Name: Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-02T11:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 7 s
Description: Scopri la mappatura ottica ad alta risoluzione del nodo seno-atriale del mouse con cuore perfuso Langendorff. Questo metodo permette di studiare anomalie del pacemaker e aritmie atriali con precisione spaziale e temporale.

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Tutti gli esperimenti sono stati condotti in conformità con il National Institutes of Health Guide per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (NIH Pub. No. 80-23). Tutti i metodi e protocolli utilizzati in questi studi sono stati approvati da The University of Wisconsin cura degli animali e Usa Comitato protocollo seguendo le Linee guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio pubblicati da NIH (pubblicazione n ° 85-23, revisionato 1996). Tutti gli animali utilizzati in questo studio hanno ricevuto la cura umana nel rispetto della Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio. 1. Rimozione Cuore e Langendorff perfusione <ol><li> Prima di isolamento cuore, soluzione Tyrode riscaldare a 37 ° C utilizzando un bagno di acqua e una camicia d&#39;acqua. </li><li> Anestetizzare il mouse con il 5% isoflurano / 95% O 2. </li><li> Garantire un livello adeguato di anestesia controllando la perdita del dolore riflesso. </li><li> Eseguire la toracotomia. Aprite la cassa, utilizzando curve 5.5 &quot;forbici Mayo e 5.5&quot; Kelly emostatico perceps Per fare un 1 cm tagliato sulla parte anteriore del torace. <ol><li> estrarre rapidamente il cuore dal petto (entro 30 secondi). Utilizzare 4 &quot;pinze curve Iris per afferrare il tessuto polmonare e tagliare il polmone, il timo e il cuore insieme con il pericardio con 4.3&quot; forbici Iris. Non afferrare direttamente il cuore. </li><li> Lavare in ossigenata (95% O 2/5% di CO 2), a temperatura costante (36.8 ± 0.4 ° C) ha modificato la soluzione di Tyrode. Utilizzare la seguente composizione della soluzione (in mM): NaCl 128,2, 4,7 KCl, 1,19 NaH 2 PO 4, 1.05 MgCl 2, 1.3 CaCl 2, 20.0 NaHCO 3, e 11,1 glucosio (pH 7,35 ± 0,05). </li></ol></li><li> Mentre immersa nella stessa soluzione, identificare il polmone, timo e tessuto adiposo. li sezionare con cura dal cuore. Utilizzare curvo 3 &quot;forbici Vannas-Tubinga e 4.3&quot; # 5 pinze. </li><li> Quindi individuare l&#39;aorta e cannulate è su una cannula 21 G su misura. Utilizzare due curve 4.3 &quot;forza # 5Bps. </li><li> Dopo incannulazione, contemporaneamente defluire in (attraverso la cannula ad una portata di ~ 5 ml / min; questo dovrebbe essere regolata in base alla pressione aortica, vedi sotto) e superfuse (nel bagno ad una portata di ~ 50 ml / min) cuore con soluzione Tyrode riscaldato e filtrata durante l&#39;intero esperimento. Far passare la soluzione di perfusione attraverso un filtro di nylon 11 micron di linea per evitare l&#39;intasamento della circolazione coronarica. </li><li> Utilizzando un trasduttore di pressione (o un manometro) collegato attraverso un rubinetto a 3 vie Luer serratura alla linea di perfusione, monitorare la pressione aortica e mantenerlo tra 60 e 80 mmHg. Regolare la velocità di perfusione se necessario per mantenere la pressione aortica all&#39;interno di questa gamma. </li></ol> 2. mappatura ottica del SAN dalla Langendorff-perfuso cuore intero <ol><li> Strumentazione <ol><li> Posizionare cuore orizzontalmente e il pin del ventricolo al fondo siliconato della camera usando 0,1 mm perni diametro prevent flusso indotta movimento durante l&#39;esperimento. 