Name: Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-17T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 14 s
Description: Scopri un metodo di citometria a flusso per analizzare l'attività citotossica delle cellule NK nel sangue umano intero. Questa tecnica offre risultati rapidi, accurati e riproducibili per la ricerca immunologica.

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Questo progetto è stato supportato dalla sovvenzione competitiva dell'Agriculture and Food Research Initiative n. 2100-68003-30395 dell'USDA National Institute of Food and Agriculture.

NOTA: Tutte le procedure di raccolta del sangue sono state condotte in conformità con le linee guida stabilite dalla Appalachian State University (ASU) Institutional Review Board (IRB). 1. Raccolta Sangue intero <ol><li> Avere un flebotomo certificato prelevare il sangue secondo le linee guida dell'Organizzazione Mondiale della Sanità. </li><li> Disegnare il sangue in un 4 ml di tubo di raccolta del sangue contenente acido Di-Potassio etilendiamminotetraacetico (K 2 EDTA). Capovolgere tubo di raccolta sangue secondo le istruzioni del produttore. Mantenere tubo di raccolta di sangue a temperatura ambiente su un agitatore meccanico banco fino separazione. </li></ol> 2. Preparazione delle cellule bersaglio Dio-etichettati <ol><li> Crescere K562 cellule in completa di Iscove Modified Dulbecco media (IMDM) supplementato con siero fetale bovino al 10% (FBS) e 1% di penicillina streptomicina per diverse settimane prima del test per garantire la salute delle cellule. Regolare il concentratione delle cellule per 3 x 10 5 cellule / ml al giorno attraverso il completamento di una cella di conteggio e successivo passaggio delle cellule. Eseguire un completo cambiamento dei media ogni 2 o 3 giorni. </li><li> Il giorno del test, eseguire una conta cellulare utilizzando un 1: 1 emocitometro. <ol><li> Rimuovere 10 microlitri dal pallone K562 e posto in 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 10 ml di colorante blu trypan nella stessa provetta da 1,5 ml per un fattore di diluizione di 1: 1. </li><li> Delicatamente a scatti la provetta per mescolare K562 cellule e trypan colorante blu. </li><li> Lasciare K562 colorante blu cellula-trypan per incubare per 1 minuto a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere 15 ml di cellule K562 macchiati dal tubo. </li><li> Pipetta su emocitometro per la conta delle cellule. </li><li> Contare le celle nelle quattro piazze d'angolo così come la piazza centrale per un totale di cinque piazze. </li><li> Calcolare conta cellulare utilizzando l'equazione: Totale cellule / ml = cellule totali contate X (fattore di diluizione / numero di caselle) X 10.000 / mL </li></ol></li> Risospendere le cellule bersaglio K562 con una densità finale di 1 x 10 6 cellule / ml in terreno di coltura libera IMDM siero. <li> Per le cellule bersaglio K562 senza macchia, aggiungere 10 ml di cellule bersaglio K562 a uno 15 ml di tubo ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml per un totale di 10 x 10 6 cellule K562. Mettere in un incubatore a 37 ° con 5% di CO 2 fino al momento dell'uso. </li><li> Per le cellule bersaglio DiO macchiato K562, aggiungere 10 ml di K562 obiettivi cellule ad uno 15 ml di tubo ad una densità di 1 x 10 6 cellule / ml per un totale di 10 x 10 6 cellule K562. <ol><li> Aggiungere 1 ml di soluzione DiO cella-etichettatura per ml di sospensione cellulare in 15 ml di tubo designato per DiO colorazione e delicatamente vortice. Ad esempio, aggiungere 10 ml di soluzione di cellule-etichettatura DiO a 10 x 10 6 cellule / ml K562 ad un volume di 1 x 10 6 cellule / ml. </li><li> Incubare soluzione K562-DiO per 20 min a 37 ° C con 5% di CO 2 in una provetta da 15 ml. </li></ol></li><li> Seguiincubazione ing, aggiungere 3 ml di soluzione fisiologica a temperatura ambiente tampone fosfato (PBS) per soluzione K562-dio contenente 15 ml di tubo. </li><li> Centrifugare per 10 min a 135 xg a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet cellulare con 1.000 ml di volume regolabile pipetta. </li><li> Aggiungere 10 ml di IMDM fresco alla cella pellet contenente 15 ml di tubo. </li><li> Delicatamente tubo vortex per risospendere le cellule. </li><li> Ripetere i punti 2.7 a 2.10 altre due volte. </li><li> Cellule Conservare in un incubatore a 37 ° con il 5% di CO 2 fino al momento dell'uso. NOTA: Le celle possono essere memorizzati in incubatrice fino a 24 h, ma è preferibile usarli lo stesso giorno. </li></ol> 3. Preparazione di controlli <ol><li> Trasferire il seguente in separati e opportunamente etichettati tubi da 1,5 ml: <ol><li> Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente risospeso DIO-etichettato K562 cellule nel "Double Positive" etichettato 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente risospeso cellule K562 DIO-etichettati in "Dio solo" etichettato 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 500 ml di IMDM fresco contenente cellule K562 senza etichetta risospese nella "ioduro di propidio (PI) solo" etichettati 1,5 ml di tubo. </li></ol></li><li> Posizionare il doppio positivo e PI solo tubi in un bagno d'acqua C 55 ° per 5 min. </li><li> Dopo la 5 minuti è trascorso, rimuovere i tubi e pulire con il 70% di etanolo. </li><li> Aggiungere 10 L di PI al doppio positivo e PI solo 1,5 mL. </li><li> Mettere tutti i tre controlli K562 cellule bersaglio in incubatore a 37 ° C per 30 min. </li><li> Dopo 30 min di incubazione è trascorso, centrifugare tutti i tre controlli di cellule bersaglio K562 per 2 min a 163 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere ogni controllo con 20 ml di mezzi di coltura cellulare IMDM fresco, e lasciare nel 37 ° C incubatore con 5% di CO 2 per almeno30 min per il segnale DiO ottimale. NOTA: I controlli sono ora pronti per essere eseguito attraverso il flusso di imaging citometro. </li></ol> 4. NK cellulare automatizzata Separazione <ol><li> Accendere separatore cellulare e consentire il ciclo di start-up alla fine. </li><li> Assicurarsi che tutte le