Utilizzando la tecnologia di stampa 3D per unire RM con Istologia: Un protocollo per Brain Sezioni

L'obiettivo generale di questo protocollo è allineare con precisione i volumi delle immagini di risonanza magnetica con sezioni di istologia attraverso la creazione di supporti cerebrali personalizzati in 3D e cassette per affettare. Sebbene questo video si concentri sul tessuto cerebrale estratto dal marmoseto, questo protocollo può essere applicato a qualsiasi cervello, che provenga da un roditore, da una scimmia non umana o da un essere umano. Preparare una postazione di lavoro come descritto nel protocollo.

Riempire il tubo con Fomblin e garza fino al segno di 20 millilitri. Comprimere la garza per rimuovere le bolle d'aria durante l'operazione. Asciugare delicatamente il cervello dal formalina.

Inserire quindi il cervello con la parte anteriore rivolta verso il fondo del tubo. Fissare con cura il cervello all'interno del tubo utilizzando garza attorno ai lati del cervello per mantenerne la posizione. Riempire il resto del tubo con garza e Fomblin.

Rimuovere con attenzione le bolle d'aria durante l'operazione. Quindi fissare il tappo e sigillare il tubo con paraffina. Contrassegnare il tappo e allinearlo con la scissura interemisferica.

Quindi avvolgere la provetta in un tovagliolo di carta e inserirla nella bobina con il segno nella posizione centrale superiore. Inserire la bobina nello scanner MRI. Dopo l'acquisizione e la post-elaborazione, otteniamo un'immagine pesata in T2 che possiamo utilizzare per creare un modello digitale del cervello.

Aprire la risonanza magnetica in orientamento coronale. Quindi utilizzare gli strumenti di trasformazione per ricampionare l'immagine a voxel isotropi di 1 millimetro. Successivamente, applicare un filtro di riduzione del rumore non lineare.

Selezionare la tabella di ricerca dei display. Quindi fare clic sul pulsante Soglia doppia. Trascinare il cursore sul grafico per coprire l'intero cervello.

Crea una maschera binaria del cervello utilizzando l'algoritmo di segmentazione Soglia basato su min/max. Inserisci il valore situato nell'angolo in basso a sinistra del grafico di intensità, appena sotto la scala, nel campo Limite inferiore. Quindi seleziona Binario e deseleziona Inverti soglia.

Selezionare l'algoritmo morfologico, riempimento dei fori. Selezionare l'opzione Elabora in 2,5D. Per riempire lo spazio tra il cervelletto e la corteccia, selezionare la VOI lineare.

Tracciare un collegamento tra il cervelletto e la corteccia su entrambi i lati del cervello nel punto più laterale. Continuare a tracciare i collegamenti tra le VOI attraverso il cervello. Convertire le VOI in una maschera binaria.

Utilizzare il calcolatore di immagini per combinare le maschere binarie del VOI e del cervello selezionando l'operazione OR. Selezionare Promuovi tipo di immagine di destinazione. Selezionare ora l'algoritmo morfologico: riempi i buchi.

E selezionare Elabora in 2,5D. Selezionare l'algoritmo Estrai superficie, selezionare Immagine maschera, inserire un nome e quindi scegliere il tipo di file ply. Gli spazi nella scatola di taglio corrispondenti alla posizione del piano della sezione possono essere posizionati a partire dalla parte anteriore del cervello, dalla parte posteriore del cervello o rispetto a un'area di interesse, come ad esempio le lesioni nella sostanza bianca visibili qui.

Utilizzando il VOI a forma di scatola, disegnare un rettangolo attorno al cervello. Copiare e incollare la scatola sul numero di fette di risonanza magnetica corrispondente allo spessore previsto degli intervalli tra le lame. Successivamente, avanzare del numero di fette di risonanza magnetica per ogni sezione e ricomporre la scatola come fatto in precedenza per creare un altro intervallo tra le lame.

Ripetere questo processo attraverso il cervello. Invertire le VOI della scatola in una maschera binaria. Quindi estrarre la superficie utilizzando Estrai superficie come fatto in precedenza per il cervello.

Selezionare la maschera binaria del gap della lama. Utilizzare la matematica dell'immagine per moltiplicarla per 10.000. Quindi utilizzare il calcolatore di immagini per aggiungere la maschera binaria moltiplicata alla risonanza magnetica isotropica ricampionata.

