Capsule Estrazione di Plant-based per applicazioni di microincapsulazione

L'obiettivo generale di questa procedura è stabilire un processo semplificato per estrarre le capsule di sporopollenina esina, o SEC per applicazioni di microincapsulazione. Questo metodo può fornire rapidamente una micro-acquisizione pulita per applicazioni alimentari e sanitarie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tempo del processo di estrazione SEC può essere significativamente ridotto per produrre SEC puliti e intatti.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul processo di estrazione semplificato del SEC e un'ampia caratterizzazione graduale, può anche essere utilizzato per esplorare valutazioni microstrutturali e morfologiche fondamentali di diversi biomateriali a base vegetale. Generalmente le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa del processo di estrazione convenzionale da 8 a 10 giorni, che coinvolge acidi altamente corrosivi a temperature elevate. Per iniziare questa procedura, preparare un impianto di riflusso in una cappa aspirante con condensatore in vetro, un sistema di circolazione dell'acqua e un bagnomaria.

Poiché il processo di estrazione SEC prevede l'uso di acidi altamente corrosivi e solventi organici, il processo deve essere eseguito con dispositivi di protezione individuale adeguati come occhiali, camice da laboratorio, maschera facciale e guanti con notifica di pericolo. Pesare attentamente 100 grammi di spore di L clavatum senza creare polvere e lontano da qualsiasi fonte di accensione. Quindi, trasferire lentamente le spore in un pallone a fondo tondo in PTFE da un litro con un'asta di agitazione magnetica.

Aggiungere 500 millilitri di acetone alle spore e agitare delicatamente il pallone per formare una sospensione omogenea. A questo punto posizionare il pallone in un bagnomaria impostato a 50 gradi Celsius e collegato al condensatore a riflusso. Riscaldare la sospensione a riflusso per sei ore mescolando a 200 giri/min.

Dopo aver lasciato raffreddare la sospensione a temperatura ambiente, filtrarla con carta da filtro sottovuoto e raccogliere le spore sgrassate in grandi piastre di Petri di vetro. Asciugare le spore a temperatura ambiente coprendo le piastre di Petri con un foglio di alluminio con fori per l'evaporazione del solvente. Dopo aver trasferito le spore secche essiccate e sgrassate in un pallone di PTFE da un litro, aggiungere 500 millilitri di soluzione di acido fosforico all'85%.

Posizionare il pallone in un bagnomaria impostato a 70 gradi Celsius e collegarlo al condensatore a riflusso. Riscaldare la sospensione a riflusso per 30 ore mescolando. Una volta che la sospensione si è raffreddata a temperatura ambiente, diluirla con 500 millilitri di acqua calda deionizzata e raccogliere i SEC mediante filtrazione sottovuoto con carta da filtro.

Successivamente trasferite i SEC in un becher di vetro da tre litri per eseguire una serie di lavaggi. Nella cappa aspirante aggiungere 800 millimetri di acqua calda deionizzata ai SEC e mescolare delicatamente per 10 minuti. Quindi, filtrare la sospensione con carta da filtro sotto vuoto.

Trasferisci i SEC in un bicchiere di vetro pulito da tre litri. Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti cinque volte, aggiungere 600 millilitri di acetone caldo ai SEC e mescolare delicatamente per 10 minuti. Raccogli i SEC mediante filtrazione sotto vuoto e trasferiscili in un bicchiere di vetro pulito da tre litri.

Dopo aver ripetuto i passaggi precedenti con i solventi appropriati, trasferire i SEC puliti in sei grandi piastre di Petri di vetro e asciugarli in una cappa aspirante a temperatura ambiente per 24 ore per rimuovere tutta l'acqua. Successivamente, asciugare i SEC in un forno sottovuoto a 60 gradi Celsius e un millibar di vuoto per 10 ore, o fino a peso costante. Quindi, trasferire i SEC essiccati in una bottiglia di polipropilene per la conservazione in un armadio asciutto.

Preparare 1,2 millilitri di una soluzione di albumina sierica bovina, o BSA, in acqua deionizzata e trasferirla in una provetta di polipropilene da 50 millilitri. Aggiungere 150 milligrammi di SEC alla soluzione BSA. Agitare la miscela per 10 minuti fino a formare una soluzione omogenea.

