Name: Un nuovo metodo per lanalisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-25T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 45 s
Description: Scopri l'analisi multi-scala di biofilm batterici su ife fungine utilizzando microscopia confocale ed elettronica. Questo metodo permette di studiare la formazione e la struttura dei biofilm in microbiologia.

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Questo lavoro è stato supportato dall'Agenzia Nazionale Francese per la Ricerca attraverso il Laboratorio di Eccellenza ARBRE (ANR-11-LABX-0002-01), l'Area di Interesse Scientifico delle Interfacce Plant-Microbe nel Programma di Scienze Genomiche e l'Ufficio di Ricerca Biologica e Ambientale nell'Ufficio di Scienza del DOE. L'Oak Ridge National Laboratory è gestito da UT-Battelle, LLC, per il Dipartimento dell'Energia degli Stati Uniti con contratto DE-AC05-00OR22725.

1. Preparazione di batteri e funghi Culture <ol><li> Preparazione delle colture fungine <ol><li> Preparare membrane cellophane con lo stesso diametro dei piatti Petri e bollire in EDTA (1 g / l in acqua deionizzata) per 30 min. Lavare le lenzuola con acqua deionizzata e autoclave per due volte. </li><li> Preparare una fungina pre-cultura inoculando fungina agar spine sul agar adeguato ricoperta da una membrana di cellophane con EDTA pre-trattati. Incubare alla temperatura crescita ottimale per ottenere colonie circa 1 cm di diametro. <ol><li> Per L. bicolor S238N, incubare a 25 ° C per 5 giorni su agar Pachlewski P5, fatti di 0,5 g di diNH4 tartrato, 1 g di KH 2 PO 4, 0,5 g di MgSO 4 .7H 2 O, 5 g di maltosio D + , 20 g di glucosio D +, 1 ml di 10% tiamina-HCl, 1 ml di soluzione diluita 1/10 micronutrienti (6 g / L di solfato ferroso; 0,27 g / L di molibdeno trioxyde; 8.45 g / L acido borico; 5 g / L uomosolfato di manganese; 5 g / L rameico solfato; 2.27 g / L di solfato di zinco) si porta a 1 litro con acqua deionizzata; e 20 g di agar; pH 5.5. </li></ol></li><li> Dal fungina precoltura, inoculare una nuova piastra di agar coperto con l&#39;EDTA pretrattato membrana cellophane contenente un terreno di agar a basse emissioni di promuovere l&#39;espansione radiale delle colonie. <ol><li> Per inoculare la piastra di Petri, graffiare delicatamente la zona esterna (in cui le cellule hanno lo stesso stato fisiologico) di una colonia fungina dal pre-coltura con un bisturi e trasferire le ife alla nuova piastra di agar. </li><li> Incubare a temperatura di crescita ottimale finché le nuove colonie sono circa 1 cm di diametro. Per L. bicolor S238N, incubare a 25 ° C per 5 giorni in media P20 agar (0,25 g di 4 Dinh tartrato; 0,5 g di KH 2 PO 4; 0,25 g di MgSO 4 .7H 2 O, 1 g di Glucosio D + ; 0,5 ml di 10% tiamina-HCl, 0,5 ml di soluzione 1/10 di micronutrienti diluito (cfr 1.1.2.1), costituito da 1 L con acqua deionizzata; e 20 g di agar; pH 5,5). Nota: A causa della precoltura sul cellophane, la seconda coltura non conterrà agar nelle spine centrali. Le spine di agar devono essere rimossi per ulteriori analisi dei biofilm, dal momento che queste spine introducono agar e sostanze nutritive che possono creare distorsioni nell&#39;analisi. Questo passo riguarda solo fungine specie che sono custoditi e propagata su piastre di agar, e non è necessario per i funghi che si propagano da spore o scorte congelate. </li></ol></li></ol></li><li> Preparazione delle colture batteriche <ol><li> Utilizzare un&#39;ansa sterile per raccogliere 2 o 3 singole colonie batteriche da una coltura su terreno agarizzato appropriata e inoculare 25 ml di terreno liquido Luria-Bertani (LB) (o qualsiasi altro mezzo appropriato, a seconda del ceppo utilizzato). Per P. fluorescens BBC6, incubare una cultura durante la notte a 28 ° C con un leggero scuotimento (~ 150 rpm). Nota: Utilizzando un ceppocontrassegnati con proteina fluorescente come GFP, è preferibile, perché questo evita di eseguire una doppia colorazione (funghi e batteri) prima osservazioni microscopiche. I tempi, la velocità di agitazione, e la temperatura di incubazione dipendono dal ceppo utilizzato, con l&#39;obiettivo di ottenere una coltura in crescita tardiva esponenziale. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di N in vitro biofilm di batteri sulla Fungal Colony <ol><li> Centrifugare la coltura batterica a 5.000 xg per 3 min e sospende il pellet in 25 ml di tampone sterile 0,1 M fosfato di potassio (25 g / L KH 2 PO 4 e 2,78 g / LK 2 HPO 4, pH 5.8). Ripetere questo passaggio una volta e regolare la concentrazione batterica finale a 10 9 cellule / ml con lo stesso tampone. </li><li> Riempire una micropiastra da 6 pozzetti con 5 ml della sospensione batterica (o sterile 0,1 M tampone fosfato di potassio per il controllo negativo). </li><li> Tagliare la membrana di cellophane del fungcultura al con una lama di rasoio sterile per ottenere quadrati di cellophane con una singola colonia fungina su ciascuna membrana. Rimuovere con attenzione le piazze di cellophane contenenti ife dal terreno solido con pinze e trasferire il quadrato di cellophane contenente ife di un pozzo della micropiastra contenente la sospensione batterica. </li><li> Agitare delicatamente la micropiastra mentre le