bottiglie di illuminazioni fluidi sono verdi e che la bottiglia è vuota rifiuti. </li><li> Ottenere un ambiente a temperatura 15 ml portaprovette. NOTA: La selezione è basata su volumi di campione. Ad esempio, per un volume inferiore a 3 ml utilizzano un portaprovette 15 ml e per un volume superiore a 3 mL utilizzano una mL cremagliera 50 del tubo. </li><li> tubi campione Etichetta di conseguenza (Ripeti per campione / partecipante): Partecipante 1 campione di sangue intero; Partecipante 1 frazione negativa; Partecipante 1 frazione positiva. </li><li> pipettare delicatamente 1,5 ml di sangue intero dal punto 1.2 in 15 tubo "intero campione di sangue" mL. </li><li> Posizionare il tubo adeguatamente etichettati 15 mL "intero campione di sangue" dal punto 4.5 ed etichettati 15 mL "frazione negativa" etubi "frazione positiva" dal passo 4.4 nel rack tubo. Utilizzare thefollowing cremagliera campione di set-up: Riga (R1) A: Campione di sangue intero, Fila (R2) B: Negativo, frazione senza etichetta, Fila (R4) C: Positivo, frazione magneticamente etichettati. </li><li> Inserire il rack di separazione sul MiniSampler per autolabeling. </li><li> Selezionare "reagente" sul menu ed evidenziare la posizione in cui il flaconcino verrà inserito nel rack separatore. </li><li> Selezionare "Leggi reagente" per attivare il lettore di codici 2D. </li><li> Posizionare la fiala reattivo appropriato davanti al lettore di codici 2D tra 0,5-2,5 cm dal coperchio del lettore di codice. NOTA: per esempio, il reagente necessario per la separazione delle cellule NK è CD56. </li><li> Tenere reagente flacone con un angolo di fronte lettore di codici 2D per una lettura ottimale. </li><li> Posizionare il flacone di reagente in posizione corretta cremagliera separatore. </li><li> Evidenziare le posizioni desiderate nella scheda di separazione sullo schermo. </li><li> Dal sottomenu Etichettatura, assegnare un auprogramma di tolabeling. </li><li> Assegnare le cellule di separazione reagente CD56 microsfere di accumulare posizioni 1, 2, 3, e 4. </li><li> Selezionare il programma di separazione "posselwb". </li><li> Selezionare il programma di lavaggio "risciacquo". </li><li> Inserire un volume di campione di 1.500 ml nel sottomenu "Volume" utilizzando il tastierino numerico. </li><li> Selezionare l'opzione "Invio" sulla tastiera. </li><li> Selezionare "Run" per avviare la separazione delle cellule. </li><li> Selezionare "OK" per confermare tale buffer sufficiente è disponibile per l'elaborazione di tutti i campioni. </li></ol> 5. NK cellulare Conte seguito cellulare Separazione <ol><li> Immediatamente dopo separazione cellulare con il separatore cellulare, recuperare la frazione positiva. Lasciare a temperatura ambiente. Questa frazione contiene la popolazione di cellule NK puro desiderato. </li><li> Per ogni singolo campione, eseguire una conta delle cellule utilizzando un emocitometro come da Fase 2.2. <ol><li> Dopo i calcoli, registrare la conta delle cellule. </li></ol></li></ol> 6. citotossicità Assay Preparazione del campione <ol><li> Preparare ed etichettare provette da 1,5 ml per ogni campione / partecipante di conseguenza. </li><li> Pipetta rapporto tra cellule NK e K562 DIO-etichettati desiderato in ogni provetta. NOTA: per esempio, il rapporto desiderato di cellule bersaglio K562 e cellule effettrici NK è 1: 5. </li><li> Centrifugare per 5 min a 135 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere NK-dio etichettato miscela di cellule K562 in 500 ml di mezzi delle cellule NK, senza l'interleuchina-2 (IL-2) e 2-mercaptoetanolo (2-ME) (incompleta NK coltura cellulare media). NOTA: I terreni di coltura delle cellule NK incompleta è Minimum Essential medio di Eagle con bicarbonato di sodio, senza L-glutammina, ribonucleosides e deoxyribonucleosides. </li><li> Aggiungere 5 ml di PI ad ogni provetta. </li><li> Centrifugare per 2 minuti a 163 x g. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Dopo 2 ore di incubazione, centrifuge per 2 min a 163 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in 25 microlitri incompleta terreni di coltura delle cellule NK. </li></ol> 7. Preparazione di spontanea ( "S") Esempio <ol><li> Pipettare 500 ml di cellule K562 DIO-etichettati (concentrazione di 1 x 10 6 cellule / ml) in 1,5 ml di tubo. </li><li> Aggiungere 10 ml di PI ad ogni provetta. </li><li> provetta per centrifuga per 2 min a 163 x g. </li><li> Incubare le cellule a 37 ° C per 2 ore. </li><li> Dopo 2 h di incubazione, centrifugare per 2 min a 163 x g. </li><li> Rimuovere con attenzione il surnatante senza disturbare il pellet. </li><li> Risospendere le cellule in 25 ml incompleta Essential Medium (α-MEM) terreni di coltura delle cellule alfa-minimo. </li></ol> 8. Acquisizione dati con Imaging citofluorimetro <ol><li> Premere il tasto verde all'interno dello sportello anteriore della dell'imaging citofluorimetro per accendere lo strumento. </li><li> Attivare all computer associati imaging citofluorimetro. </li><li> Avviare il flusso di imaging citometro software. </li><li> Fare clic sul pulsante "Avvio" per lavare il sistema e preparare la linea del campione. </li><li> Una volta che il "Avvio" è completa, chiudere la finestra "Calibrations". </li><li> Assegnare i canali: sul lato superiore sinistro, cliccare su ogni canale, al fine di assegnare loro. </li><li> Sul lato destro, fare clic sul pulsante grafico a dispersione per creare 4 a dispersione: Raw Max Pixel _MC_6 vs Area_M06, Crudo Max Pixel _MC_2 vs Area_M02, Crudo Max Pixel _MC_5 vs Area_M05 e FieldArea_M01 vs AspectRatio_M01. </li><li> Iniziare l'analisi di campioni in primo luogo usando il comando "Doppio positivo". <ol><li> Clicca su "Carica". </li><li> Posizionare il tubo da 1,5 ml con il campione "Double Positive" da Piazza di 3,4 a 3,9 nel caricatore del campione. </li><li> Selezionare l'obiettivo 40X nella scheda "ingrandimento". </li><li> Accendere il 405 mW e642 laser MW. </li><li> Accendere il canale "Brightfield". </li><li> Clicca su "Seleziona intensità." </li><li> Sulla base del campione di