Flusso analisi di citometria di Natural Killer cellulare Lytic attività nel Sangue umano intero
17 marzo 2017
Questo lavoro descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida della conta delle cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano.
L'obiettivo generale di questo esperimento è determinare la conta delle cellule NK e i livelli di attivazione citotossica in un campione di sangue intero umano in modo rapido, affidabile e stabile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande in campo immunologico, come ad esempio: Quali sono gli effetti degli interventi esterni sulla bioattività delle cellule NK? Il vantaggio principale di questa tecnica è che è veloce e accurata, pur fornendo risultati riproducibili attraverso gli esperimenti.
Per isolare le cellule NK dal sangue intero umano, posizionare prima le provette da 15 millilitri etichettate come campione di sangue intero, frazione negativa e frazione positiva nelle posizioni appropriate nel rack delle provette del separatore cellulare. Quando tutte le provette sono caricate, inserire il rack del separatore sul mini-campionatore per l'etichettatura automatica e selezionare Reagente nel menu per evidenziare la posizione in cui la fiala verrà posizionata sul rack. Selezionare Leggi reagente per attivare il lettore di codici 2D e tenere la fiala di reagente appropriata davanti al lettore di codici 2D con un angolo compreso tra 0,5 e 2,5 centimetri dal coperchio del lettore di codici.
Posizionare la fiala di lettura nella posizione appropriata del rack separatore. Successivamente, nella scheda Separazione, evidenziare le posizioni desiderate. Quindi apri il sottomenu Etichettatura e seleziona un programma di etichettatura automatica.
Assegnare le microsfere del reagente per la separazione cellulare alle posizioni 1, 2, 3 e 4 del rack. E selezionare il programma di separazione Posselwb. Selezionare il programma Risciacquo Lavaggio.
Immettere 1500 microlitri per il volume del campione nel sottomenu Volume e premere Invio. Quindi fare clic su Esegui per iniziare la separazione delle celle. Fare clic su OK per confermare che è disponibile un buffer sufficiente per l'elaborazione di tutti i campioni.
Per preparare un campione del saggio di citotossicità, etichettare prima le provette da 1,5 millilitri per ciascun campione e/o partecipante, a seconda dei casi, e convogliare il rapporto desiderato tra le cellule NK e le cellule K562 marcate con DIO in ciascuna provetta. Raccogliere le cellule mediante centrifugazione e rimuovere con cura il surnatante senza disturbare il pellet cellulare. Quindi, risospendere la miscela cellulare in 500 microlitri di terreno cellulare NK incompleto ed etichettare le cellule in ciascuna provetta con 5 microlitri di ioduro di propidio.
Raccogliere le cellule tramite un'altra centrifugazione e incubare la coltura di ritaglio a 37 gradi Celsius per due ore. Al termine dell'incubazione, centrifugare le cellule nelle stesse condizioni di centrifugazione e risospendere il pellet in 25 microlitri di terreno di coltura cellulare NK fresco incompleto. Per analizzare le cellule mediante citometria a flusso, fare clic sul pulsante di avvio nel software del citometro a flusso per imaging per lavare il sistema.
Quindi, fai clic sul pulsante scatterplot per creare quattro scatterplot e carica il doppio tubo di controllo positivo. Utilizzando il campione di controllo a doppio positivo, determinare l'intensità desiderata per il laser da 405 milliwatt, in modo che il rivelatore non venga sovraccaricato, e impostare l'imager per acquisire il numero appropriato di conteggi di celle. L'impostazione del laser da 405 milliwatt a un'intensità adatta per il rilevamento di DIO e PI richiederà esperienza con entrambi i coloranti e il campo di rilevamento del citometro a flusso.
Al termine dell'acquisizione del campione di controllo a doppio positivo, caricare il campione di controllo solo DIO, selezionare l'obiettivo 40X e spegnere il laser da 642 milliwatt e il canale in campo chiaro. Allevare il numero appropriato di cellule e ripetere l'acquisizione per il campione di solo ioduro di propidio. Quando tutti i campioni di controllo sono stati eseguiti, riaccendere il laser da 405 milliwatt e il canale Brightfield e fare clic su Imposta intensità.
Quindi, nella scheda Acquisizione file, immettere un nome file personalizzato e selezionare una cartella per il salvataggio dei file di dati. Quindi, inserisci il numero di celle da acquisire. Caricare la prima provetta sperimentale e fare clic sul pulsante Acquisisci.
