procedura di isolamento SEC è stato recentemente ottimizzato per ridurre in modo significativo i requisiti di elaborazione che vengono convenzionalmente utilizzati in isolamento SEC, e per garantire la produzione di microcapsule intatti. L. naturale spore clavatum sono sgrassati con acetone, trattata con acido fosforico, e ampiamente lavati per rimuovere sporoplasmicontenuti c. Dopo l&#39;acetone sgrassante, è stato dimostrato che una singola fase di lavorazione con acido fosforico 85% per rimuovere tutti i contenuti sporoplasmic. Limitando il tempo di elaborazione acido per 30 ore, è possibile isolare SEC pulite ed evitare SEC fratturazione, che ha dimostrato di verificarsi con tempo di lavorazione prolungato. lavaggio abbondante con acqua, acidi diluiti, diluire basi e solventi assicura che tutti i residui di materiale e chimiche sporoplasmic siano adeguatamente rimossi. La tecnica del vuoto di carico è utilizzata per caricare un modello proteine ​​(albumina sierica bovina) come composto idrofilico rappresentativo. Vacuum loading fornisce una tecnica semplice per caricare vari composti senza la necessità di solventi o sostanze chimiche aggressive indesiderabili che sono spesso richiesti in altri protocolli di microincapsulazione. Sulla base di questi protocolli di isolamento e di carico, SEC fornire un materiale promettente per l&#39;uso in una vasta gamma di applicazioni di microincapsulazione, ad esempio, terapie, alimenti, cosmetici, e prod cura personaledotti.

Processo di estrazione semplificata per sporopollenin exine Capsule La L. Estrazione clavatum SEC è stato raggiunto da tre fasi principali: (1) Sgrassante con acetone; (2) acidolisi con acido fosforico 85% (v / v); e (3) Ampia SEC lavaggio con solventi. Il flusso del processo di estrazione SEC aerodinamico è presentato in Figura 1 A -. I Brevemente, il processo comporta una f...

Questo protocollo / manoscritto descrive un processo semplificato per la produzione di capsule exine sporopollenin (sec) da Lycopodium spore clavatum e per il carico di composti idrofili in questi SECs.

Capsule Estrazione di Plant-based per applicazioni di microincapsulazione

Microcapsules derived from plant-based spores or pollen provide a robust platform for a diverse range of microencapsulation applications. Sporopollenin ...