12 </li><li> Inserire un piccolo ( &quot;ID x .005&quot; .012) tubo di silicone nel ventricolo sinistro (LV) attraverso la vena polmonare, gli atri sinistro (LA) e la valvola mitrale (MV). Fissare il tubo con una sutura di seta (4-0) al tessuto connettivo suono. </li><li> Posizionare il cuore con il lato posteriore rivolto verso l&#39;alto (figura 1A, pannello di sinistra). </li><li> Pin il bordo dell&#39;appendice RA (RAA) al fondo di silicio della camera con diametro 0,1 mm perni minutien. Regolare il livello al fine di rendere la superficie posteriore del RA piatta e permettono di essere situato piano focale della fotocamera. Ciò consentirà misure ottiche della superficie massima dell&#39;atrio. </li><li> Noose superiore (SVC) ed inferiore (IVC) vena cava da una sutura di seta (4-0), allungare e pin l&#39;altra estremità della sutura al fondo di una camera siliconato (Figura 3A). Assicurarsi che i punti di sutura non bloccano lacampo di vista ottico. </li><li> Posizionare l&#39;elettrodo di stimolazione misura sul bordo del RAA. Per elettrodi, uso di silicio rivestito fili diametro argento di 0,25 mm, con 0,5 mm di distanza inter-elettrodo e privo di silicone per una lunghezza di 1 mm al fine di stimolazione. Poi posto due ECG 12 millimetri ago (29-gauge) elettrodi monopolari vicino alla base del ventricolo destro e sinistro. Posizionare l&#39;elettrodo ECG terra vicino all&#39;apice dei ventricoli. </li></ol></li><li> colorazione <ol><li> Poiché entrambi i coloranti fluorescenti e disaccoppiatore blebbistatin elettromeccanico sono sensibile alla luce, eseguire tutte le procedure descritte qui di seguito in una stanza buia. Prima preparare dye voltage-sensitive RH-237 o di-4-ANNEPS come una soluzione madre, 1,25 mg / ml in dimetilsolfossido (2,5 mM), un&#39;aliquota esso (30 ml ciascuna) e conservare le aliquote a -20 ° C. </li><li> Diluire 5-10 ml di soluzione colorante magazzino in 1 ml di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode e poi iniettare nella linea di perfusione coronaricaper un periodo di 5-7 minuti usando una porta di iniezione in linea Luer. </li><li> Preparare blebbistatin come una soluzione madre (2 mg / ml in dimetilsolfossido, 6,8 mM) in anticipo e conservarlo a 4 ° C. </li><li> Dopo 20 min di stabilizzazione aggiungere 0,5 ml di riscaldato (37 ° C) blebbistatin nel perfusato e diluire 0,1 ml di blebbistatin in 1 ml di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode. Poi iniettare nella linea di perfusione coronarica in un periodo di 5-7 minuti usando una porta di iniezione in linea Luer. </li></ol></li></ol> 3. mappatura ottica del SAN dalla isolata atriale Preparazione <ol><li> Strumentazione <ol><li> Per la preparazione atriale isolata, isolare e cannulate cuore come descritto nei passaggi 1,1-1,5 per la preparazione intero cuore. </li><li> Sezionare i ventricoli lontano dal lato anteriore. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare 1 ° posto per i dettagli. </li><li> Aprire il RA, tagliando attraverso la va tricuspidelve (TV) lungo l&#39;asse TV SVC. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare # 2 per i dettagli. </li><li> Tagliare l&#39;arto mediale del crista terminalis per aprire il RAA. Vedere la figura 1A, pannello di destra, tagliare 3 #. </li><li> Aprire la parete libera atriale anteriore eseguendo un taglio dalla linea mediana del precedente taglio # 3 al bordo del basso a destra del RAA, appiattire e pin parete libera atriale al fondo di una camera di silicio rivestito. Vedere la direzione indicata dalla freccia bianca in figura 1A, tagliare 4 #. Conserva un bordo di tessuto ventricolare di spinatura la preparazione per evitare danni al atri. </li><li> Allo stesso modo, aperto LA tagliando attraverso la MV lungo l&#39;angolo MV-superiore del appendice LA (LAA). </li><li> Per aprire la LAA, tagliare a partire dalla metà del LAA aperto, attraverso la parete libera atriale anteriore fino in prossimità di un bordo mezzo della LAA. </li><li> Aprire il atriale alo parete libera anterioreng