Ora, selezionando la vista triplanare, è possibile visualizzare in tre viste ortogonali una mappa MRI a lame che mostra la posizione in cui il cervello verrà sezionato. In Netfabb Professional, selezionare Aggiungi parte. Quindi selezionare il modello Blade Gap e i modelli ply del cervello.

Selezionare il modello del cervello e fare clic sulla modalità di riparazione. Utilizzare il pulsante di selezione shell per selezionare il cervello. Quindi alternare la selezione alle altre shell ed eliminarle.

Quindi applicare la riparazione e rimuovere la parte vecchia. Con il cervello selezionato, scegliere Sposta. Fare clic sull'origine e registrare i parametri nei riquadri X, Y e Z.

Sono necessari per mantenere la posizione del gioco della lama. Fare clic su traduci. E chiudere la finestra.

Selezionare il modello Blade Gap e tradurlo utilizzando i parametri registrati nel passaggio precedente. Selezionare il modello del cervello e fare clic sulla modalità di riparazione. Utilizzare il pulsante di selezione della shell per selezionare il cervello.

Quindi selezionare Triangoli lisci. Inserire quattro come numero di iterazioni. E selezionare Prevenire il restringimento del volume.

Selezionare Riduci triangoli e inserire 200000 nel campo Conta triangoli obiettivo. Quindi selezionare Riparazione automatica ed eseguire una riparazione predefinita. Applicare la riparazione.

Quindi esportare il modello cerebrale levigato in formato STL. Importare il modello cerebrale levigato in Meshmixer. Utilizzare gli strumenti di scultura per levigare le aree disegnando con le VOI a linea.

E correggere eventuali altri difetti minori del modello. Importare il modello cerebrale levigato e modificato in Netfabb Professional. Quindi aggiungere il pezzo, parti del taglia-cervello per marmoset.

Selezionare le shell per parti. Quindi rinominare ogni parte come descritto nel protocollo. Utilizzando le impostazioni di selezione descritte nel protocollo, fare clic e trascinare le parti per posizionare il cervello al centro del riquadro.

Fare clic e trascinare le parti per regolare la profondità del cervello all'interno del riquadro. Selezionare il modello del cervello lisciato e modificato, quindi nel modello ritagliato scegliere l'operazione booleana. Fare clic sul modello del cervello per farlo diventare rosso.

Selezionare la sottrazione booleana. Applicare i calcoli. Selezionare la casella per gli sbalzi che impedirebbero un corretto posizionamento del cervello.

Fare riferimento alla sezione supplementare del protocollo per un metodo per rimuoverli. Selezionare il modello di spaziatura della lama e fare clic su sposta. Registrare alla posizione Z.

Questa sarà la posizione del taglio più posteriore. Chiudere quindi la finestra. Selezionare la lama tra le parti del taglia-cervello e fare clic su Sposta.

Inserire il valore Z del passaggio precedente. Inserire i valori attuali delle posizioni X e Y. Selezionare la traslazione assoluta e tradurre.

Fare clic su Duplica. Se lo spessore della sezione è costante, come mostrato qui, inserire il numero totale di lame e il conteggio totale e il conteggio Z, quindi inserire lo spessore della sezione nel campo Intervallo Z. Quindi selezionare duplica.

Selezionare la parte della lama del microtomo tra i componenti del taglia-cervello. Ripetere gli stessi passaggi di spostamento e duplicazione effettuati per la parte della lama. Selezionare tutte le lame del microtomo e il supporto principale della lama, quindi fare clic sull'operazione booleana.

Selezionare tutte le lame del microtomo per renderle rosse e fare clic sulla sottrazione booleana. Quindi applicare i calcoli. Entrare in modalità riparazione e selezionare riparazione automatica.

Eseguire una riparazione estesa e applicare la riparazione. Esportare il supporto della lama come STL. Selezionare tutte le lame, il contenitore principale e secondario e il modello del cervello modificato e levigato, quindi fare clic sull'operazione booleana.

Utilizzare la finestra di selezione delle Parti per rendere rosse tutte le Parti, ad eccezione della scatola principale. Quindi selezionare la sottrazione booleana. Applicare i calcoli.