colonie fungine sono ancora attaccati al cellophane; quindi, rimuovere la pellicola di cellophane, lasciando le colonie fungine nella piastra. </li><li> Incubare la micropiastra con agitazione (~ 60 rpm) ad una temperatura adatta ai microrganismi studiati. Nota: Il tempo di incubazione dipende dalla velocità di stabilimento del biofilm e la fase da analizzare. Per P. fluorescens BBC6 / L. bicolor, incubare a 20 ° C per 30 minuti per avere biofilm in fase iniziale e fino a 16 ore per ottenere biofilm maturi. </li></ol> 3. confocale analisi al microscopio del formato biofilmione <ol><li> preparazione del campione <ol><li> Per rimuovere batteri planctonici e batteri elettrostaticamente iscritti alla ife, risciacquare il fungo trasferendolo ad un nuovo 6 pozzetti micropiastra riempito con 5 ml di una soluzione concentrata di sale (NaCl, 17 g / L) 17; agitare delicatamente per 1 min. </li><li> Trasferire il fungo in un 6-pozzetti micropiastra contenente 5 ml di tampone fosfato sterile 0,1 M di potassio, agitare delicatamente per 2 minuti, e trasferire il fungo di tampone fosfato di potassio fresco. </li><li> Tagliare la parte della colonia fungina per essere ripreso con un bisturi mantenendolo in tampone fosfato di potassio, in modo tale che la sezione ottenuto contiene circa metà della colonia fungina. </li><li> Per macchiare il campione, trasferirlo un piatto Petri riempita con acqua sterile contenente un colorante fluorescente (in funzione dello scopo dell&#39;analisi), ed incubare al buio. <ol><li> Per visualizzare la rete fungina, utilizzare, per esempio, Rosso Congo (0,1% co finalencentration, 5 min di incubazione), germe di grano agglutin (WGA) lectina coniugata con Alexa Fluor 633 (10 mg / ml concentrazione finale, 10 min di incubazione) o TIM 1 (10 micron concentrazione finale, 10 min di incubazione). </li><li> Se si utilizza un batterio non fluorescente-tag, di contrasto le cellule batteriche con una sonda fluorescente specifica per il DNA tra le numerose tinte di DNA di cellule permeanti disponibili in commercio. Ad esempio, utilizzare DAPI (/ ml concentrazione finale di 0,25 mg, 10 min di incubazione). </li><li> Per visualizzare le proteine della matrice, utilizzare una macchia proteica 21. </li></ol></li><li> Dopo la colorazione, lavare il campione trasferendolo ad un coperchio piatto di Petri contenente 10 ml di sterile fosfato 0,1 M di potassio e agitare delicatamente per 1 min. </li><li> La metà immergere una diapositiva nel coperchio capsula di Petri e delicatamente portare la sezione di taglio galleggiare sopra la diapositiva. Poi, rimuovere lentamente il vetrino dalla soluzione tampone, permettendo il campione di stabilirsi delicatamente sul vetrino. <li> Infine, aggiungere 10 ml di anti-sbiadimento mezzo di montaggio per il campione e coprire con un coprioggetto di vetro. Nota: Una volta che la slitta viene preparato, l&#39;analisi microscopica deve essere eseguita appena possibile (entro al massimo 30 min) per evitare modifiche nella struttura biofilm. </li></ol></li><li> Analisi al microscopio confocale <ol><li> Esaminare i vetrini al microscopio laser confocale con una lente obiettivo 10X o 40X accoppiato al software di imaging. Nota: Qui, un multi-raggio di scansione microscopio confocale dotato di 405, 488 e 561 nm laser di eccitazione, un rivelatore Gaasp PMT, e 10X 0.3 NA e 40X 1.2 obiettivi NA è stato utilizzato. <ol><li> Eseguire immagini utilizzando parametri adeguati al tipo di dati richiesti e ai vincoli di tempo. Utilizzare laser lunghezze d&#39;onda di eccitazione / emissione in base alla macchia utilizzato e recommendati del produttoreons. Utilizzare una combinazione di scansione piastrelle e le funzioni di Z-stack per ottenere una vista globale 3D della colonia fungina e biofilm. Nota: Immagini su Figura 3 sono state acquisite utilizzando i seguenti parametri: 8-bit / pixel, con una media = 2, sosta pixel = 1.58 msec, piastrelle scansione di immagini 5x5 con cuciture online (copertura del 10%, soglia = 0.7); Z-step = 2 micron. </li></ol></li><li> Per la visualizzazione di dati 3D, utilizzare uno dei tanti software gratuiti o commerciali (questi offrono molte opzioni per il rendering 3D). <ol><li> Ad esempio, per visualizzare i dati Z-stack come 2D proiezioni di massima intensità, sottrarre il canale in campo chiaro, regolare la luminosità e il contrasto, e unire i canali per creare un&#39;immagine composita. Se sono presenti, eliminare fette senza segnale alle estremità Z-stack. Quindi, eseguire una proiezione massima intensità 2D e convertire il risultato in colore RGB. Utilizzare la funzione &quot;Progetto Z&quot; nel software ImageJ 22 per ottenere il immagini prisentito qui da 2D proiezioni massima intensità. </li></ol></li></ol></li></ol> 4. Electron Microscopy Analisi <ol><li> Preparare i campioni come descritto per LSCM, tranne che in fase 3.1.2, trasferire i biofilm di acqua sterile invece di tampone fosfato di potassio, dopo le fasi di risciacquo. Questo evita la formazione di cristalli di sale durante la fase di disidratazione, che perturbano immagini SEM. </li><li> Trasferire i biofilm a un porta-campioni e rimuovere l&#39;acqua in eccesso; consentire solo una piccola