stessa direzione, quindi appiattire e il pin per il fondo di una camera Sylgard rivestite. </li><li> Parzialmente rimuovere il tessuto del setto interatriale. Questo riduce la dispersione del segnale ottico da tessuto che non è a fuoco. Pertanto, sia il LA e RA, nonche la SAN e giunzione atrio-ventricolare (AVJ) sono accessibili in questa preparazione (Figura 1B). </li><li> Sollevare la preparazione finale di circa 0,5 mm dal fondo della camera siliconato per permettere superfusione da entrambe le superfici epicardici ed endocardici. </li><li> Superfuse preparato con riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode ad una velocità costante di ~ 12 ml / min per un flusso mirato situato vicino alla SVC e ~ 30 ml / min per un superfusione vasca. </li><li> Posizionare il Ag / AgCl 2 elettrodi di stimolazione su misura (0,25 mm di diametro) sul bordo del RAA sezionato. Poi posto due ECG 12 millimetri ago (29G) elettrodi (monopolare) vicino al RAA e LAA, rispettivamente. Posizionare il terreno ECG elettiha guidato vicino al AVJ. </li></ol></li><li> colorazione <ol><li> Eseguire una diretta applicazione del colorante di tensione-sensibili (RH-237 o di-4-ANNEPS). Per questo, diluire 1-2 microlitri della soluzione di colorante in magazzino 1 mm di riscaldato (37 ° C) Soluzione Tyrode e rilasciare lentamente il colorante diluito sulla superficie del preparato utilizzando una pipetta 1 mm. </li><li> In alternativa, eseguire la colorazione atriale con il colorante tensione sensibile attraverso una perfusione coronarica del cuore Langendorff-perfuso simile a quello sopra descritto per la preparazione intero cuore (gradini 2.2.1-2.2.2). <ol><li> Dopo la colorazione perfusione coronarica, isolare la preparazione atriale come descritto. Eseguire ulteriore colorazione della superficie in caso di necessità di raggiungere un livello di fluorescenza soddisfacente. isolamento atriale rapida non candeggiare il colorante e non influenza la qualità della colorazione. </li></ol></li><li> Immobilizzare la preparazione con l&#39;elettro-meccanico di sganciamento, blebbistatin. Diluire 3-5 ml blebbistatin soluzione madre nella (37 ° C) Soluzione Tyrode riscaldato e rilasciare lentamente il blebbistatin diluito sulla superficie della preparazione e della soluzione circostante. Poiché blebbistatin ha dimostrato di essere sensibile alla luce, 13,14 evitare lunga esposizione alla luce durante la preparazione e la colorazione. </li><li> Eseguire applicazioni aggiuntive blebbistatin quanto necessario per sopprimere la contrazione. Normalmente fino a 3 applicazioni aggiuntive (3-5 microlitri per ogni applicazione) possono essere utilizzati per sopprimere l&#39;artefatto di movimento sufficiente per ricostruire con precisione SAN e l&#39;attivazione atriale. </li><li> Aggiungere aggiungono 0,5 ml di blebbistatin riscaldato in perfusato. Durante questa procedura, mettere in pausa il superfusione per 30 secondi per permettere il colorante / blebbistatin per macchiare il tessuto atriale. </li></ol></li></ol> 4. mappatura ottica Set Up NOTA:. Una descrizione dettagliata del sistema di mappatura ottica è fornito altrove 12 <ol><li> Utilizzare una fotocamera con un TEMrisoluzione porale di 2.000 fotogrammi / sec o superiore, e una serie di lenti condensatrici raggiungere risoluzione spaziale di 100 pm / pixel o superiore. Questo è necessario per ricostruire attivazione SAN e propagazione intranodale. </li><li> Per ridurre il moto manufatto dalla soluzione vibrante, fissare un piccolo vetro di copertura sulla superficie della soluzione sulla preparazione atriale cuore / isolato. </li><li> Utilizzare luce di eccitazione (520 ± 45 nm) fornita da una corrente costante, lampada alogena a basso rumore. Dirigere il fascio di luce filtrata sulla preparazione utilizzando una