controllo "Double positivo", determinare l'intensità desiderata per il laser 405 mW quindi il rivelatore non è sovraccarico. Nota: Ad esempio, l'intensità ottimale per questo esperimento è stato fissato a 11 mW. </li></ol></li><li> Dopo il set-up desiderato si ottiene, acquisire i dati. <ol><li> Nella scheda "File di acquisizione", inserire il nome del file in un testo personalizzato. Selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). </li><li> Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a "raccogliere". In genere questo numero varia tra 1.000 a 10.000. </li><li> Clicca su "Acquisisci". NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito, il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata. </li></ol></li><li> Dopo l'acquisizione termina, caricare il campione di controllo successivo - Dio solo il controllo. </li><li> Clicca su "Carica". </li><li> Posizionare il tubo 1,5 ml con l ' "unico Dio" campione nel caricatore di campione. </li><li> Lasciare l'obiettivo 40X nella scheda "ingrandimento" selezionato. </li><li> Lasciare il laser 405 mW acceso. </li><li> Spegnere il laser 642 mW e il canale "Brightfield". NOTA: Ora che la desiderata set-up è stato raggiunto, i dati possono essere acquisiti. </li><li> Nella scheda "File di acquisizione", inserire il nome del file in un testo personalizzato e selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a "raccogliere".. In genere questo numero è 1.000. </li><li> Clicca su "Acquisisci". NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata. </li></ol><li> Ripetere il passaggio 8.10 per il "solo PI" campione di controllo. I campioni sperimentali sono ora pronti per essere raccolti. </li><li> Gestire le remaining campioni sperimentali, tra cui i "Campioni spontanee" S "" come segue: <ol><li> Lasciare l'obiettivo 40X nella scheda "ingrandimento" selezionato. </li><li> Accendere il 405 mW e 642 mW laser. </li><li> Attivare il canale "Brightfield". </li><li> Clicca su "Imposta intensità." </li><li> Nella scheda "File di acquisizione", inserire il nome del file in un testo personalizzato e selezionare una cartella in cui salvare il file di dati (s). Inserire in un testo il nome del file personalizzato. </li><li> Inserire il numero di cellule di acquisire accanto a "raccogliere". </li><li> Fare clic sul pulsante "Acquisisci". NOTA: Una volta che il numero desiderato di cellule viene acquisito il file di dati viene salvato automaticamente nella cartella precedentemente selezionata. </li></ol></li><li> Ripetere il passaggio 8.12 per tutti i campioni sperimentali. </li><li> Dopo che tutti i dati sperimentali e file sono stati raccolti, fare clic sul pulsante "Shutdown" per sterilizzare il sistema. </li> 9. ImaginAnalisi dei campioni g citofluorimetro <ol><li> Aprire il flusso di imaging citometro applicazione software di analisi. </li><li> Sotto "File", aprire un file .RIF sperimentale. </li><li> Costruire una nuova matrice utilizzando i file .RIF singolo colore (Dio-solo il controllo e il controllo PI-only, creato durante fasi 8.10 e 8.11) selezionando "Crea un nuovo Matrix" nella scheda di compensazione nel flusso di immagini citometro software. NOTA: Il software chiederà per la selezione dei file a colori singoli e unirli per creare un file di matrice (estensione del file .ctm), che deve essere selezionato per applicare la compensazione del canale. </li><li> Creare diagrammi di punti utilizzando la funzione di "mattoni" del software. <ol><li> Creare un dot-plot (BrightFieldGradient_RMS vs Frequency) per porta le cellule mirate. Chiama il cancello "Focus" (Figura 1A). </li><li> Utilizzando la porta "Focus", creare un diagramma a punti di Bright Campo Area vs campo luminoso Proporzioni di g mangiato le cellule di singoletto. Chiama il cancello "Single" (Figura 1B). </li><li> Utilizzando la porta "Single", creare un diagramma a punti di Intensity_MC_Ch02 vs Intensity_MC_Ch5. Utilizzare questa trama per identificare e porta Dio-positivo solo le cellule (obiettivi, vivo) e PI-dio cellule doppio positive (obiettivi, morte) (Figura 1C). NOTA: Tutte le trame descritto nei punti 9.4.1, 9.4.2, 9.4.3 e possono essere creati utilizzando la funzione "mattoni" del software. </li></ol></li><li> Fare clic sulla funzione statistica della trama punto per accedere ai numeri cellulari di ogni porta. </li><li> Calcolare la percentuale di bersagli morti nel campione spontanea e campioni sperimentali utilizzando la seguente formula: % bersagli morti in campione = (target #dead x 100) / (# vivono obiettivi + #dead obiettivi) </li><li> Calcolare citotossicità utilizzando la seguente formula: % Citotossicità = [(Experimental dead-spontaneo morto) / (morto 100-spontaneo)] x100 </li></ol>_content "fo: keep-together.within-page =" 1 "&gt; <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54779/54779fig1.jpg"> Figura 1: istogrammi rappresentativi, grafici a dispersione e le immagini per l'analisi attività citotossica. Analisi (A) cella di messa a fuoco. (B) analisi singola cella. Analisi (C) bersaglio colorazione delle cellule. Tutte le determinazioni sono realizzati con l'immagine allegata ad ogni evento. Questo può essere letta in software di analisi, semplicemente cliccando sulla manifestazione sui grafici. (D) immagine rappresentativa di un evento doppietto, che mostra un cellulare per apoptosi NK e un obiettivo K562 dal vivo. CH01, Brightfield. Ch02, DIO. CH05, PI. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54779/54779fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il metodo descritto in questo studio misura direttamente l&#39;attività specifica di cellule NK di un individuo in risposta a stimoli (in questo caso particolare, esercizio prolungato). Tipicamente, le cellule NK sono isolati dal proprio sangue utilizzando gradienti di densità o di separazione delle cellule utilizzando una combinazione di marcatori. Mentre questi metodi sono ampiamente utilizzati, hanno molti svantaggi: sono in termini di tempo, coinvolgono più manipolazioni, e sono fortemente dipendenti dell&#39;utente...