pellicola di acqua per coprire il campione. </li><li> Trasferire il campione nella camera di un microscopio elettronico a scansione a pressione variabile (VP-SEM); congelare a -50 ° C su un palcoscenico Peltier di raffreddamento; e permettono di liofilizzare lentamente, direttamente nella camera di SEM, con 100 Pa di pressione variabile impostata per 15 ore. </li><li> Dopo il completamento della liofilizzazione, recuperare il campione e trasferirlo in un sistema di deposizione di film alto vuoto. Rivestire il campione con 2 nm di platinatm (misura quarzo) in plasma di argon (2,5 x 10 -2 mbar, 35 mA). </li><li> Osservare il campione rivestito con un SEM attrezzato con una pistola ad emissione di campo (FEG) utilizzando il rilevatore alta risoluzione &quot;in lente&quot; e un&#39;elevata tensione elettronica di 1 kV. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Biofilm batterici vengono recuperati in molti ambienti e sono stati studiati dal 1950, portando allo sviluppo di una serie di metodi per analizzarli 24. I metodi classici per quantificare e biofilm del monitor comprendono saggi di micro-titolazione e, il metodo più diffuso, viola cristallo (CV) colorazione. Questi metodi sono veloci, a basso costo, e maneggevole 25 e sono particolarmente utili per quantificare biomassa totale biofilm o per eseguire saggi di vitalità e matrice di quantificazione. Su un altro lato, metodi &quot;omiche&quot; sono anche utili in studi biofilm, consentendo analisi quantitative e funzionali di biofilm 26, 27. Nonostante i vantaggi della piastra micro-titolazione e &quot;omiche&quot; metodi, diverse caratteristiche essenziali del biofilm non possono essere catturate con queste tecniche, ostacolando una completa comprensione di questo processo. Tali caratteristiche comprendono struttura a matrices, architetture colonia batterica, le interazioni delle cellule / cellulari e modelli di colonizzazione, che sono i dati fondamentali per comprendere sia il funzionamento dei biofilm e le dinamiche della loro formazione. Nonostante la capacità della microscopia a catturare queste caratteristiche, l&#39;analisi al microscopio di biofilm batterici su funghi filamentosi sono ancora scarse. Ciò è dovuto principalmente alla crescita di funghi filamentosi, che spesso forma colonie di spessore, complessi, reti tridimensionali. La formazione di biofilm batterici su funghi è comune in ambienti diversi ed è significativamente coinvolto in vari campi 4 (ad esempio, la medicina, l&#39;agricoltura e l&#39;ambiente.); di conseguenza, è fondamentale per lo sviluppo di nuovi metodi per facilitare la loro indagine. A questo scopo, abbiamo combinato un metodo per generare colonie fungine molto sottili con immagini microscopiche dei biofilm batterici. Inoltre, abbiamo proposto una serie di strumenti per l&#39;analisi di microscopia qualitativamente questi biofilm. Il successo del metodo si basa sula capacità di produrre colonie ifali molto sottili e di applicare le tinture appropriate. Questi punti sono discussi di seguito. A causa delle complesse strutture dei biofilm, la comprensione della loro funzione richiede un approccio multi-scala 28, 29. Modelli di distribuzione dei biofilm, architettura batteriche colonia, e struttura a matrice e la composizione vengono analizzati a diverse scale (cioè, meso-scala e di micro-scala). Inoltre, la risoluzione nanoscala consente l&#39;accesso alle interazioni fisiche cellule / cellulari e nano-struttura della matrice. Così, il metodo sviluppato permette facilmente una analisi multi-scala dei biofilm batterici formate sulla colonia fungina. Nella maggior parte degli studi, LSCM analisi dei biofilm sono limitati al micro-scala, il meso-scala di solito viene eseguita da tomografia a coerenza ottica 30, 31, <supclass = &quot;xref&quot;&gt; 32. Il metodo presentato qui permette sia micro- e meso-scala analisi per LSCM. Ciò dimostra l&#39;utilità di combinare entrambe le analisi nella stessa regione del campione e anche sulla stessa immagine utilizzando microscopi confocali nuova generazione con alta risoluzione (Figura 3). Così, le questioni legate ai dati raccolti raccolti alle diverse scale con metodi diversi sono qui evitate. Questa combinazione di analisi dato accesso concomitanza alla ripartizione biofilm sulla colonia fungina, l&#39;architettura colonia batterica lungo il biofilm sviluppo, e la struttura a matrice. L&#39;analisi meso scala ha mostrato una distribuzione eterogenea dei biofilm batterici sulle colonie fungine (figure 2 e 3). Questa osservazione non sarebbe stato possibile con protocolli che permettono solo l&#39;imaging di una piccola porzione della colonia fungina, che non è necessariamente rappresentativo dell&#39;intera colonia. Così, mentrespesso trascurato, l&#39;analisi meso-scala può dare preziose informazioni su modelli di distribuzione biofilm. Infine, il metodo sviluppato può essere utilizzato per analizzare campioni con diverse tecniche di microscopia, compresa la microscopia elettronica a scansione. Qui, SEM è stato utilizzato per raggiungere la nano-scala e di ottenere l&#39;organizzazione spaziale dei batteri all&#39;interno del biofilm. Si è comportato molto bene con le colonie