Entra nella modalità di riparazione e seleziona la casella per i bordi taglienti che potrebbero danneggiare il cervello. Questi possono essere riparati nella modalità di riparazione di Netfabb o utilizzando gli strumenti di scultura in Meshmixer.

Quindi selezionare Riparazione automatica. Eseguire una Riparazione estesa. Quindi applicare la riparazione.

Esportare la scatola cerebrale come STL. In Cura, selezionare Carica e importa la Scatola Cerebrale. Fare clic sul pulsante Ruota.

Quindi fare clic e trascinare per appiattire la scatola. Modificare le impostazioni di stampa come indicato nel protocollo. Quindi salvare il percorso utensile.

Seguire lo stesso procedimento per il supporto della lama e duplicare anche l'oggetto. Quindi salvare il percorso utensile. Dopo aver applicato uno strato sottile di colla al piatto di stampa, stampare la scatola per il cervello e i supporti delle lame sulla stampante 3D utilizzando le impostazioni descritte nel protocollo.

Dopo il completamento delle stampe, il cervello può essere preparato per il taglio. Allestire una postazione di lavoro come descritto nel protocollo. Posizionare con attenzione il cervello nella scatola e assicurarsi che sia ben fissato.

Posizionare le lame del microtomo nel porta-lame negli appositi alloggiamenti della scatola. Indossando guanti protettivi, premere saldamente sui porta-lame. Applicare una pressione lenta e bilanciata per tagliare il cervello.

Rimuovere le sezioni una alla volta a partire dalla parte anteriore del cervello. Anche se questo approccio è semplice, il metodo richiede numerosi passaggi e l'utilizzo di diversi tipi di software; gli sperimentatori dovrebbero prendere familiarità con le interfacce utente prima di iniziare la procedura. Questo flusso di lavoro riassume il protocollo per la realizzazione della scatola taglia-cervello per il marmoseta.

Il cervello viene fissato con formalina ed è acquisita una risonanza magnetica pesata in T2 a 150 micron. Le immagini vengono elaborate e sogliate per creare una maschera binaria. Successivamente, la superficie viene renderizzata mediante un software di modellazione 3D.

Una sottrazione booleana tra un modello di affettatore e il modello cerebrale genera il modello digitale dell'affettatore cerebrale. La scatola per l'affettatura del cervello viene quindi stampata con una stampante 3D. Successivamente, il cervello viene posizionato saldamente all'interno della scatola per l'affettatura al fine di essere tagliato.

Una volta che il cervello è stato sezionato, un confronto visivo tra le immagini di risonanza magnetica in vivo e quelle post mortem e le immagini delle superfici superficiali delle fette rivela una buona corrispondenza nell'orientamento attraverso molteplici fette. Un confronto più accurato tra la risonanza magnetica post mortem ad alta risoluzione e le sezioni istologiche colorate con LFB CV provenienti da diverse fette cerebrali dimostra una corrispondenza precisa e costante in tutte le strutture del cervello del babbuino. In questo modello animale di sclerosi multipla, gli animali sviluppano lesioni della sostanza bianca diffuse in tutto il cervello.

Utilizzando questa tecnica, piccole lesioni rilevate con la Risonanza Magnetica In Vivo possono essere monitorate sia su sezioni di Risonanza Magnetica post-mortem che su sezioni istologiche. L'istologia e la Risonanza Magnetica post-mortem possono inoltre rivelare lesioni altrimenti non individuate con la Risonanza Magnetica In Vivo. In questo caso, la Risonanza Magnetica In Vivo non ha mostrato evidenze convincenti di un segnale iperintenso normale che suggerisse lesioni in uno qualsiasi dei tratti ottici.

Tuttavia, nella risonanza magnetica post-mortem, sono state osservate iperintensità del segnale nel tratto ottico. E queste aree corrispondevano esattamente alle lesioni mielinizzate osservate nella sezione istologica LFB CV. Pertanto, in conclusione, la metodologia qui presentata consente ai ricercatori di valutare con precisione la patologia alla base dei reperti di risonanza magnetica.

Riteniamo che si tratti di un approccio promettente per l'identificazione di nuovi biomarcatori per malattie che coinvolgono il cervello e per specifici processi patologici come l'infiammazione e la rimielinizzazione.