cellule killer naturali sono un elemento essenziale del sistema immunitario innato. Mentre sono molto disciplinati, hanno la capacità di riconoscere ed eliminare le cellule anomale attraverso il contatto cellula-cellula e senza attivazione preventiva 1. Come tali, essi formano una linea veloce di difesa contro le infezioni. Esercizio, particolarmente intenso, ha dimostrato di deprimere transitoriamente il sistema immunitario 2, 3, 4, 5. Cellule NK sono particolarmente soggetti a questo effetto 4, 6, 7, creando una finestra di una maggiore sensibilità alla malattia. Pertanto, lo studio di interventi prima, durante o dopo un intenso esercizio con l&#39;obiettivo di ridurre l&#39;impatto sulla funzione delle cellule NK è di particolare interesse per il benessere degli atleti post-concorsi. 8, a circa l&#39;1% del vano globuli bianchi; 2) le cellule NK sono molto sensibili allo stress e si basano su costante esposizione a condizioni fisiologiche di rimanere vitali e stabile durante la sperimentazione; e 3) test standard per determinare la citotossicità delle cellule NK, come Ficoll gradienti 9 e rilasciare dosaggi 10, sono inaffidabili e inconsistenti. La variabilità intrinseca dei campioni umani composti soltanto questi problemi. campioni umani freschi raccolti durante interventi sono abbastanza regolamentato e difficili da procurare, almeno rispetto ai campioni animali o linee cellulari immortalizzate. Questo riduce la possibilità di ripetere gli esperimenti o aggiungere partecipanti allo studio di coorte per raggiungere significativi soglie statistiche. Collettivamente, questi problemi sostengono la necessità di un protocollo semplificato che permette FOR sia high-throughput e l&#39;analisi ad alta affidabilità di NK attività litica delle cellule in campioni umani. Abbiamo stabilito un flusso di lavoro che riduce il tempo necessario per identificare, isolare e le cellule NK di prova da sangue intero umano, riducendo al minimo l&#39;esposizione a fattori estranei. Il metodo ottimizza l&#39;uso di due strumenti, un sorter magnetico a base cellulare e un flusso di imaging citometro, ed una, T ottimizzata specifico per il dosaggio: rapporto E per consentire il rilevamento di diminuzioni o incrementi di citotossicità delle cellule NK.

