Preparazione e In Vitro Caratterizzazione del dendrimero a base di agenti di contrasto per risonanza magnetica

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di mostrare la preparazione e la caratterizzazione di una chelazione paramagnetica dendrimera che può essere utilizzata come agente di contrasto per la risonanza magnetica e di dimostrare le sue prestazioni in un esperimento di imaging. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dei mezzi di contrasto MRI, come le proprietà e l'efficacia dei mezzi di contrasto dendrimerici. Il vantaggio principale di questa tecnica è la comoda preparazione dell'efficiente mezzo di contrasto MRI ad alto contenuto proteico, garantendone così una facile caratterizzazione.

Questo metodo può estendersi verso ulteriori modifiche strutturali e ottimizzazioni funzionali degli agenti di contrasto dendrimerici per risonanza magnetica, il che è di grande rilevanza per potenziali applicazioni in vivo. Le implicazioni si estendono alla ricerca biomedica e all'imaging diagnostico poiché l'alto tasso molecolare degli agenti di contrasto dendrimeri provoca tempi di ritenzione tissutale più lunghi e migliora sostanzialmente il segnale MRI. Per prima cosa, sciogliere un grammo del precursore macrociclico DO3A tributil estere in cinque millilitri di DMF.

Aggiungere 0,67 grammi di carbonato di potassio e mescolare a temperatura ambiente per 45 minuti. Aggiungere 0,87 grammi di terz-butil-2-bromo-4 4-nitrofenil butatnoato in porzioni nell'arco di un'ora e continuare a mescolare la miscela di reazione per 18 ore. Quindi, rimuovere il DMF con la distillazione sottovuoto da bulbo a bulbo a 40-60 gradi Celsius.

Purificare il residuo con cromatografia su colonna su gel di silice per ottenere un solido rotondo. Sciogliere un grammo di solido in una miscela di 10 millilitri di etanolo e 150 microlitri di una soluzione di ammoniaca normale in metanolo. Aggiungere 150 milligrammi di palladio su carbone attivo e posizionare il reattore a bottiglia nell'idrogenatore.

Agitare la miscela per 16 ore in un'atmosfera di idrogeno a 2,5 bar. Versare una sospensione di farina fossile in etanolo in un imbuto di vetro sinterizzato Filtrare la miscela di reazione attraverso la farina fossile per rimuovere il catalizzatore di palladio-carbonio. Rimuovere il solvente dal filtrato su un evaporatore rotante.

Sciogliere il solido risultante in 15 millilitri di diclorometano e quattro equivalenti di trietilammina. A questo, aggiungere 1,3 equivalenti di tiofosgene e mescolare il composto a temperatura ambiente per 16 ore. Rimuovere il solvente dalla miscela di reazione su un evaporatore rotante e purificare il residuo con cromatografia su colonna su gel di silice per ottenere il monomero di tipo DOTA come solido marrone chiaro.

Preparare 66,7 milligrammi di dendrimero G4 PAMAM da una soluzione al 10% in metanolo facendo evaporare il solvente su un evaporatore rotante a 40 gradi Celsius. Sciogliere il dendrimero in quattro millilitri di DMF. Aggiungere 0,105 millilitri di trietilammina alla soluzione dendrimera e mescolare per 45 minuti a 60 gradi Celsius.

Quindi aggiungere 354 milligrammi di monomero in porzioni nell'arco di un'ora. Continuare a mescolare a 45 gradi Celsius per 48 ore. Rimuovere il solvente con la distillazione sottovuoto bulb-to-bulb.

Confezionare una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale facendo roteare il mezzo di filtrazione su gel lipofilo in metanolo per tre ore a temperatura ambiente. Raccogli frazioni di un millilitro usando il metanolo come eluente. Analizza le frazioni per TLC.

Rimuovere il solvente dalle frazioni contenenti il chelante dendrimerico protetto su un evaporatore rotante. Acquisire uno spettro NMR protonico del composto e integrare le regioni aromatiche e alifatiche. Utilizzando questi valori, determinare il numero di macrocicli protetti di tipo DOTA accoppiati al dendrimero G4 PAMAM.

Per de-proteggere il prodotto, sciogliere il solido in cinque millilitri di acido formico e mescolare la miscela a 60 gradi Celsius per 36 ore. Rimuovere l'acido formico con un evaporatore rotante. Liofilizzare il residuo rimosso dall'evaporatore rotante per ottenere il chelante dendrimero.

Utilizzando la risonanza magnetica nasale protonica, determinare il numero di unità macrocicliche accoppiate al dendrimero. Sciogliere il chelante liofilizzato in acqua. Utilizzare idrossido di sodio 0,1 molare per regolare il pH della soluzione a 7,0.

Aggiungere una soluzione di 113 milligrammi di cloruro di gadolinio III in un millilitro d'acqua goccia per goccia alla soluzione chelante per un periodo di quattro ore. Regolare periodicamente il pH a 7,0 con idrossido di sodio molare 0,05. Mescolare il composto a temperatura ambiente per 24 ore.