fungine sottili, mentre SEM permesso solo di immagini di superficie. In contrasto LSCM, SEM, tuttavia, disidratazione campione necessario e, molto spesso, rivestimento con un metallo conduttivo. Questo processo di disidratazione può alterare strutture biologiche quando non è eseguita correttamente, e può richiedere l&#39;ottimizzazione. Qui, la disidratazione campione utilizzando lenta liofilizzazione è stato utilizzato 33. Tuttavia, l&#39;applicazione sia LSCM e SEM ai campioni consentirà le prestazioni della microscopia correlativa nella stessa posizione del campione. Nonostante i vantaggisopra descritto, esistono alcune limitazioni. In primo luogo, potrebbe non essere applicabile a tutti i tipi di funghi. Infatti, questo metodo incubazione viene sviluppato per funghi diffusione radialmente sulla superficie del supporto solido. Questo metodo può non essere adatto per i funghi che formano ife principalmente antenna (ad esempio, Fusarium sp.) O per i funghi micro-aerobico diffusione principalmente all&#39;interno agar. Inoltre, i funghi degradanti cellophane può essere problematico pure (ad es., Trichoderma sp.). In secondo luogo, è importante notare che la strategia di colorazione è un punto critico e la scelta della macchia deve essere fatta con attenzione, come la macchia non deve disturbare il biofilm. Ad esempio, abbiamo notato che Calcofluor bianco causato interruzione biofilm parziale (dati non mostrati), probabilmente a causa del pH elevato di questa macchia. Inoltre, alcuni coloranti prodotti colorazione eterogenea (ad es., Rosso Congo), mentre altri hanno prodotto una colorazione omogenea (ad es., Colorazione parete cellulare con WGA lectina), dando una qualità d&#39;immagine eterogenea.Inoltre, è importante notare che alcuni coloranti potrebbero non essere pienamente specifico. Ad esempio, macchie WGA non solo le pareti cellulari fungine, ma anche acido N-acetilneuraminico nelle pareti cellulari batteriche gram-positivi e adesine prodotte da batteri gram-positivi e quelli negativi durante la formazione di biofilm 34, 35. Pertanto, usando batteri proteine ​​fluorescenti tag e / o si raccomanda funghi per evitare di macchiare multipla. Se si utilizzano più coloranti, non devono interferire chimicamente, e il loro spettri di emissione non devono sovrapporsi. Meso-scala analizza richiedere una grande area di scansione, e quindi, LSCM può richiedere molto tempo (40 min a 1 h, a seconda dello spessore del campione) e bottleneck l&#39;analisi di un gran numero di campioni. Tuttavia, le regolazioni possono essere effettuate a seconda del tipo di dati richiesti. È possibile ridurre il tempo di acquisizione e dimensioni dell&#39;immagine alterare la qualità dell&#39;immagine. Ad esempio, alta risoluzionenon è necessario analizzare la ripartizione generale biofilm. Infine, alcune limitazioni devono essere considerati quando si sceglie di visualizzare i dati di stack Z- come proiezioni 2D o 3D. proiezioni bidimensionali sono un buon modo per riassumere i dati, ma le informazioni di profondità è perso, e le strutture sovrapposte diventano nascosta. D&#39;altro canto, le proiezioni 3D consentono la visualizzazione da diversi punti di vista, ma spesso rendono poco in caso di complessità spaziale. In conclusione, abbiamo riportato un metodo per la caratterizzazione di biofilm batterici sulla ife a livello strutturale. La metodologia può essere estesa ad altre applicazioni. Infatti, questo metodo permette di effettuare caratterizzazione funzionale o chimica di biofilm batterici che formano sulla ife fungine. A causa della grande varietà di sistemi reporter fluorescente esistenti, analisi LSCM può essere utilizzato per diversi scopi 29. Ad esempio, il microfono a fluorescenzaroscopy potrebbe essere usato per monitorare il pH gradiente di 36 o diffusione molecola nel biofilm 37. Inoltre, il metodo consente di analizzare comunità in biofilm multispecie. Ad esempio, ibridazione in situ fluorescente mira gruppi di batteri specifici è particolarmente utile per studiare specifica ripartizione dei batteri nel biofilm multispecie 38, 39. Ultimo numerosi coloranti fluorescenti possono essere utilizzati per caratterizzare la composizione della matrice dei biofilm 21. Qui, le proteine sono stati designati con Sypro, che colora una vasta gamma di proteine, tra cui proteine della matrice (figura 4), ma altri coloranti consentono la visualizzazione di altre importanti costituenti della matrice, come esopolisaccaridi o DNA extracellulare. È interessante notare che tutte queste analisi potrebbero essere eseguite alla meso-scala utilizzando il metodo descritto. Poiché LSCM può essere eseguita su campioni di vita,è anche possibile ottenere immagini time-lapse utilizzando, ad esempio, camere, particolarmente adatto per colonie fungine sottili coverwell. Questa opzione è particolarmente interessante, in quanto la formazione di biofilm è un processo complesso e dinamico. Infine, per uno scopo quantitativa, il metodo riportato può migliorare l&#39;accuratezza dell&#39;analisi quantitativa automatica rendendo possibile questa quantificazione sulle immagini meso-scala. Questo può superare biofilm eterogeneità e questioni statistiche 29.

