Un nuovo metodo per l'analisi qualitativa multi-scala batterica biofilm su filamentose Fungal Colonies Utilizzando confocale e microscopia elettronica

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di utilizzare la microscopia per analizzare la formazione di biofilm batterici su ife filamentose. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della microbiologia, come ad esempio come si forma il biofilm batterico sulle ife, quanto sono specifiche e di cosa sono fatte. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente lo studio della formazione di biofilm batterici su ife fungine su scale multiple, da quelle nanometriche a quelle centimetriche.

La dimostrazione della procedura sarà effettuata da Cora Miquel Guennoc del mio laboratorio e Christophe Rose, l'ingegnere di microscopia elettronica della piattaforma INRA PTEF. Per iniziare, preparare delle membrane di cellophane dello stesso diametro delle piastre di Petri, quindi immergerle nell'EDTA bollente per 30 minuti. Quindi utilizzare acqua deionizzata per sciacquare le sfoglie e sterilizzarle in autoclave due volte.

Per preparare le precolture fungine, inoculare il fungo su terreno di agar, coperto con una membrana di cellophane pretrattata con EDTA. Incubare le colture a temperatura ottimale per ottenere colonie di circa un centimetro di diametro. Dalla pre-coltura, inoculare una capsula di Petri di terreno di agar appropriato, ricoperta con la membrana di cellophane EDTA, utilizzando un bisturi per grattare delicatamente l'area esterna di una colonia di pre-coltura, quindi trasferendo le ife sulla piastra di agar.

Incubare le piastre a temperatura ottimale fino a quando le colonie hanno un diametro di circa un centimetro. Per preparare colture batteriche come P.fluorescens BBc6, utilizzare un ansa sterile per raccogliere due o tre singole colonie batteriche dal terreno di agar e inoculare 25 millilitri di LB. Incubare la coltura a temperatura ottimale durante la notte. Dopo aver fatto crescere i batteri durante la notte, centrifugare la coltura a 5.000 volte g per tre minuti.

E poi sospendere il pellet in 25 millilitri di tampone sterile 0,1 molare di fosfato di potassio. Dopo aver ripetuto la centrifugazione, utilizzare lo stesso tampone per regolare la concentrazione batterica finale da 10 a none cellule per millilitro. Riempire una micropiastra a sei pozzetti con cinque millilitri di sospensione batterica.

Utilizzare una lama di rasoio sterile per tagliare la membrana di cellophane della coltura fungina in quadrati, con una singola colonia su ciascuna membrana. Quindi, con una pinza, rimuovere con cura i quadrati di cellophane contenenti ife dal mezzo solido e trasferirli nei singoli pozzetti della sospensione batterica. Agitare delicatamente la micropiastra fino a quando le colonie fungine non si staccano dal cellophane.

Quindi rimuovere i fogli di cellophane, lasciando le colonie fungine nel piatto. Incubare la micropiastra con leggera agitazione a 20 gradi Celsius per un tempo che dipende dai ceppi utilizzati e dallo stadio da analizzare. Per P.fluorescens BBc6 RA L.bicolor, incubare le colture per 30 minuti per ottenere biofilm in fase iniziale e fino a 16 ore per biofilm maturi.

Per rimuovere i batteri planctonici e i batteri attaccati elettrostaticamente alle ife, sciacquare il fungo trasferendolo in una nuova micropiastra a sei pozzetti riempita con una soluzione salina forte. Agitare delicatamente la piastra per un minuto. Trasferire il fungo in una nuova micropiastra a sei pozzetti contenente cinque millilitri di tampone sterile 0,1 molare di fosfato di potassio.

Agitare delicatamente la piastra per due minuti, quindi trasferire il fungo in un tampone fresco. Mantenendo la colonia fungina in buffer, usa un bisturi per tagliare la colonia approssimativamente a metà. Trasferire metà della colonia da colorare in una capsula di Petri contenente un millilitro di acqua sterile, integrata con un colorante fluorescente appropriato per visualizzare la rete fungina, come l'agglutinina di germe di grano coniugata ad Alexa Fluor 633.

