Mappatura ottica ad alta risoluzione del mouse nodo seno-atriale

L'obiettivo generale di questo protocollo sperimentale è eseguire la mappatura ottica del nodo senoatriale del topo a partire da un cuore intatto perfuso con tecnica di Langendorff o da una preparazione atriale isolata. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'elettrofisiologia e della fisiopatologia del nodo senoatriale riguardo ai meccanismi alla base delle alterazioni del pacemaker, della sindrome del seno malato e di varie patologie associate ad aritmie atriali. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi di multipli parametri nei tessuti intatti con elevatissima risoluzione spaziale e temporale.

Dopo aver verificato il corretto livello di anestesia mediante pizzicamento delle dita dei piedi, utilizzare forbici Mayo curve da 5,5 pollici e pinze emostatiche Kelly da 5,5 pollici per praticare un'incisione di un centimetro sulla parte anteriore del torace. Utilizzando pinze ad iris curve da quattro pollici, afferrare rapidamente il tessuto polmonare e usare forbici ad iris da quattro terzi di pollice per asportare insieme polmone, timo e cuore, insieme al pericardio. Lavare i tessuti in soluzione di Tyrode modificata ossigenata a 37 gradi Celsius.

Quindi utilizzare forbici curve Vannas Tubingen da tre pollici e pinze numero cinque da quattro terzi di pollice per rimuovere i polmoni, il timo e il tessuto adiposo dal cuore. Successivamente, utilizzare una cannula personalizzata da 21 gauge e due pinze curve B numero cinque da 4,3 pollici per cannuolare l’aorta e perfondere e superfondere simultaneamente il cuore con soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius, indirizzando la soluzione attraverso un filtro in nylon da 11 micron in linea prima della perfusione per prevenire l’ostruzione della circolazione coronarica. Quindi collegare un trasduttore di pressione a un blocco Luer sulla linea di perfusione tramite un rubinetto a tre vie per monitorare la pressione aortica, regolando la velocità di perfusione al fine di mantenere la pressione aortica tra 60 e 80 millimetri di mercurio secondo necessità.

Per la mappatura ottica del nodo senoatriale da un cuore perfuso con tecnica di Langendorff, posizionare l'organo in orientamento orizzontale con la faccia posteriore rivolta verso l'alto in una camera di bagnomaria in vetro e utilizzare perni di diametro di 0,1 millimetri per fissare l'apice ventricolare al fondo rivestito in silicone della camera, al fine di prevenire movimenti indotti dal flusso durante l'esperimento. Inserire un piccolo tubo in silicone nel ventricolo sinistro attraverso la vena polmonare, l'atrio sinistro e la valvola mitrale, e utilizzare un filo di seta 40 per fissare il tubo al tessuto connettivo circostante. Successivamente, utilizzare un altro filo di seta 40 per legare le vene cave superiore e inferiore e fissare il margine dell'appendice atriale destro al fondo della camera.

Stendere e fissare con un perno l'altra estremità del filo di sutura alla base della camera e posizionare un elettrodo di stimolazione su misura sul bordo dell'appendice atriale destro. Quindi posizionare due elettrodi monopolari a ago da 12 millimetri per elettrocardiogramma vicino alla base dei ventricoli destro e sinistro e collocare l'elettrodo di terra per elettrocardiogramma vicino all'apice del ventricolo. Per colorare il tessuto, iniettare il colorante diluito in un porto di perfusione in linea sulla linea di perfusione coronarica per un rilascio della durata di cinque a sette minuti.

Dopo 20 minuti di stabilizzazione, aggiungere 0,5 millilitri di blebbistatina a 37 gradi Celsius nel perfusato, seguiti dall'iniezione di 0,1 millilitri di blebbistatina diluita in 1 millilitro di soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius nella linea di perfusione coronarica nell'arco di altri cinque o sette minuti, utilizzando un porto di iniezione Luer lock in linea. La blebbistatina deve essere utilizzata con cautela. Per evitare la precipitazione dell'inibitore, sciogliere prima la blebbistatina in un mezzo riscaldato fino a diventare limpido a 37 gradi e agitare vigorosamente la miscela.

Per eseguire la mappatura ottica del campione, fissare innanzitutto un piccolo vetrino coprioggetto sulla superficie della soluzione sopra il tessuto, al fine di ridurre eventuali artefatti di movimento causati dalle vibrazioni della soluzione. Successivamente, utilizzando una guida luminosa biforcata flessibile con luce di eccitazione fornita da una lampada alogena a corrente costante e a basso rumore, indirizzare il fascio di luce filtrato sul tessuto e acquisire il segnale fluorescente risultante. Dopo aver cannullato il cuore come appena dimostrato, dissezionare i ventricoli dal lato anteriore e aprire l'atrio destro attraverso la valvola tricuspide lungo l'asse valvola tricuspide-vena cava superiore, seguito da un'incisione attraverso il lembo mediale della cresta terminale.