L'obiettivo generale di questo procedimento è stabilire un processo semplificato per l'estrazione di capsule di esine di sporopollenina, o SEC, per applicazioni di microincapsulamento. Questo metodo può fornire rapidamente microcapsule purificate per applicazioni alimentari e nel settore sanitario. Il principale vantaggio di questa tecnica è che il tempo richiesto per l'estrazione delle SEC può essere notevolmente ridotto, producendo SEC pulite e integre.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul processo di estrazione semplificato della SEC e su un'ampia caratterizzazione passo dopo passo, può anche essere utilizzato per esplorare valutazioni fondamentali della microstruttura e della morfologia di diversi biomateriali di origine vegetale. In generale, le persone nuove rispetto a questo metodo incontreranno difficoltà a causa del tradizionale processo di estrazione della durata di 8-10 giorni, che prevede l'uso di acidi altamente corrosivi a temperature elevate. Per iniziare questa procedura, preparare un impianto di riflusso in una cappa aspirante, dotato di un condensatore in vetro, un sistema di circolazione dell'acqua e un bagno termico.Dato che il processo di estrazione con SEC prevede l'uso di acidi altamente corrosivi e solventi organici, esso deve essere eseguito indossando idonei dispositivi di protezione individuale, come occhiali, camice da laboratorio, maschera facciale e guanti, oltre ad avvertire del pericolo. Pesare con attenzione 100 grammi di spore di L clavatum evitando di generare polvere e lontano da qualsiasi fonte di accensione. Successivamente, trasferire lentamente le spore in un pallone rotondo da un litro in PTFE contenente una barretta magnetica per agitazione.Aggiungere 500 millilitri di acetone alle spore e agitare delicatamente il matraccio per formare una sospensione omogenea. Posizionare ora il matraccio in un bagno termostatico impostato a 50 gradi Celsius e collegato al refrigerante a riflusso. Riscaldare la sospensione a riflusso per sei ore con agitazione a 200 giri al minuto.Dopo aver lasciato raffreddare la sospensione a temperatura ambiente, filtrarla utilizzando carta da filtro sotto vuoto e raccogliere le spore disgrassate in grandi piastre di Petri in vetro. Asciugare le spore a temperatura ambiente coprendo le piastre di Petri con fogli di alluminio forato per consentire l'evaporazione del solvente. Dopo aver trasferito le spore disgrassate e asciutte in un matraccio da un litro in PTFE, aggiungere 500 millilitri di soluzione di acido fosforico all'85%.Posizionare il pallone in un bagno d'acqua regolato a 70 gradi Celsius e collegarlo al refrigerante a riflusso. Riscaldare la sospensione a riflusso per 30 ore sotto agitazione. Una volta che la sospensione si è raffreddata a temperatura ambiente, diluire con 500 millilitri di acqua disionizzata calda e raccogliere gli SEC mediante filtrazione a vuoto usando carta da filtro.Successivamente, trasferire le SEC in un becher di vetro da tre litri per eseguire una serie di lavaggi. All'interno della cappa aggiungere 800 millimetri di acqua deionizzata calda alle SEC e mescolare delicatamente per 10 minuti. Quindi, filtrare la sospensione utilizzando carta da filtro sotto vuoto.Trasferire le SEC in un becher di vetro pulito da tre litri. Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti cinque volte, aggiungere 600 millilitri di acetone caldo alle SEC e agitare delicatamente per 10 minuti. Raccogliere le SEC mediante filtrazione sotto vuoto e trasferirle in un becher di vetro pulito da tre litri.Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti con i solventi appropriati, trasferire i SEC puliti in sei grandi capsule di Petri in vetro e farli essiccare in cappa chimica a temperatura ambiente per 24 ore per rimuovere tutta l'acqua. Successivamente, essiccare i SEC in un forno sotto vuoto a 60 gradi Celsius e una pressione di un millibar per 10 ore, oppure fino a peso costante. Quindi, trasferire i SEC essiccati in un contenitore di polipropilene per la conservazione in un armadio asciutto.Preparare 1,2 millilitri di una soluzione di albumina sierica bovina, o BSA, in acqua deionizzata e trasferirla in un tubo in polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere 150 milligrammi di SECs alla soluzione di BSA. Vortexare la miscela per 10 minuti per ottenere una soluzione omogenea.Dopo aver coperto il tubo con carta filtrante, trasferirlo in un flacone per liofilizzatore e asciugare per quattro ore sotto vuoto a un millibar. Una volta che i SEC caricati con BSA sono asciutti, rimuovere gli agglomerati utilizzando mortaio e pestello. A questo punto, trasferire i SEC caricati con BSA in un tubo da 50 millilitri e aggiungere due millilitri di acqua deionizzata per rimuovere la BSA residua.Raccogliere le SEC mediante centrifugazione a 4.704 ×g per cinque minuti. Al termine, scartare il soprannatante. Ripetere il lavaggio con acqua deionizzata.In seguito, coprire il tubo contenente le SEC caricate con BSA con carta filtrante. Successivamente, trasferire le SEC in un congelatore per un'ora. Liofilizzare le SEC per 24 ore.Conservare le SEC nel congelatore fino a ulteriore caratterizzazione. Utilizzare cinque milligrammi delle SEC caricate con BSA in un tubo di polipropilene da due millilitri. Aggiungere 1,4 millilitri di PBS e vortexare per cinque minuti.In seguito, sottoporre la sospensione a sonica con sonda al 40% di ampiezza per tre cicli di dieci secondi ciascuno. Al termine, filtrare la soluzione utilizzando un filtro in polietersolfone da 0,45 micron. Dopo aver eseguito i passaggi precedenti con le SEC del placebo, misurare l'assorbanza delle SEC caricate con BSA a 280 nanometri utilizzando il placebo come bianco.Infine, quantificare la quantità di BSA incapsulata utilizzando una curva standard di BSA in PBS. Le immagini al SEM indicano spore integre con una microstruttura unica e, prima della lavorazione, negli organelli su scala micrometrica del sporoplasma sono stati osservati nell'immagine in sezione trasversale. Con la sgrassatura delle spore e il trattamento alcalino, non sono state osservate variazioni morfologiche e strutturali.Le immagini al SEM dopo acidolisi mostrano SEC integre prive di materiali sporoplasmici. Nessuna rimozione sostanziale di materiale proteico è osservata nelle SEC disgrassate e trattate con alcali mediante analisi CHN. La maggior parte del materiale proteico viene rimossa con l'acidolisi.L'analisi DIPA mostra una distribuzione uniforme delle dimensioni delle SEC dopo l'acidolisi per un periodo fino a 30 ore. L'integrità strutturale delle SEC diminuisce con un'acidolisi prolungata. I dati di SEM e DIPA mostrano che, dopo il passaggio di disgrassaggio, l'acidolisi produce SEC integre con una distribuzione delle dimensioni uniforme.I dati di microscopia confocale a scansione laser indicano che le SEC non trattate mostrano autofluorescenza a causa dei costituenti dello sporoplasma all'interno della cavità dello sporo. Dopo il solo trattamento con acidolisi, tutti i contenuti sporoplasmatici vengono rimossi. Dopo l'incapsulamento di FITC-BSA, si osserva una fluorescenza verde all'interno delle SEC.Le immagini al SEM mostrano micro-creste intatte dopo il caricamento di BSA. Non sono state osservate variazioni sostanziali nel diametro, nella circularità e nel rapporto di aspetto dopo il caricamento di BSA nei SEC. La quantificazione di BSA da SEC incapsulati conferma la coerenza del processo di microincapsulamento, con un caricamento di 0,170 ± 0,01 grammi di BSA per grammo di SEC.Una volta padroneggiato, questo processo semplificato di estrazione SEC può essere completato in 48 ore se eseguito correttamente. Nel tentativo di applicare questa procedura a spore e pollini di diverse piante, è fondamentale ricordare di valutare passo dopo passo l'analisi strutturale, morfologica ed elementare per ottenere capsule intatte e pulite. Dopo aver seguito questa procedura, possono essere eseguiti altri processi di estrazione che coinvolgono enzimi alcalini, al fine di verificare la fattibilità del processo ottimizzato per capsule di origine vegetale diversa.Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microincapsulazione, del rilascio di farmaci e dell'ingegneria tissutale, permettendo di esplorare diverse SEC di origine vegetale come biomateriali di nuova generazione. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come estrarre e caratterizzare le SEC da spore e granuli di polline vegetali, nonché di come effettuare l'incapsulamento di farmaci e biomacromolecole all'interno delle SEC.

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