Quindi, aggiungere 158 milligrammi di EDTA in porzioni per un periodo di quattro ore, correggendo il pH a 7,0 secondo necessità. Mescolate per altre 24 ore a temperatura ambiente. Confezionare una colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale con mezzo di filtrazione su gel idrofilo rigonfio in acqua.

Concentrare la miscela di reazione, caricare la miscela sulla colonna ed eluire con acqua deionizzata. Centrifugare il campione purificato in un'unità filtrante da centrifuga da tre kilodalton per 30 minuti a 1.800 volte g. Ripetere la filtrazione circa cinque volte per rimuovere l'eccesso di gadolinio e EDTA.

Confermare l'assenza di ioni gadolinio liberi nel filtrato con un test dell'arancia xilenolo. Rimuovere i volatili dal campione filtrato e liofilizzare il residuo per ottenere l'agente di contrasto dendrimerorico. Preparare una soluzione madre di DCA in acqua con una concentrazione compresa tra cinque e 10 millimolari.

Per determinare l'esatta concentrazione di DCA, è necessario combinare prima 360 microlitri della soluzione madre con 60 microlitri di uno standard di D2O e terz-butanolo. Mettere 400 microlitri di campione in una provetta NMR esterna. Inserire nella provetta del campione una provetta con inserto NMR coassiale contenente una soluzione di riferimento di terz-butanolo e acqua.

Acquisire uno spettro NMR protonico e misurare lo spostamento di frequenza tra i segnali terz-butanolo delle soluzioni di riferimento e del campione. Calcolare la concentrazione di DCA utilizzando la formula indicata, correggendo l'aggiunta di terz-butanolo nel campione. Determinare la concentrazione di una soluzione GdDOTA disponibile in commercio allo stesso modo.

Posizionare le soluzioni DCA e GdDOTA nel tampone HEPES e nei controlli dell'acqua in due serie di fiale di plastica. Chiudere le fiale con tappi assicurandosi che non siano presenti bolle d'aria. In una siringa da 60 millilitri, caricare orizzontalmente i campioni di DCA da 0,01 e 0,02 millimolari, uno dei campioni di GdDOTA da 0,5 e 1,0 millimolari e due dei controlli dell'acqua.

Ripetere questa procedura caricando la seconda serie di campioni in una seconda siringa da 60 millilitri. Riempire ogni siringa con una soluzione millimolare di GdDOTA e tappare le punte della siringa. Posizionare una delle siringhe orizzontalmente in uno scanner MRI in modo che i campioni siano verticali rispetto allo scanner.

Far scorrere le siringhe al centro dello scanner. Selezionare la scansione anatomica per posizionare la siringa all'isocentro del magnete. Quindi premere il pulsante del semaforo per eseguire le regolazioni dei parametri di scansione iniziali e avviare la scansione.

Scegli il metodo di ripresa ad angolo veloce/lento per eseguire l'imaging pesato in T1 o il metodo di acquisizione rapida con miglioramento del rilassamento per eseguire l'imaging pesato in T2. Utilizzare la scansione localizzatore per selezionare la fetta coronale per i campioni allineati verticalmente. Ottimizza il contrasto ai parametri di acquisizione del rumore e acquisisci l'immagine.

Utilizza una ROI circolare per determinare l'ampiezza media del segnale e la deviazione standard per lo sfondo e per ciascun campione. Calcola il rapporto segnale/rumore. La NMR, LA MS MALDI-TOF e l'analisi elementare hanno indicato che una media di 49 unità macrocicliche sono state coniugate al dendrimero G4 PAMAM.

Con la risonanza magnetica sono state determinate anche le concentrazioni e i tempi di rilassamento longitudinale e trasversale delle soluzioni di DCA. I valori di rilassabilità ottenuti sono stati confrontati con un monomero GdDOTA disponibile in commercio e clinicamente utilizzato. Le prestazioni del DCA sono state anche confrontate con il monomero GdDOTA.

Due serie di soluzioni avevano concentrazioni di gadolinio simili, determinate dal numero di unità macrocicliche coniugate, e le altre due serie avevano concentrazioni molecolari simili. In un esperimento di imaging pesato in T1 con concentrazioni simili di gadolinio, il rapporto segnale/rumore era leggermente più alto per il DCA che per il GdDOTA. Quando le soluzioni avevano concentrazioni simili per molecola, il rapporto segnale/rumore del DCA era circa tre volte maggiore di quello di GdDOTA.

In un esperimento di imaging pesato in T2, il rapporto segnale/rumore del DCA era significativamente inferiore a quello del GdDOTA in entrambe le coppie di concentrazioni, in particolare a concentrazioni più elevate di DCA. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare un mezzo di contrasto MRI purificato e caratterizzato a base di dendrimeri. Seguendo questa procedura, è possibile preparare diversi tipi di mezzi di contrasto dendrimerici e di risonanza magnetica di dimensioni nanometriche modificando le unità della molecola e analizzarli convenientemente.

Dopo aver padroneggiato questa tecnica, i ricercatori nel campo dello sviluppo di agenti di contrasto MRI dovrebbero essere in grado di preparare una serie di sonde specifiche per eseguire vari studi funzionali di importanza critica per l'imaging molecolare contemporaneo.