guida di luce biforcato flessibile. </li><li> Filtrare la fluorescenza emessa da un filtro passa lungo (&gt; 715 nm). Raccogliere, digitalizzare e salvare il segnale fluorescente acquisito su un computer utilizzando il software fornito dal produttore della fotocamera. </li></ol> 5. Data Processing Nota: I dati mappatura ottica vengono raccolti e conservati come una serie di matrici di intensità fluorescente in diversi momenti. Ogni represe pixelNTS una misura di intensità della fluorescenza raccolti da una posizione specifica sulla preparazione dei tessuti in un punto temporale specifico. Fluorescenza di fondo viene rimosso automaticamente per pixel per consentire una migliore visualizzazione delle variazioni di fluorescenza indotte da variazioni di tensione della membrana e dall&#39;alto in basso per corrispondere con potenziali d&#39;azione (AP) misurati da sistemi di microelettrodi. I dettagli delle varie fasi di elaborazione dei dati di imaging ottico, tra cui la segmentazione delle immagini, filtraggio spaziale, il filtraggio temporale, e la rimozione deriva della linea di base, sono previsti nella revisione mirata. 15 <ol><li> Manualmente o utilizzando l&#39;algoritmo speciale (per esempio, un rilevamento soglia o fronte) 15 per determinare i confini dei tessuti, creare una maschera binaria di 1 (pixel incluse) e 0 (pixel esclusi) e applicare la maschera per ogni fotogramma della sequenza. Questo processo crea un&#39;immagine binaria che evidenzia le aree di interesse per ulteriori elaborazioni. </li><li> Per migliorare il rapporto segnale-rumore del optdati iCal, filtrano i segnali all&#39;interno delle aree selezionate di interesse. Per questo, utilizzare spaziale (media di pixel fluorescenti adiacenti quali definite da un bidone convoluzione desiderato o kernel, ad esempio 3 x 3 o, per i dati rumorosi, 5 x 5) e / o filtro temporale (per esempio, Butterworth, tipo Chebyshev 1, tipo 2 Chebyshev, ellittico, ecc) (Figura 2). Tenete a mente la possibilità di artefatti filtrati indotta quando si interpretano i dati. Per maggiori dettagli, vedi recensione. 15 </li><li> Rimuovere deriva della linea di base in registrazioni ottiche quando necessario (utilizzando filtro passa-alto o raccordo polinomio al segnale originale) e quindi normalizzare ogni segnale pixel da 0 (fluorescenza minima) a 1 (fluorescenza massima). </li><li> Selezionare una finestra temporale che comprende i tempi di attivazione di tutti i pixel per una singola propagazione AP. Assegnare ad ogni pixel il suo tempo di attivazione come il momento di massima derivata salita (dF / dt max, dove F è fluorescenintensità ce). Utilizzando tutti i tempi di attivazione del pixel, ricostruire la mappa di attivazione isochronal. Ogni isochron mostrerà quindi i pixel attivati ​​contemporaneamente. </li><li> Per ricostruire la mappa di distribuzione durata AP (APD), per ciascun pixel calcolare la durata tra il tempo di attivazione e il tempo ad un livello specifico di ripolarizzazione (ad esempio, al 80% di ripolarizzazione, APD 80). Utilizzando tutti i valori dei pixel APD, ricostruire la distribuzione mappa isocrona APD. Ogni Isochron mostrerà quindi i pixel con lo stesso APD. </li><li> Per calcolare la velocità di conduzione per AP propagazione, montare una superficie di preparazione ai dati in tempo di attivazione calcolati in 5.4. Per questo, utilizzare la superficie polinomiale di montaggio o locale levigatura della superficie del kernel e quindi calcolare vettori di velocità di conduzione locali dalla pendenza della superficie accoppiata. </li><li> Per creare la mappa ripolarizzazione, assegnare ciascun pixel suo tempo ripolarizzazione, definito come la derivata seconda massimo (d 2 F / dt2) del segnale ottico alla fine del OAP, o il tempo del 90% ripolarizzazione. </li></ol>