<table><tbody><tr><td>Linfoblasti K-562</td><td>ATCC</td><td>CCL-243</td><td></td></tr><tr><td>Terreni di Dulbecco modificati di Iscove</td><td>ATCC</td><td>30-2005</td><td>Alto glucosio, con L-Glutammina, con HEPES, Alfa-filtrato</td></tr><tr><td>sterile Minimo Terreno essenziale</td><td>ATCC</td><td>CRL-2407</td><td>Senza ribonucleosidi e desossiribonucleosidi ma con 2 mM di L-glutammina e 1,5 g/L di bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>Soluzione blu di tripano 0,4%</td><td>Amresco</td><td>K940-100ML</td><td>Soluzione</td></tr><tr><td>di colorazione con ioduro di propridio</td> per colture tissutali <td>BD Pharmingen</td><td>51-66211E</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di marcatura cellulare Vybranto DiO</td><td>Vybranto</td><td>V-22886</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Pro Separator</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-545</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Running Buffer</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-221</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Tampone di lavaggio</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-092-987</td><td></td></tr><tr><td>autoMACS Colonne</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-021-101</td><td></td></tr><tr><td>Sangue intero CD56 MicroBeads, umano</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-875</td><td></td></tr><tr><td>ImageStream X Mark II Citometro a flusso per imaging</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Speedbeads</td><td>Amnis Corporation</td><td>400030</td><td></td></tr><tr><td>0,4-0,7% di ipoclorito (sterilizzatore)</td><td>VWR</td><td>JT9416-1</td><td></td></tr><tr><td>Coltro Clenz</td><td>Beckman Coulter</td><td>8546929</td><td></td></tr><tr><td>70% di isopropanolo (degorizzatore)</td><td>EMD Millipore</td><td>1.3704</td><td></td></tr><tr><td>D-PBS (fluido guaina)</td><td>EMD Millipore</td><td>BSS-1006-B (1X)</td><td>Senza calcio o magnesio</td></tr><tr><td>INSPIRE Software</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Versione Mark II, settembre 2013</td></tr><tr><td>Ideas Software applicativo</td><td>EMD Millipore</td><td></td><td>Versione 6.1, luglio 2014</td></tr></tbody></table>