Funghi e batteri hanno molte opportunità di interagire con l&#39;altro, perché convivono nella maggior parte degli ambienti terrestri. A causa della loro diversità e la loro ubiquità, queste interazioni sono importanti in molti campi biologici, compresa la biotecnologia, agricoltura, industria alimentare, e la medicina 1, 2. Interazioni molecolari richiedono un certo grado di prossimità per consentire scambi tra le parti, e in alcuni casi, una associazione fisica dei partner è necessario per una interazione funzionale 3. Una associazione fisica comune tra batteri e funghi è la formazione di biofilm batterici sulle superfici fungine 4. Questo contatto diretto tra le cellule batteriche e ife fungine permette interazioni intime che sono coinvolti in vari processi biologici. Ad esempio, in medicina, lo studio della formazione di biofilm di Pseudomonas aeruginosa sul opportunistic funghi patogeni Candida albicans potrebbero fornire approfondimenti il legame tra la formazione di biofilm e virulenza 5. In agricoltura, studi suggeriscono che pianta-promotori della crescita rizobatteri e biocontrollo batteri hanno una maggiore efficienza quando associato ad un fungo in un biofilm misto. Ad esempio, elkanii Bradyrhizobium hanno migliorato N 2 attività -fixing quando associata con Pleurotus ostreatus in un biofilm misto 6. Infine, nel biorisanamento, batteri-fungine biofilm misti sono stati utilizzati per la bonifica dei siti inquinati 7, 8. LSCM è particolarmente adatto per studiare biofilm quanto consente un&#39;osservazione tridimensionale di biofilm idratati con pretrattamenti vita minimo, mantenendo così la struttura biofilm e di organizzazione. Così, l&#39;analisi biofilm da LSCM è molto istruttivo, soprattutto per detERMELLINO l&#39;andamento temporale della formazione di biofilm e la rilevazione di stadi caratteristici 9, 10, dalla fase di adesione allo sviluppo di un biofilm maturo. E &#39;inoltre particolarmente adatto per visualizzare la struttura biofilm e la matrice 11, 12 o quantificare la dimensione biofilm 13, 14. Anche se questo metodo è adatto per studiare biofilm su superfici biotici abiotici o sottili, studiando biofilm batterico su una colonia filamentosa fungina è ancora molto impegnativo. In effetti, la maggior parte dei funghi filamentosi costruire spessi, complessi, reti tridimensionali nella cultura. Anche se gli oggetti spessi possono essere esposte al microscopio confocale, l&#39;attenuazione della penetrazione laser e l&#39;emissione di fluorescenza spesso diminuiscono la qualità delle immagini finali su una profondità di 50 micron 15. Inoltre, perché colonie fungine non sono rigidi, it è difficile da gestire i microrganismi senza disturbare i biofilm. A causa dello spessore dei campioni, le poche analisi microscopiche di biofilm batterici su ife fungine sono di solito eseguite solo su una piccola parte della colonia fungina, contenente quindi solo poche ife 16, 17, 18. Tutto questo limita la nostra capacità di descrivere la distribuzione biofilm sulla colonia fungina e quindi può portare distorsioni nell&#39;analisi in caso di distribuzione eterogenea del biofilm all&#39;interno della colonia fungina. Per superare queste difficoltà, riportiamo un metodo per la crescita e l&#39;analisi del biofilm batterico sulle ife fungine. Questo metodo è stato applicato per studiare la formazione di biofilm in Pseudomonas fluorescens BBC6 sul ife del basidiomicete ectomicorrizici Laccaria bicolor S238N. Questi due microrganismi foresta-suolo sono stati precedentemente descritti a forma mistastrutture biofilm-come 19, 20. Questo metodo può essere facilmente ulteriormente adattata ad altri sistemi fungine / batterica filamentosi. Il metodo qui presentato si basa sulla combinazione di un metodo di coltura fungina, permettendo la crescita di colonie fungine molto sottili, con LSCM e immagini SEM. Ciò ha permesso di ottenere micro- (range micron) e meso (range mm) scala vista della interazione tra i due microrganismi, consentendo la caratterizzazione qualitativa del biofilm. Abbiamo anche dimostrato che i campioni possono essere osservati al SEM, permettendo l&#39;analisi strutturale del biofilm a livello di nanoscala (range nm).