Quando tutti i campioni sono stati analizzati, aprire l'applicazione software di analisi del citometro a flusso per immagini e aprire un singolo file RIF sperimentale. Nella scheda Retribuzione, seleziona Crea nuova matrice. Il software richiederà la selezione dei singoli file di colore e li unirà per creare un file matrice da selezionare per l'applicazione della compensazione del canale.
Utilizzare la funzione Blocchi predefiniti per impostare i grafici a punti appropriati. Quindi fare clic sulla funzione delle statistiche per accedere ai numeri di cella in ogni cancello. In questo esperimento rappresentativo, sono stati prelevati campioni di sangue come indicato e la concentrazione di cellule NK per millilitro di sangue intero è stata misurata per ogni corridore e, in media, per ogni punto temporale.
Tre corridori su quattro hanno presentato un lieve aumento simile della conta delle cellule NK dopo l'esercizio. Immediatamente seguito da un forte calo, prima di tornare lentamente alla normalità, da 24 a 48 ore dopo la fine dell'evento. In media, la conta delle cellule NK è diminuita 1,5 ore dopo l'esercizio, ma è tornata a livelli quasi normali dopo 24 ore.
Dopo aver calcolato la conta cellulare, l'attività citotossica delle cellule NK è stata immediatamente analizzata come appena dimostrato, con una diminuzione media della citotossicità delle cellule NK immediatamente e 1,5 ore dopo la fine dell'evento di esercizio, che è aumentata significativamente entro 24 ore dopo l'esercizio. La citotossicità NK è rimasta elevata rispetto ai livelli pre-esercizio, anche se in modo non significativo. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa quattro ore se eseguita correttamente.
Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere e caratterizzare la conta delle cellule NK e l'attività citotossica da campioni di sangue umano in modo idropico riproducibile.
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Panoramica
Questo studio descrive un flusso di lavoro avanzato per la determinazione accurata e rapida del numero di cellule NK (Natural Killer) e della citotossicità delle cellule NK in campioni di sangue umano. Il metodo mira a fornire risultati affidabili che possono migliorare la comprensione nella ricerca immunologica.
Componenti Chiave dello Studio
Ambito Scientifico
- Immunologia
- Biologia cellulare
- Ricerca clinica
Sfondo
- I linfociti NK svolgono un ruolo fondamentale nella risposta immunitaria.
- Comprendere l'attività dei linfociti NK può orientare interventi terapeutici.
- I metodi attuali possono mancare di velocità e accuratezza.
- Questo studio introduce un approccio innovativo per affrontare queste limitazioni.
Scopo dello studio
- Determinare il numero di cellule NK in campioni di sangue umano.
- Valutare i livelli di attivazione citotossica delle cellule NK.
- Sviluppare un metodo rapido e affidabile per la ricerca immunologica.
Metodi Utilizzati
- Isolamento di cellule NK da campioni di sangue intero.
- Utilizzo di un separatore cellulare per l'elaborazione dei campioni.
- Etichettatura automatica dei campioni per garantire accuratezza.
- Attivazione di un lettore di codice 2D per l'identificazione dei reagenti.
Risultati principali
- Il metodo fornisce risultati riproducibili tra diversi esperimenti.
- Determinazione rapida del numero di cellule NK e della loro citotossicità.
- Dati affidabili che possono supportare ulteriori studi immunologici.
- Potenzialità di rispondere a domande riguardanti la bioattività delle cellule NK.
Conclusioni
- Questo flusso di lavoro migliora lo studio delle cellule NK in campioni umani.
- Offre un equilibrio tra velocità, accuratezza e riproducibilità.
- Il metodo può facilitare la ricerca sugli interventi sulle cellule NK.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La misurazione accurata e riproducibile della citotossicità delle cellule natural killer (NK) è fondamentale per valutare interventi immunomodulatori nello sviluppo preclinico e clinico. Questo flusso di lavoro consente una quantificazione rapida e stabile del numero di cellule NK e della loro attività litica a partire da piccoli volumi di sangue intero umano, supportando la validazione degli obiettivi terapeutici e la riduzione dei rischi meccanicistici nei percorsi di immunoterapia. Riducendo la variabilità del saggio e gli errori dipendenti dall'operatore, il metodo aumenta l'affidabilità predittiva nella ricerca traslazionale e nelle fasi iniziali della scoperta.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Scoperta Precoce e Validazione del Bersaglio
- Valore scientifico: Consente l'analisi di ipotesi terapeutiche riguardo alla bioattività delle cellule NK a seguito di interventi farmacologici o biologici.