flusso analisi di citometria di natural killer cellulare lytic attività nel sangue umano intero

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

citotossicità delle cellule NK è una misura ampiamente utilizzato per determinare l&#39;effetto di un intervento esterno sulla funzione delle cellule NK. Tuttavia, la precisione e la riproducibilità di questo test possono essere considerati instabili, sia a causa di errori dell&#39;utente oa causa della sensibilità delle cellule NK di manipolazione sperimentale. Per eliminare questi problemi, un flusso di lavoro che li riduce al minimo è stato stabilito ed è presentato qui. Per illustrare, abbiamo ottenuto campioni di sangue, in vari momenti, da corridori (n = 4), che sono stati sottoposti ad un intenso periodo di esercizio. In primo luogo, le cellule NK sono contemporaneamente identificati e isolati attraverso CD56 tagging e smistamento magnetico-based, direttamente dal sangue intero e da un minimo di un millilitro. Le cellule NK ordinati vengono rimossi di eventuali anticorpi reagenti o tappatura. Essi possono essere contati per stabilire un accurato conteggio delle cellule NK per millilitro di sangue. In secondo luogo, le cellule NK ordinati (effettori cellule o E) possono essere miscelati con 3,3&#39;-Diotadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO) etichettato cellule K562 (cellule bersaglio o T) in un saggio-ottimale 1: 5 T: rapporto E e analizzato utilizzando un flusso-citometria di imaging che permette la visualizzazione di ogni evento e l&#39;eliminazione di falsi positivi o falsi negativi (come doppiette o cellule effettrici). Questo flusso di lavoro può essere completato in circa 4 ore, e consente di ottenere risultati molto stabili anche quando si lavora con campioni umani. Quando disponibile, gruppi di ricerca possono testare diversi interventi sperimentali in soggetti umani, e confrontare le misurazioni attraverso diversi punti di tempo senza compromettere l&#39;integrità dei dati.

Determinazione del numero di cellule NK L'effetto della corsa pesante sul conteggio delle cellule NK nel sangue intero è stato misurato, utilizzando il protocollo di esercizio descritto nella Figura 2. I campioni di sangue sono stati elaborati prima dell'esercizio, immediatamente dopo l'esercizio, 1,5 ore dopo l'esercizio, e, infine, 24 e 48 ore dopo il prelievo di sangue iniziale. La concentrazione di cellule NK per millilitro di sangue intero è stato misurato per ...