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<li>Wu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Altered+sinoatrial+node+function+and+intra-atrial+conduction+in+murine+gain-of-function+Scn5a%2B%2FDeltaKPQ+hearts+suggest+an+overlap+syndrome%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">Altered sinoatrial node function and intra-atrial conduction in murine gain-of-function Scn5a+/DeltaKPQ hearts suggest an overlap syndrome.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (7), H1510-H1523 (2012).</li>
</ol>

Non vengono dichiarati conflitti di interesse.

Qui, abbiamo presentato due tipi di preparazioni del mouse SAN: 1) intatto SAN nel cuore tutta la Langendorff-perfusione, e 2) SAN nella isolato, aperto preparazione atriale. Questi due tipi di elaborazione hanno diversi scopi sperimentali. Nella preparazione tutto il cuore Langendorff-perfuso, la struttura atriale intatta viene preservata che rende possibile studiare aritmie atriali complesse come la fibrillazione atriale e interazioni tra SAN e atrio durante le tachiaritmie rientranti. 6 Al contrario, nella...

Le nuove scoperte scientifiche che portano a passi avanti nella comprensione della fisiologia umana sono spesso precedute da progressi tecnologici. La mappatura ottica fluorescente, ad esempio, consente di studiare più parametri fisiologici sia nelle cellule che nei tessuti. 1,2 Ha migliorato significativamente la nostra comprensione di come la struttura anatomica sia associata a funzioni e disfunzioni elettrofisiologiche. Nel cuore, il pacemaker naturale e i sistemi di conduzione come il nodo senoatriale (SAN) e la giunzione atrioventricolare sono costituiti da miociti nodali isolati dai miociti atriali circostanti. 3-5 Tale organizzazione crea strutture tridimensionali complesse con proprietà elettriche specializzate. È stato riconosciuto che sia il rimodellamento strutturale che funzionale di queste strutture pacemaker forma significative eterogeneità elettrofisiologiche. 6,7 Comprendere il meccanismo alla base del modo in cui tali eterogeneità provocano disfunzioni SAN e aritmogenesi atriale porterà notevoli benefici al trattamento clinico di queste malattie. Richiede una tecnica per visualizzare la propagazione dei segnali elettrici a livello tissutale, come la mappatura ottica. 
Recentemente, l'accumulo di prove ha dimostrato l'avanzamento della mappatura ottica negli studi di elettrofisiologia e patologia atriale. 2 Tuttavia, studi nuovi e rigorosi dipendono dall'interpretazione accurata dei dati sperimentali, la cui validità e stabilità si basano su accurati protocolli sperimentali. I topi geneticamente modificati sono ampiamente utilizzati per la ricerca come modelli animali di malattie umane tra cui la sindrome del seno malato, le anomalie del pacemaker e le aritmie atriali. 6,8-11 Pertanto, una combinazione di mappatura ottica fluorescente con modelli murini transgenici fornisce un potente strumento per studiare le anomalie elettriche cardiache associate a varie patologie. In questo articolo, presentiamo un protocollo per la mappatura ottica ad alta risoluzione della SAN e dell'atrio del topo. In particolare, discutiamo e confrontiamo diversi approcci al carico del colorante, gli effetti temporali sullo sbiancamento del colorante e la stabilità della frequenza cardiaca durante l'esperimento.

<table><tbody><tr><td>camicia d'acqua</td><td>Radnoti</td><td>1660 Series Bagno di tessuto per procedure di isolamento di grandi organi o singole cellule bagnomaria</td><td></td></tr><tr><td>/ circolatore</td><td>Fisher Scientific</td><td>1016S</td><td></td></tr><tr><td>amplificatore di pressione</td><td>AD Instruments</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>EMD Millipore Nylon Net Filters</td> Fisher <td>Scientific</td><td>NY1102500</td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore</td><td>di pressione AD Strumenti</td><td>MLT0670</td><td></td></tr><tr><td>Perni per minuzie in acciaio inossidabile - 0,1 mm di diametro</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Pompa di perfusione</td><td>World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4LS</td><td></td></tr><tr><td>Pompa</td> di <td>superfusione World Precision Instruments</td><td>PERIPRO-4HS</td><td></td></tr><tr><td>Vannas Tubingen scissors&nbsp;</td><td>World Precision Instruments</td><td>503379</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Dumont</td><td>World Precision Instruments</td><td>501201, forbici 500085</td><td></td></tr><tr><td>Mayo</td><td>World Precision Instruments</td><td>501750</td><td></td></tr><tr><td>Pinze emostatiche Kelly</td><td>World Precision Instruments</td><td>501241</td><td></td></tr><tr><td>Pinze Iris</td> World <td>Precision Instruments</td><td>15917</td><td></td></tr><tr><td>Iris forbici</td><td>World Precision Instruments</td><td>501263</td><td></td></tr><tr><td>elettrodi ECG da 12 mm (calibro 29) (monopolari)&nbsp;</td><td>AD Instruments</td><td>MLA1203</td><td></td></tr><tr><td>porta di iniezione Luer in linea</td><td>Ibidi</td><td>10820</td><td></td></tr><tr><td>Ultima-L CMOS camera&nbsp;</td><td>SciMedia</td><td>MiCAM-05&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>lampada alogena</td><td>Moritex USA Inc</td><td>MHAB-150W</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 (2H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 (6H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 (H2O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td></td></tr><tr><td>D-glucosio</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td></td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td></td></tr><tr><td>RH237</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>S1109</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsolfossido (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td></td></tr></tbody></table>

mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

High-resolution Optical Mapping of the Mouse Sino-atrial Node

Le disfunzioni del nodo seno-atriale (SAN) e le complicanze associate costituiscono importanti cause di morbilità nei pazienti con malattie cardiache. Lo sviluppo di nuove terapie farmacologiche per curare questi pazienti si basa sulla comprensione approfondita sia della normale fisiologia che della fisiopatologia della SAN. Tra gli studi sulla pacemaking cardiaca, il SAN di topo è ampiamente utilizzato per la sua fattibilità di modifiche nell'espressione di diversi geni che codificano per i canali ionici SAN o per le proteine che gestiscono il calcio. Prove emergenti da studi elettrofisiologici e istologici hanno anche dimostrato la rappresentatività e la somiglianza della struttura e delle funzioni del SAN murino con i mammiferi più grandi, inclusa la presenza di vie di conduzione specializzate dal SAN all'atrio e una complessa gerarchia di pacemaker all'interno del SAN. Recentemente, la tecnica della mappatura ottica ha notevolmente facilitato l'esplorazione e l'indagine dell'origine dell'eccitazione e della conduzione all'interno e dalla SAN murina, che a sua volta ha esteso la comprensione della SAN e ha beneficiato i trattamenti clinici delle malattie associate alla disfunzione SAN. In questo manoscritto, abbiamo descritto in dettaglio come eseguire la mappatura ottica del SAN del topo dal cuore intatto, perfuso da Langendorff, e dalla preparazione atriale isolata. Questo protocollo è uno strumento utile per migliorare la comprensione della fisiologia e della fisiopatologia della SAN nel topo.

Mappatura ottica del intatto SAN dal Cuore Langendorff-perfuso Un tipico esempio di una mappa di contorno di attivazione RA ricostruiti ritmo sinusale spontanea è mostrato in figura 3 per un cuore del mouse Langendorff-perfuso. Il punto di attivazione precoce si trova all&#39;interno della regione intercaval vicino alla SVC dove il SAN è anatomicamente definito. 3,16 mappe di contorno attivazione acquisite a 1.0 e 0.5 msec frequenza di ...

Qui, presentiamo un protocollo per la mappatura ottica di attività elettrica dal mouse atrio destro e soprattutto il nodo seno-atriale, con una risoluzione spaziale e temporale elevata.

Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

Sino-atrial node (SAN) dysfunctions and associated complications constitute important causes of morbidity in patients with cardiac diseases. The ...