<table><tbody><tr><td>Piastre per colture tissutali a 6 pozzetti</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-772-33</td><td>Utilizzato in 2.2 e 3.1</td></tr><tr><td>Congo Red</td><td>Fisher Scientific</td><td>C580-25</td><td>Utilizzato in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>FUN 1 Cell Stain</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F7030</td><td>Utilizzato in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>Agglutinina di germe di grano, Alexa Fluor 633 Coniugato</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>W21404</td><td>Utilizzato in 3.1.4.1</td></tr><tr><td>Soluzione DAPI</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62248</td><td>Utilizzato in 3.1.4.2</td></tr><tr><td>Ioduro di propidio</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>P3566</td><td>Utilizzato in 3.1.4.3</td></tr><tr><td>FilmTracer SYPRO Rubino Biofilm Matrice di proteine Colorazione</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F10318</td><td>Utilizzato in 3.1.4.4</td></tr><tr><td>Fluoromount-G Mezzo di montaggio per vetrini</td><td>Fisher Scientific</td><td>OB100-01</td><td>Utilizzato in 3.1.7</td></tr><tr><td>LSM780 Axio Observer Z1</td><td>Zeiss</td><td></td><td>utilizzato nel software nero 3.2.1</td></tr><tr><td>ZEN 2.1 lite&nbsp;</td><td>Zeiss</td><td></td><td>utilizzato in 3.2.1</td></tr><tr><td>Verniciatore ad alto vuoto Leica EM ACE600</td><td>Leica</td><td></td><td>utilizzato in 4</td></tr><tr><td>GeminiSEM-FEG</td><td>Zeiss</td><td></td><td>utilizzato in 4</td></tr></tbody></table>

un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose fungal colonies utilizzando confocale e microscopia elettronica

A New Method for Qualitative Multi-scale Analysis of Bacterial Biofilms on Filamentous Fungal Colonies Using Confocal and Electron Microscopy

biofilm batterici si formano frequentemente sulle superfici fungine e possono essere coinvolti in numerosi processi di interazione batteri-fungine, come la cooperazione metabolico, la concorrenza o predazione. Lo studio dei biofilm è importante in molti campi biologici, tra cui scienze ambientali, la produzione di cibo e medicine. Tuttavia, pochi studi si sono concentrati su tali biofilm batterici, in parte a causa della difficoltà di indagare. La maggior parte dei metodi di biofilm qualitativa e quantitativa analisi descritti in letteratura sono adatti solo per biofilm formano sulle superfici abiotici o su superfici biotici omogenee e sottili, come un monostrato di cellule epiteliali. Mentre scansione laser confocale (LSCM) è spesso usato per analizzare in situ ed in vivo biofilm, questa tecnologia diventa molto difficile quando applicato a biofilm batterici su ife fungine, a causa dello spessore e le tre dimensioni della propria rete ifaleOrchi. Per ovviare a questo inconveniente, abbiamo sviluppato un protocollo che combina microscopio con un metodo per limitare l&#39;accumulo di strati ifali in colonie fungine. Utilizzando questo metodo, siamo stati in grado di studiare lo sviluppo di biofilm batterici su ife fungine a scale multiple utilizzando sia la microscopia elettronica a scansione e LSCM (SEM). Questo rapporto descrive il protocollo, tra le culture di microrganismi, le condizioni di formazione di biofilm batterici, biofilm colorazione, e LSCM e visualizzazioni SEM.

La procedura schematica complessiva della cultura fungina e preparazione biofilm sono indicati nella figura 1. Il metodo di cultura ha permesso di ottenere colonie fungine da 20 a 50 micron di spessore contenenti alcuni strati di ife, permettendo micro- e meso-scala analisi del biofilm vita idratato utilizzando LSCM. L'applicazione del metodo consentito l'acquisizione di immagini di alta qualità di P. fluorescens biofilm BBC6 su L. bicolor ife lungo la formazione del biofilm (figure 2 - 4). L'analisi meso-scala biofilm dimostrato la distribuzione eterogenea del biofilm di P. fluorescens BBC6 sulla ife di L. bicolor S238N (figure 2 e 3). Analisi meso-scala ha consentito anche per il monitoraggio della formazione di biofilm nel tempo (Figura3) dai primi passaggi, in cui solo alcuni batteri sono stati attaccati ife (figura 3a), per la formazione di uno spesso, biofilm maturo (Figura 3b). L'alta risoluzione delle immagini meso scala permesso di effettuare analisi micro-scala sulle stesse immagini per ottenere le architetture colonia (Figura 3c - d). L'analisi micro-scala combinata con l'etichettatura specifica ci ha permesso di fare un passo ulteriore nella caratterizzazione di biofilm. Qui, SYPRO rubino 23, che etichette maggior parte delle classi di proteine, è stato applicato ai campioni (Figura 4) e mostra la presenza di proteine nella matrice. Infine, ulteriori dettagli della struttura biofilm sono stati ottenuti mediante SEM imaging stesso campione dopo disidratazione e rivestimento (Figura 5). immagini SEM fornitoaccesso al livello di nanoscala, dando così l'accesso alla struttura a matrice. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig1.jpg"> Figura 1: procedura generale schematica della cultura fungina e la preparazione biofilm. Questa figura descrive le principali fasi del metodo, dalle culture di microrganismi di analisi dei campioni. Maggiori dettagli sono riportati nel protocollo. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig2.jpg"> Figura 2: BBC6 biofilm ripartizione sulla colonia fungina. Il campione è stato ripreso dopo 18 ore di interazione a 10X di ingrandimento. L'immagine è stata ottenuta tramite 2D proiezione massima intensità delle immagini microscopia confocale in 3D. La griglia grigio sul figure raffigura le posizioni mosaico. L. bicolor ife sono macchiati con il Congo Red (rosso) e batteri sono GFP-tagged (verde). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig3.jpg"> Figura 3: fasi precoci e tardive di formazione di biofilm BBC6 su L. bicolor ife. Questa immagine è stata ottenuta tramite 2D proiezione massima intensità delle immagini microscopia confocale in 3D. Imaging è stata effettuata a 40X di ingrandimento. (A) biofilm ripartizione dopo 2 ore di interazione. (B) biofilm ripartizione dopo 14 ore di interazione. (C) L'allargamento del rettangolo bianco in (a). (D) L'allargamento del rettangolo bianco in (b). ife fungine sono macchiati con il Congo Red (rosso) e batteri sono GFP-tagged (verde). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54771/54771fig4.jpg"> Figura 4: Matrice colorazione di BBC6 biofilm su L. bicolor ife. (A) biofilm dopo 16 ore di interazione. (B) L'allargamento del rettangolo bianco in (a). Imaging è stata eseguita a 40X di ingrandimento, e queste immagini sono state ottenute tramite 2D proiezione massima intensità delle immagini microscopia confocale in 3D. I batteri sono GFP-tagged (verde), il fungo è macchiato con Fun1 (verde scuro), e le proteine ​​vengono colorate con S. rubino (rosso). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 5: SEM imaging biofilm BBC6 su L. bicolor ife. SEM Imaging è stata effettuata a 2360X, EHT: 1 kV. Prima di imaging, il campione è stato lentamente liofilizzato nella camera SEM e rivestito con platino. Le frecce verdi indicano biofilm batterici e frecce gialle indicano ife fungine. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54771/54771fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Questo protocollo descrive un nuovo metodo per crescere e qualitativamente analizzare biofilm batterici su ife fungine mediante microscopia confocale ed elettronica.

Un nuovo metodo per l&#39;analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

Bacterial biofilms frequently form on fungal surfaces and can be involved in numerous bacterial-fungal interaction processes, such as metabolic ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è utilizzare la microscopia per analizzare la formazione di biofilm batterici su ifi filamentosi. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della microbiologia, come ad esempio come si formano i biofilm batterici sugli ifi, quanto sono specifici e di cosa sono composti. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente l'analisi della formazione di biofilm batterici sugli ifi fungini su diverse scale, che vanno dal livello di nanometro a quello di centimetro.La procedura sarà dimostrata da Cora Miquel Guennoc del mio laboratorio e da Christophe Rose, l'ingegnere di microscopia elettronica della piattaforma INRA PTEF. Per iniziare, preparare membrane di cellophane con lo stesso diametro delle piastre di Petri, quindi immergerle in EDTA bollente per 30 minuti. Successivamente, risciacquare le membrane con acqua deionizzata e sterilizzarle due volte in autoclave.Per preparare colture precoci fungine, inoculare il fungo su un mezzo solido in agar, coperto con una membrana di cellophane pretrattata con EDTA. Incubare le colture alla temperatura ottimale per ottenere colonie di circa un centimetro di diametro. A partire dalla precultura, inoculare una piastra di Petri contenente un mezzo agar idoneo, coperto con la membrana di cellophane trattata con EDTA, utilizzando un bisturi per graffiare delicatamente la zona esterna di una colonia della precultura e quindi trasferire le ife sulla piastra in agar.Incubare le piastre alla temperatura ottimale fino a quando le colonie raggiungono un diametro di circa un centimetro. Per preparare colture batteriche come P.fluorescens BBc6, utilizzare un’ansa sterile per raccogliere due o tre colonie batteriche singole dal mezzo solido al agar, e inoculare 25 millilitri di LB. Incubare la coltura alla temperatura ottimale per tutta la notte. Dopo aver coltivato i batteri per tutta la notte, centrifugare la coltura a 5.000 × g per tre minuti.Quindi sospendere il pellet in 25 millilitri di tampone sterile di fosfato di potassio 0,1 molare. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, utilizzare lo stesso tampone per aggiustare la concentrazione batterica finale a 10 alla nona cellule per millilitro. Riempire una micropiastra a sei pozzetti con cinque millilitri della sospensione batterica.Utilizzare una lametta sterile per tagliare la membrana di cellophane della coltura fungina in quadrati, con una singola colonia su ciascuna membrana. Successivamente, con una pinzetta, rimuovere con cura i quadrati di cellophane contenenti ife dal mezzo solido e trasferirli in pozzetti individuali della sospensione batterica. Agitare delicatamente la piastra a microtitolazione fino a quando le colonie fungine si staccano dal cellophane.Rimuovere quindi i fogli di carta oleata, lasciando le colonie fungine nella piastra. Incubare la micropiastra con agitazione delicata a 20 gradi Celsius per un tempo variabile a seconda dei ceppi utilizzati e dello stadio da analizzare. Per P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor, incubare le colture per 30 minuti per ottenere biofilm in fase iniziale e fino a 16 ore per biofilm