Questo lavoro descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida della conta delle cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la conta delle cellule NK e i livelli di attivazione citotossica in un campione di sangue intero umano in modo rapido, affidabile e stabile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande in campo immunologico, come ad esempio: Quali sono gli effetti degli interventi esterni sulla bioattività delle cellule NK? Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce e accurata, pur fornendo risultati riproducibili attraverso gli esperimenti.Per isolare le cellule NK dal sangue intero umano, posizionare prima le provette da 15 millilitri etichettate come campione di sangue intero, frazione negativa e frazione positiva nelle posizioni appropriate nel rack delle provette del separatore cellulare. Quando tutte le provette sono caricate, inserire il rack del separatore sul mini-campionatore per l'etichettatura automatica e selezionare Reagente nel menu per evidenziare la posizione in cui la fiala verrà posizionata sul rack. Selezionare Leggi reagente per attivare il lettore di codici 2D e tenere la fiala di reagente appropriata davanti al lettore di codici 2D con un angolo compreso tra 0,5 e 2,5 centimetri dal coperchio del lettore di codici.Posizionare la fiala di lettura nella posizione appropriata del rack separatore. Successivamente, nella scheda Separazione, evidenziare le posizioni desiderate. Quindi apri il sottomenu Etichettatura e seleziona un programma di etichettatura automatica.Assegnare le microsfere del reagente per la separazione cellulare alle posizioni 1, 2, 3 e 4 del rack. E selezionare il programma di separazione Posselwb. Selezionare il programma Risciacquo Lavaggio.Immettere 1500 microlitri per il volume del campione nel sottomenu Volume e premere Invio. Quindi fare clic su Esegui per iniziare la separazione delle celle. Fare clic su OK per confermare che è disponibile un buffer sufficiente per l'elaborazione di tutti i campioni.Per preparare un campione del saggio di citotossicità, etichettare prima le provette da 1,5 millilitri per ciascun campione e/o partecipante, a seconda dei casi, e convogliare il rapporto desiderato tra le cellule NK e le cellule K562 marcate con DIO in ciascuna provetta. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quindi, risospendere la miscela cellulare in 500 microlitri di terreno cellulare NK incompleto ed etichettare le cellule in ciascuna provetta con 5 microlitri di ioduro di propidio.Raccogliere le cellule tramite un'altra centrifugazione e incubare la coltura di ritaglio a 37 gradi Celsius per due ore. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule nelle stesse condizioni di centrifugazione e risospendere il pellet in 25 microlitri di terreno di coltura cellulare NK fresco incompleto. Per analizzare le cellule mediante citometria a flusso, fare clic sul pulsante di avvio nel software del citometro a flusso per imaging per lavare il sistema.Quindi, fai clic sul pulsante scatterplot per creare quattro scatterplot e carica il doppio tubo di controllo positivo. Utilizzando il campione di controllo a doppio positivo, determinare l'intensità desiderata per il laser da 405 milliwatt, in modo che il rivelatore non venga sovraccaricato, e impostare l'imager per acquisire il numero appropriato di conteggi di celle. L'impostazione del laser da 405 milliwatt a un'intensità adatta per il rilevamento di DIO e PI richiederà esperienza con entrambi i coloranti e il campo di rilevamento del citometro a flusso.Al termine dell'acquisizione del campione di controllo a doppio positivo, caricare il campione di controllo solo DIO, selezionare l'obiettivo 40X e spegnere il laser da 642 milliwatt e il canale in campo chiaro. Allevare il numero appropriato di cellule e ripetere l'acquisizione per il campione di solo ioduro di propidio. Quando tutti i campioni di controllo sono stati eseguiti, riaccendere il laser da 405 milliwatt e il canale Brightfield e fare clic su Imposta intensità.Quindi, nella scheda Acquisizione file, immettere un nome file personalizzato e selezionare una cartella per il salvataggio dei file di dati. Quindi, inserisci il numero di celle da acquisire. Caricare la prima provetta sperimentale e fare clic sul pulsante Acquisisci.Quando tutti i campioni sono stati analizzati, aprire l'applicazione software di analisi del citometro a flusso per immagini e aprire un singolo file RIF sperimentale. Nella scheda Retribuzione, seleziona Crea nuova matrice. Il software richiederà la selezione dei singoli file di colore e li unirà per creare un file matrice da selezionare per l'applicazione della compensazione del canale.Utilizzare la funzione Blocchi predefiniti per impostare i grafici a punti appropriati. Quindi fare clic sulla funzione delle statistiche per accedere ai numeri di cella in ogni cancello. In questo esperimento rappresentativo, sono stati prelevati campioni di sangue come indicato e la concentrazione di cellule NK per millilitro di sangue intero è stata misurata per ogni corridore e, in media, per ogni punto temporale.Tre corridori su quattro hanno presentato un lieve aumento simile della conta delle cellule NK dopo l'esercizio. Immediatamente seguito da un forte calo, prima di tornare lentamente alla normalità, da 24 a 48 ore dopo la fine dell'evento. In media, la conta delle cellule NK è diminuita 1,5 ore dopo l'esercizio, ma è tornata a livelli quasi normali dopo 24 ore.Dopo aver calcolato la conta cellulare, l'attività citotossica delle cellule NK è stata immediatamente analizzata come appena dimostrato, con una diminuzione media della citotossicità delle cellule NK immediatamente e 1,5 ore dopo la fine dell'evento di esercizio, che è aumentata significativamente entro 24 ore dopo l'esercizio. La citotossicità NK è rimasta elevata rispetto ai livelli pre-esercizio, anche se in modo non significativo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa quattro ore se eseguita correttamente.Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere e caratterizzare la conta delle cellule NK e l'attività citotossica da campioni di sangue umano in modo idropico riproducibile.