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è eseguire la mappatura ottica del nodo senoatriale del topo a partire da un cuore intatto perfuso con tecnica di Langendorff o da una preparazione atriale isolata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'elettrofisiologia e della fisiopatologia del nodo senoatriale riguardo ai meccanismi alla base delle alterazioni del pacemaker, della sindrome del seno malato e di varie patologie associate ad aritmie atriali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi di multipli parametri nei tessuti intatti con elevatissima risoluzione spaziale e temporale.Dopo aver verificato il corretto livello di anestesia mediante pizzicamento delle dita dei piedi, utilizzare forbici Mayo curve da 5,5 pollici e pinze emostatiche Kelly da 5,5 pollici per praticare un'incisione di un centimetro sulla parte anteriore del torace. Utilizzando pinze ad iris curve da quattro pollici, afferrare rapidamente il tessuto polmonare e usare forbici ad iris da quattro terzi di pollice per asportare insieme polmone, timo e cuore, insieme al pericardio. Lavare i tessuti in soluzione di Tyrode modificata ossigenata a 37 gradi Celsius.Quindi utilizzare forbici curve Vannas Tubingen da tre pollici e pinze numero cinque da quattro terzi di pollice per rimuovere i polmoni, il timo e il tessuto adiposo dal cuore. Successivamente, utilizzare una cannula personalizzata da 21 gauge e due pinze curve B numero cinque da 4,3 pollici per cannuolare l’aorta e perfondere e superfondere simultaneamente il cuore con soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius, indirizzando la soluzione attraverso un filtro in nylon da 11 micron in linea prima della perfusione per prevenire l’ostruzione della circolazione coronarica. Quindi collegare un trasduttore di pressione a un blocco Luer sulla linea di perfusione tramite un rubinetto a tre vie per monitorare la pressione aortica, regolando la velocità di perfusione al fine di mantenere la pressione aortica tra 60 e 80 millimetri di mercurio secondo necessità.Per la mappatura ottica del nodo senoatriale da un cuore perfuso con tecnica di Langendorff, posizionare l'organo in orientamento orizzontale con la faccia posteriore rivolta verso l'alto in una camera di bagnomaria in vetro e utilizzare perni di diametro di 0,1 millimetri per fissare l'apice ventricolare al fondo rivestito in silicone della camera, al fine di prevenire movimenti indotti dal flusso durante l'esperimento. Inserire un piccolo tubo in silicone nel ventricolo sinistro attraverso la vena polmonare, l'atrio sinistro e la valvola mitrale, e utilizzare un filo di seta 40 per fissare il tubo al tessuto connettivo circostante. Successivamente, utilizzare un altro filo di seta 40 per legare le vene cave superiore e inferiore e fissare il margine dell'appendice atriale destro al fondo della camera.Stendere e fissare con un perno l'altra estremità del filo di sutura alla base della camera e posizionare un elettrodo di stimolazione su misura sul bordo dell'appendice atriale destro. Quindi posizionare due elettrodi monopolari a ago da 12 millimetri per elettrocardiogramma vicino alla base dei ventricoli destro e sinistro e collocare l'elettrodo di terra per elettrocardiogramma vicino all'apice del ventricolo. Per colorare il tessuto, iniettare il colorante diluito in un porto di perfusione in linea sulla linea di perfusione coronarica per un rilascio della durata di cinque a sette minuti.Dopo 20 minuti di stabilizzazione, aggiungere 0,5 millilitri di blebbistatina a 37 gradi Celsius nel perfusato, seguiti dall'iniezione di 0,1 millilitri di blebbistatina diluita in 1 millilitro di soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius nella linea di perfusione coronarica nell'arco di altri cinque o sette minuti, utilizzando un porto di iniezione Luer lock in linea. La blebbistatina deve essere utilizzata con cautela. Per evitare la precipitazione dell'inibitore, sciogliere prima la blebbistatina in un mezzo riscaldato fino a diventare limpido a 37 gradi e agitare vigorosamente la miscela.Per eseguire la mappatura ottica del campione, fissare innanzitutto un piccolo vetrino coprioggetto sulla superficie della soluzione sopra il tessuto, al fine di ridurre eventuali artefatti di movimento causati dalle vibrazioni della soluzione. Successivamente, utilizzando una guida luminosa biforcata flessibile con luce di eccitazione fornita da una lampada alogena a corrente costante e a basso rumore, indirizzare il fascio di luce filtrato sul tessuto e acquisire il segnale fluorescente risultante. Dopo aver cannullato il cuore come appena dimostrato, dissezionare i ventricoli dal lato anteriore e aprire l'atrio destro attraverso la valvola tricuspide lungo l'asse valvola tricuspide-vena cava superiore, seguito da un'incisione attraverso il lembo mediale della cresta terminale.Per aprire la parete libera anteriore dell'atrio, effettuare un'incisione dalla linea mediana dell'incisione del lembo mediale fino al margine dell'angolo inferiore destro dell'appendice atriale destro e fissare con spilli la parete libera atriale appiattita sul fondo di una camera rivestita di silicone. Per aprire l'appendice atriale sinistro, tagliare attraverso la valvola mitrale lungo l'angolo superiore della valvola mitrale dell'appendice atriale sinistro. Quindi fissare con spilli l'atrio sinistro aperto come precedentemente fatto per