- Valore operativo: Fornisce una quantificazione riproducibile delle cellule NK e letture della citotossicità a partire da soli 1 mL di sangue intero umano, riducendo i requisiti di campione.
- Valore predittivo: Supporta la validazione funzionale dei bersagli collegando l'attività delle cellule effettrici a esiti citotossici misurabili in un sistema rilevante per la malattia.
Sviluppo di screening e saggi
- Valore scientifico: Genera letture quantitative basate sulla citometria a flusso con imaging, in grado di distinguere eventi citotossici veri da falsi positivi come doppietti o detriti.
- Valore operativo: Standardizza il rapporto effettore:bersaglio (E:T) a 1:5 utilizzando cellule bersaglio K562 marcate con DiO, consentendo la riproducibilità del saggio in diversi punti temporali e condizioni sperimentali.
- Valore della piattaforma: Compatibile con piattaforme di citometria a flusso con imaging, permettendo la visualizzazione di ogni evento ed eliminando i falsi negativi, sostenendo flussi di lavoro per screening scalabili.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Valore scientifico: Permette il monitoraggio longitudinale dell'attività delle cellule NK in soggetti umani, consentendo la correlazione tra modifiche citotossiche e parametri farmacodinamici o endpoint clinici.
- Valore operativo: Consente di testare più interventi sperimentali in diversi punti temporali senza compromettere l'integrità dei dati, supportando disegni di studio adattivi.
- Continuità traslazionale: Collega le informazioni meccanicistiche della fase di scoperta con la validazione preclinica fornendo dati funzionali sulle cellule NK rilevanti per l'uomo.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Il metodo si inserisce nel percorso di scoperta che va dalla validazione del bersaglio all'identificazione del capostazione fino alla valutazione preclinica, in particolare per agenti immunomodulatori in cui il coinvolgimento delle cellule NK rappresenta un meccanismo d'azione.
- Biologia della scoperta: Supporta la verifica delle ipotesi e la chiarificazione dei percorsi misurando l'attivazione citotossica delle cellule NK come lettura funzionale della modulazione immunitaria.
- Screening: Fornisce cellule NK purificate e pronte per il saggio, con marcatura standardizzata e controlli di compensazione, garantendo riproducibilità nello screening di composti o prodotti biologici.
- Analisi: Permette misurazioni quantitative di variabili dipendenti (numero di cellule NK per mL, percentuale di attivazione citotossica) che informano l'analisi statistica e i confronti tra condizioni.
- Ricerca traslazionale: Collega i saggi di citotossicità in vitro alle risposte ematiche umane ex vivo, aumentando il valore predittivo per la traduzione clinica.
- Riutilizzo aziendale: Stabilisce un flusso di lavoro standardizzato e riutilizzabile per la valutazione funzionale delle cellule NK in diversi progetti, riducendo la necessità di sviluppare nuovamente metodi.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva nei meccanismi mediati dalle cellule NK, riducendo i falsi indizi nello sviluppo dell'immunoterapia.
- Valore operativo: Fornisce risultati rapidi e stabili (circa 4 ore) con un intervento manuale minimo, migliorando la produttività del laboratorio.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate su prosegui/non prosegui fornendo dati immunodinamici affidabili fin dalle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione dei candidati in base alla modulazione dell'attività delle cellule NK, adeguata al livello di rischio.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nella separazione cellulare, nella compensazione della citometria a flusso e nell'analisi basata sull'imaging.
- È subordinato all'accesso a un separatore cellulare con etichettatura automatica e a un citometro a flusso con imaging dotato di capacità di rilevamento laser e fluorescenza.
- Necessita della standardizzazione dei volumi dei reagenti, dei tempi di incubazione e delle strategie di gating tra diversi utenti e sedi.
- L'adattamento a sistemi modello alternativi potrebbe richiedere la validazione dei marcatori delle cellule NK e della compatibilità delle cellule bersaglio.
- I limiti pratici includono la sensibilità delle cellule NK ai ritardi nella manipolazione e la necessità di campioni di sangue freschi per mantenere vitalità e funzionalità.