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Questo video dimostra l'attività litica delle cellule natural killer contro le cellule bersaglio colorate in modo fluorescente. Il metodo consente la misurazione della citotossicità indotta dalle cellule NK colorando le cellule morte e utilizzando un citometro a flusso per quantificare le cellule bersaglio vive e morte.

Preparazione del campione per il saggio di citotossicità cellulo-mediata Natural Killer per l'analisi citofluorimetrica

Questo video mostra l'esecuzione di un test di rilascio di lattato deidrogenasi per determinare la citotossicità delle cellule natural killer (NK) contro le cellule tumorali bersaglio. Il test quantifica il rilascio dell'enzima lattato deidrogenasi citoplasmatico dalle cellule tumorali misurando l'assorbanza del prodotto di colore rosso formato.

Un test in vitro per la valutazione della citotossicità delle cellule natural killer contro le cellule tumorali

Questo protocollo descrive un sensibile test di citotossicità basato su cellule. Enumerando la diminuzione della frequenza delle cellule T CD4+ bersaglio vive in presenza di un numero crescente di cellule T CD8+ effettrici, questo test consente la valutazione diretta dell'attività citolitica delle cellule T CD8+ antigene-specifiche.

Saggio di citometria a flusso cellulare per misurare l'attività citotossica

Un metodo semplice ed affidabile è descritto qui di analizzare un insieme di funzioni delle cellule NK come degranulazione, citochine e chemochine ai differenti sottopopolazioni di cellule NK.

Citometria a flusso basato su test per il monitoraggio delle funzioni delle cellule NK

Un metodo di basato su citometria di flusso per determinare quantitativamente l'attività citotossica delle cellule natural killer di umane è mostrato qui.

Un'analisi di citotossicità di base di citometria a flusso per la valutazione dell'attività delle cellule NK umane

L'evasione dell'eradicazione mediata da cellule naturali (NK) da parte delle cellule tumorali è importante per l'inizio e la progressione del cancro. Qui, presentiamo due protocolli non basati sulla radioattività per valutare la citotossicità mediata dalla cellula NK verso le cellule tumorali epatiche. Inoltre, viene presentato un terzo protocollo per analizzare la migrazione delle celle NK.

Misurazione della citotossicità e della migrazione mediata da cellule Killer naturali nel contesto delle cellule tumorali epatiche

Un protocollo per lo studio di eventi guidati da FcγRIIIa da anticorpi terapeutici in cellule natural killer umane è descritto qui. Questa piattaforma di stimolazione artificiale consente l'interrogazione delle funzioni emozionali a valle come la degranulazione, la produzione di chemochine / citochine e le vie di segnalazione mediate dalle porzioni FcγRIIIa e Fc degli anticorpi coinvolti nel legame.

Valutazione degli eventi delle cellule natural killer umane guidati dall'impegno di FcγRIIIa nella presenza di anticorpi terapeutici

In questo articolo, descriviamo un metodo per misurare la glicolysi e la respirazione mitocondriale nelle cellule dell'assassino naturale umano primario (NK) isolate dal sangue periferico, a riposo o dopo l'attivazione indotta da IL15. Il protocollo descritto potrebbe essere facilmente esteso alle cellule NK umane primarie attivate da altre citochine o stimoli solubili.

Analisi del metabolismo delle cellule dell'assassino naturale umano

Questo protocollo descrive un metodo label-free per l'analisi rapida di singole cellule della conta e dell'attività delle cellule natural killer (NK) utilizzando la tecnologia di imaging shadow senza lenti. Questo metodo quantifica i cambiamenti morfologici nelle singole cellule NK mediante analisi computerizzata dei loro modelli di diffrazione.

Piattaforma di imaging senza lenti distribuibile sul campo per un'analisi rapida e senza marcatura dell'attivazione delle cellule natural killer

Questo protocollo fornisce un flusso di lavoro in vitro standardizzato per la misurazione coerente della citotossicità naturale, mediata dai recettori degli antigeni chimerici e dipendente dagli anticorpi delle cellule naturali umane, utilizzando imaging a cellule vive e citometria di flusso.

Quantificazione della citotossicità delle cellule NK potenziata dai recettori antigenici chimerici e dagli anticorpi terapeutici tramite imaging a cellule vive e citometria a flusso

Scopri un metodo di citometria a flusso per analizzare l'attività citotossica delle cellule NK nel sangue umano intero. Questa tecnica offre risultati rapidi, accurati e riproducibili per la ricerca immunologica.

Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero

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