maturi.Per rimuovere i batteri planctonici e quelli legati elettrostaticamente alle ife, risciacquare il fungo trasferendolo in una nuova piastra a sei pozzetti riempita con soluzione salina concentrata. Agitare delicatamente la piastra per un minuto. Trasferire il fungo in una nuova piastra a sei pozzetti contenente cinque millilitri di tampone sterile di fosfato di potassio 0,1 molare.Agitare delicatamente la piastra per due minuti, quindi trasferire il fungo in un nuovo tampone. Mantenendo la colonia fungina nel tampone, utilizzare un bisturi per tagliare la colonia in due parti circa uguali. Trasferire metà della colonia da colorare in una piastra di Petri contenente un millilitro di acqua sterile, integrata con un colorante fluorescente appropriato per visualizzare la rete fungina, come la lectina del germe di grano coniugata con Alexa Fluor 633.Quindi incubare il campione al buio. Dopo la colorazione, risciacquare il campione trasferendolo su un coperchio di una piastra di Petri contenente 10 millilitri di tampone sterile di fosfato di potassio 0,1 molare, e agitare delicatamente per un minuto. Immergere parzialmente un vetrino nel coperchio della piastra di Petri e posizionare con delicatezza la sezione tagliata in modo che galleggi sopra il vetrino.Quindi sollevare lentamente il vetrino dalla soluzione tampone, permettendo al campione di depositarsi delicatamente sul vetrino. L'aspetto più delicato è il posizionamento del campione sul vetrino. Per evitare alterazioni del biofilm, il campione e il vetrino devono essere immersi durante il posizionamento del campione, e il campione non deve essere spostato ulteriormente prima dell'acquisizione delle immagini.Infine, aggiungere 10 microlitri di mezzo di montaggio antiossidante al campione e coprirlo con un coprioggetto di vetro. Esaminare i vetrini al microscopio laser confocale con un obiettivo da 10x o 40x. Utilizzare una combinazione delle funzioni di scansione a tasselli (tile scan) e di stack in Z per ottenere viste globali tridimensionali della colonia fungina e dei biofilm.Per eseguire la microscopia elettronica, dopo aver sciacquato il fungo in una soluzione salina concentrata come in precedenza, trasferire il fungo in acqua sterile anziché in tampone per evitare la formazione di cristalli di sale durante il passaggio di disidratazione. Trasferire i biofilm in un portacampioni ed eliminare l'acqua in eccesso. Successivamente, trasferire i campioni nella camera di un microscopio elettronico a scansione a pressione variabile.Su un piatto refrigerante Peltier, congelare il campione a meno 50 gradi Celsius, permettendogli di liofilizzarsi lentamente direttamente nella camera del microscopio elettronico a scansione (SEM), con una pressione variabile impostata a 100 Pascal per 15 ore. Recuperare il campione e trasferirlo in un sistema ad alto vuoto per la deposizione di film sottili. Quindi ricoprire il campione con due nanometri di platino sotto plasma di argon.Osservare il campione rivestito con un microscopio elettronico a scansione, dotato di pistola a emissione di campo e di un rilevatore in-lens ad alta risoluzione, con una tensione elettronica elevata di un chilovolt. Questa analisi su scala mesoscopica dei biofilm mostra la distribuzione eterogenea del biofilm di P.fluorescens BBc6 in verde sugli ife di L.bicolor S238N, mostrati in rosso. L'analisi ha inoltre permesso di seguire nel tempo la formazione del biofilm, dalle prime fasi in cui solo alcuni batteri marcati con GFP erano aderenti agli ife, mostrati in rosso, fino alla formazione di un biofilm spesso e maturo.Come mostrato qui, le immagini meso-scopiche ad alta risoluzione sono state utilizzate anche per eseguire analisi micro-scopiche, al fine di ottenere le architetture delle colonie. Inoltre, in questa proiezione 2D ad intensità massima di un'immagine confocale 3D, una marcatura specifica con SYPRO Ruby, mostrata in rosso, indica la presenza di proteine nella matrice, con batteri BBc6 marcati con GFP e fungo marcato con FUN-1 in verde scuro. Dopo la disidratazione e la codifica dello stesso campione, ulteriori dettagli della struttura del biofilm sono stati ottenuti mediante imaging al microscopio elettronico a scansione (SEM).Le frecce verdi indicano le cellule batteriche nel biofilm, mentre le frecce gialle indicano le ife fungine. Una volta acquisita padronanza, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore e mezza per un campione, escluso il tempo di incubazione necessario per la formazione del biofilm e la coltura dei microrganismi. Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante ricordare che il successo del metodo dipende fortemente dalla capacità di ottenere colonie fungine molto sottili, costituite da soli pochi strati di ife.Seguendo questa procedura, altri metodi, come la mutagenesi o l'ibridazione in situ, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, ad esempio sulla caratterizzazione funzionale o chimica del biofilm, oppure per studiare biofilm a più specie. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricercatori di diversi settori, come la medicina, le scienze ambientali, l'industria alimentare e altri, per esplorare la formazione di biofilm durante le interazioni fungo-batteriche. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come coltivare e analizzare la formazione di biofilm batterici sugli ife fungini.

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