l'atrio destro.Quindi rimuovere parzialmente il tessuto ventricolare. Conservare un bordo di tessuto ventricolare per fissare il preparato, al fine di evitare danni agli atri, e fissare il tessuto al fondo di una camera rivestita con Sylgard. Sollevare ora il preparato finale di circa 0,5 millimetri dal fondo della camera rivestita in silicone per consentire la superfusione sia dalle superfici epicardiche che endocardiche, e sottoporre il campione a superfusione con soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius.Quindi posizionare un elettrodo personalizzato in argento/cloruro d'argento sul margine dell'appendice atriale destro dissezionata. Posizionare un elettrodo monopolare a ago da 12 millimetri per l'elettrocardiogramma vicino a ciascuna delle appendici atriali destra e sinistra e collocare l'elettrodo di terra per l'elettrocardiogramma nelle vicinanze della giunzione atrioventricolare. Per colorare il tessuto cardiaco, utilizzare una pipetta da 1 millimetro per rilasciare lentamente il colorante sensibile al voltaggio diluito in soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius direttamente sul tessuto.Quindi immobilizzare il campione applicando direttamente blebbistatina diluita sul tessuto, seguita dall'amministrazione di altri 0,5 millilitri di blebbistatina tramite il perfusato, e mappare otticamente il campione come appena illustrato. I passaggi di colorazione del tessuto e di inibizione con blebbistatina sono critici e richiedono un'implementazione accurata e una procedura di colorazione precisa, in modo che i parametri fisiologici atriali, inclusi la frequenza cardiaca, l'ubicazione del pacemaker principale e la conduzione atriale, non vengano alterati. Qui viene mostrata una tipica mappa di contorno dell'attivazione dell'atrio destro ricostruita per un ritmo sinusale spontaneo in un cuore di topo perfuso con tecnica di Langendorff, insieme a due mappe di contorno corrispondenti dell'atrio destro acquisite a frequenze di campionamento di 1 e 0,5 millisecondi.Il punto di attivazione precoce si trova nella regione intercavale vicino alla vena cava superiore, dove il nodo senoatriale è definito anatomicamente. In questo esperimento, dopo aver effettuato una stimolazione dell'appendice atriale destro per almeno un minuto a una frequenza di 10-12 hertz, la stimolazione elettrica è stata interrotta e il tempo di recupero del nodo senoatriale è stato calcolato come l'intervallo di tempo tra l'ultimo potenziale d'azione captato e il primo potenziale d'azione spontaneo. L'attivazione del preparato atriale isolato durante il ritmo sinusale spontaneo permette di identificare con precisione l'area della localizzazione del pacemaker principale.Se le procedure chirurgiche e di carico del colorante vengono seguite correttamente, non dovrebbero essere osservati cambiamenti significativi nelle caratteristiche fisiologiche dell'atrio. Sebbene la colorazione arteriosa possa richiedere una maggiore quantità di colorante, il segnale fluorescente nel tessuto dell'area del nodo senoatriale appare più stabile con questo metodo di carico, con un tempo di decadimento dell'intensità del segnale dopo la colorazione coronarica quasi doppio rispetto a quello dopo la colorazione superficiale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 30, 40 minuti se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, prestare attenzione ad identificare l'anatomia atriale prima di effettuare un taglio, al fine di evitare danni al tessuto atriale e al nodo seno. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altre misurazioni, come le registrazioni con elettrodi mitrali convenzionali in vetro, per rispondere ad ulteriori domande riguardo alle caratteristiche del potenziale transmembrana cumulativo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia intellettiva per esplorare le aritmie atriali, inclusa la disfunzione del nodo senoatriale nel cuore.Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi ottica ad alta risoluzione di un preparato del nodo seno di topo.

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Colorazione con immunofluorescenza a montaggio intero, imaging confocale e ricostruzione 3D del nodo senoatriale e atrioventricolare nel topo

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Registrazione di microelettrodi della velocità di attivazione dei nodi senoatriali per identificare i difetti intrinseci del pacemaking cardiaco nei topi

Riportiamo un metodo per la ricostruzione mesoscopica dell'intero cuore del topo combinando nuovi progressi nella trasformazione e colorazione dei tessuti con lo sviluppo di un microscopio a foglio di luce a scansione assiale.

Imaging ottico mesoscopico dell'intero cuore del topo

Il protocollo utilizza la microscopia avanzata a foglio di luce insieme a metodi di pulizia dei tessuti adattati per studiare strutture cardiache complesse nei cuori dei roditori, con un grande potenziale per la comprensione della morfogenesi e del rimodellamento cardiaco.

Imaging a foglio luminoso per rivelare la struttura cardiaca nei cuori dei roditori

Scopri la mappatura ottica ad alta risoluzione del nodo seno-atriale del mouse con cuore perfuso Langendorff. Questo metodo permette di studiare anomalie del pacemaker e aritmie atriali con precisione spaziale e temporale.

Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

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