Quindi incubare il campione al buio. Dopo la colorazione, sciacquare il campione trasferendolo in un coperchio di Petri contenente 10 millilitri di tampone sterile 0,1 molare di fosfato di potassio e agitare delicatamente per un minuto. Immergere a metà un vetrino nel coperchio della capsula di Petri e posizionare delicatamente la sezione tagliata in modo che galleggi sopra il vetrino.

Quindi sollevare lentamente il vetrino dalla soluzione tampone, consentendo al campione di depositarsi delicatamente sul vetrino. L'aspetto più delicato è il posizionamento del campione sul vetrino. Per evitare la descrizione del biofilm, il campione e il vetrino devono essere immersi durante il posizionamento del campione e il campione non deve essere più spostato prima dell'imaging.

Infine, aggiungere 10 microlitri di terreno di montaggio anti-sbiadimento al campione e coprirlo con un vetrino coprivetro. Esaminare i vetrini con un microscopio laser confocale con un obiettivo 10x o 40x. Utilizza una combinazione di scansione delle tessere e le funzioni Z-stack per ottenere viste 3D globali della colonia fungina e dei biofilm.

Per eseguire la microscopia elettronica, dopo aver sciacquato il fungo in una soluzione salina forte come prima, trasferire il fungo in acqua sterile anziché tampone per prevenire la formazione di cristalli di sale durante la fase di disidratazione. Trasferire i biofilm in un portacampioni e rimuovere l'acqua in eccesso. Quindi, trasferire i campioni nella camera di un microscopio elettronico a scansione a pressione variabile.

Su una fase di raffreddamento Peltier, congelare il campione a una temperatura negativa di 50 gradi Celsius, lasciandolo liofilizzare lentamente direttamente nella camera SEM, con 100 Pascal di pressione variabile impostata per 15 ore. Recuperare il campione e trasferirlo in un sistema di deposizione di film ad alto vuoto. Quindi rivestire il campione con due nanometri di platino sotto plasma di argon.

Osservare il campione rivestito con un microscopio elettronico a scansione, con una pistola a emissione di campo che utilizza il rivelatore ad alta risoluzione nella lente e un'alta tensione elettronica di un kilovolt. Questa analisi su mesoscala dei biofilm dimostra la distribuzione eterogenica del biofilm di P.fluorescens BBc6 in verde sulle ife di L.bicolor S238N, mostrate in rosso. L'analisi ha anche reso possibile il monitoraggio della formazione del biofilm nel tempo, dalle prime fasi in cui solo alcuni batteri marcati con GFP erano attaccati alle ife, mostrate in rosso, alla formazione di un biofilm spesso e maturo.

Come mostrato qui, le immagini a meso-scala ad alta risoluzione sono state utilizzate anche per effettuare analisi su micro-scala, per ottenere architetture di colonie. Inoltre, in questa proiezione 2D ad alta risoluzione di massima intensità di un'immagine confocale 3D, la marcatura specifica con SYPRO Ruby, mostrata in rosso, indica la presenza di proteine nella matrice, con batteri BBc6 marcati con GFP e funghi marcati con FUN-1 in verde scuro. Dopo la disidratazione e la codifica dello stesso campione, ulteriori dettagli sulla struttura del biofilm sono stati ottenuti mediante imaging SEM.

Le punte di freccia verdi puntano alle cellule batteriche nel biofilm e le punte di freccia gialle puntano alle ife fungine. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa due ore e mezza per un campione, senza contare il tempo di incubazione per la formazione del biofilm e la coltura di microrganismi. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che il successo del metodo dipende fortemente dalla capacità di ottenere colonie fungine molto sottili, costituite solo da pochi strati di ife.

Seguendo questa procedura, altri metodi, come la mutagenesi o l'ibridazione in situ, possono essere utilizzati per rispondere a ulteriori domande, come la caratterizzazione funzionale o chimica del biofilm, o per studiare biofilm multispecie. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricercatori provenienti da diversi campi come la medicina, le scienze ambientali, l'industria alimentare e così via, per esplorare la formazione di biofilm durante le interazioni batteriche fungine. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come coltivare e analizzare la formazione di biofilm batterici sulle ife fungine.