Per aprire la parete libera anteriore dell'atrio, effettuare un'incisione dalla linea mediana dell'incisione del lembo mediale fino al margine dell'angolo inferiore destro dell'appendice atriale destro e fissare con spilli la parete libera atriale appiattita sul fondo di una camera rivestita di silicone. Per aprire l'appendice atriale sinistro, tagliare attraverso la valvola mitrale lungo l'angolo superiore della valvola mitrale dell'appendice atriale sinistro. Quindi fissare con spilli l'atrio sinistro aperto come precedentemente fatto per l'atrio destro.

Quindi rimuovere parzialmente il tessuto ventricolare. Conservare un bordo di tessuto ventricolare per fissare il preparato, al fine di evitare danni agli atri, e fissare il tessuto al fondo di una camera rivestita con Sylgard. Sollevare ora il preparato finale di circa 0,5 millimetri dal fondo della camera rivestita in silicone per consentire la superfusione sia dalle superfici epicardiche che endocardiche, e sottoporre il campione a superfusione con soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius.

Quindi posizionare un elettrodo personalizzato in argento/cloruro d'argento sul margine dell'appendice atriale destro dissezionata. Posizionare un elettrodo monopolare a ago da 12 millimetri per l'elettrocardiogramma vicino a ciascuna delle appendici atriali destra e sinistra e collocare l'elettrodo di terra per l'elettrocardiogramma nelle vicinanze della giunzione atrioventricolare. Per colorare il tessuto cardiaco, utilizzare una pipetta da 1 millimetro per rilasciare lentamente il colorante sensibile al voltaggio diluito in soluzione di Tyrode a 37 gradi Celsius direttamente sul tessuto.

Quindi immobilizzare il campione applicando direttamente blebbistatina diluita sul tessuto, seguita dall'amministrazione di altri 0,5 millilitri di blebbistatina tramite il perfusato, e mappare otticamente il campione come appena illustrato. I passaggi di colorazione del tessuto e di inibizione con blebbistatina sono critici e richiedono un'implementazione accurata e una procedura di colorazione precisa, in modo che i parametri fisiologici atriali, inclusi la frequenza cardiaca, l'ubicazione del pacemaker principale e la conduzione atriale, non vengano alterati. Qui viene mostrata una tipica mappa di contorno dell'attivazione dell'atrio destro ricostruita per un ritmo sinusale spontaneo in un cuore di topo perfuso con tecnica di Langendorff, insieme a due mappe di contorno corrispondenti dell'atrio destro acquisite a frequenze di campionamento di 1 e 0,5 millisecondi.

Il punto di attivazione precoce si trova nella regione intercavale vicino alla vena cava superiore, dove il nodo senoatriale è definito anatomicamente. In questo esperimento, dopo aver effettuato una stimolazione dell'appendice atriale destro per almeno un minuto a una frequenza di 10-12 hertz, la stimolazione elettrica è stata interrotta e il tempo di recupero del nodo senoatriale è stato calcolato come l'intervallo di tempo tra l'ultimo potenziale d'azione captato e il primo potenziale d'azione spontaneo. L'attivazione del preparato atriale isolato durante il ritmo sinusale spontaneo permette di identificare con precisione l'area della localizzazione del pacemaker principale.

Se le procedure chirurgiche e di carico del colorante vengono seguite correttamente, non dovrebbero essere osservati cambiamenti significativi nelle caratteristiche fisiologiche dell'atrio. Sebbene la colorazione arteriosa possa richiedere una maggiore quantità di colorante, il segnale fluorescente nel tessuto dell'area del nodo senoatriale appare più stabile con questo metodo di carico, con un tempo di decadimento dell'intensità del segnale dopo la colorazione coronarica quasi doppio rispetto a quello dopo la colorazione superficiale. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 30, 40 minuti se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, prestare attenzione ad identificare l'anatomia atriale prima di effettuare un taglio, al fine di evitare danni al tessuto atriale e al nodo seno. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altre misurazioni, come le registrazioni con elettrodi mitrali convenzionali in vetro, per rispondere ad ulteriori domande riguardo alle caratteristiche del potenziale transmembrana cumulativo. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo della fisiologia intellettiva per esplorare le aritmie atriali, inclusa la disfunzione del nodo senoatriale nel cuore.

Dopo aver guardato questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un'analisi ottica ad alta risoluzione di un preparato del nodo seno di topo.