Dopo aver coperto il tubo con carta da filtro, trasferirlo in un pallone liofilizzatore e asciugare per quattro ore con vuoto a un millibar. Una volta che i SEC caricati con BSA sono asciutti, rimuovere gli agglomerati con un mortaio e un pestello. Ora trasferisci i SEC caricati con BSA in una provetta da 50 millilitri e aggiungi due millilitri di acqua deionizzata per rimuovere il BSA residuo.

Raccogli i SEC per centrifugazione a 4,704 per cinque minuti. Al termine, scartare il surnatante. Ripetere il lavaggio con acqua deionizzata.

Successivamente, coprire il tubo contenente i SEC caricati con BSA con carta da filtro. Quindi, trasferisci i SEC in congelatore per un'ora. Liofilizzare i SEC per 24 ore.

Conservare i SEC in congelatore fino a nuova caratterizzazione. Utilizzare cinque milligrammi di SEC caricati con BSA in un tubo di polipropilene da due millilitri. Aggiungere 1,4 millilitri di PBS e vorticare per cinque minuti.

Successivamente, la sonda sonica la sospensione al 40% di ampiezza per tre cicli di dieci secondi. Al termine, filtrare la soluzione utilizzando un filtro in polietersulfone da 0,45 micron. Dopo aver eseguito i passaggi precedenti con i SEC placebo, misurare gli assorbenti dei SEC caricati con BSA a 280 nanometri utilizzando il placebo come bianco.

Infine, quantificare la quantità di BSA incapsulata utilizzando una curva standard BSA in PBS. Le immagini SEM indicano spore intatte con una microstruttura unica e prima dell'elaborazione sono stati osservati organelli sporoplasmatici su scala micron nell'immagine in sezione trasversale. Con lo sgrassaggio delle spore e il trattamento alcalino, non sono stati osservati cambiamenti morfologici e strutturali.

Le immagini SEM dopo l'acidolisi mostrano SEC intatti privi di materiali sporoplasmatici. Non si osserva alcuna rimozione sostanziale di materiale proteico nei SEC sgrassati e trattati con alcali mediante analisi CHN. La maggior parte dei materiali proteici viene rimossa con l'acidolisi.

L'analisi DIPA mostra la distribuzione granulometrica uniforme dei SEC dopo l'acidolisi per un massimo di 30 ore. L'integrità strutturale del SEC diminuisce con l'acidolisi prolungata. I dati SEM e DIPA mostrano che dopo la fase di sgrassaggio, l'acidolisi ha prodotto SEC intatti con una distribuzione dimensionale uniforme.

dati CLSM indicano che i SEC non trattati mostrano autofluorescenza a causa dei costituenti dello sporoplasma all'interno della cavità delle spore. Dopo il solo trattamento dell'acidolisi, tutto il contenuto sporoplasmatico viene rimosso. Dopo l'incapsulamento di FITC-BSA, si osserva una fioritura verde all'interno dei SEC.

Le immagini SEM mostrano micro-creste intatte dopo il caricamento di BSA. Non sono stati osservati cambiamenti sostanziali nel diametro, nella circolarità e nel rapporto d'aspetto dopo il caricamento di BSA nei SEC. La quantificazione di BSA da SEC incapsulati conferma la coerenza del processo di microincapsulazione con 0,170 più o meno 0,01 grammi di carico di BSA per grammo di SEC.

Una volta padroneggiato, questo processo di estrazione SEC semplificato può essere eseguito in 48 ore se eseguito correttamente. Mentre si tenta questa procedura per varie spore e polline delle piante, è importante ricordare la valutazione graduale dell'analisi morfologica strutturale ed elementare per ottenere capsule intatte e pulite. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri processi di estrazione che coinvolgono enzimi alcalini al fine di verificare la fattibilità del processo ottimizzato per diverse capsule a base vegetale.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della microincapsulazione, della somministrazione di farmaci e dell'ingegneria tissutale per esplorare diversi SEC a base vegetale come biomateriali di nuova generazione. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come estrarre e caratterizzare i SEC da spore di piante e granuli di polline, nonché eseguire l'incapsulamento di farmaci e biomacromolecole in SEC.