Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

L'obiettivo generale di questa metodologia di test PCR in tempo reale è quello di rilevare insieme agenti patogeni basati su DNA e RNA in modo ad alto rendimento. L'acido nucleico proveniente da campioni clinici sarà pre-amplificato con un pool di primer comune caricato su una piastra OpenArray e analizzato per la presenza di agenti patogeni. Questo metodo può aiutare a promuovere gli sforzi di sorveglianza OneHealth per le malattie infettive.

Rispetto alle tecniche tradizionali, questo metodo consente di testare più campioni per più bersagli senza competere tra loro, migliorando così l'efficienza dei test. Il metodo utilizza una piastra PCR personalizzata su scala nanometrica. Gli inneschi e le sonde vengono stampati sui bordi dei fori passanti e i campioni vengono caricati utilizzando un manipolatore di liquidi.

Dimostreremo il metodo su campioni clinici in fase di test per un pannello di patogeni respiratori di cavalli e cani. Per iniziare questa procedura, progettare la piastra come descritto nel protocollo di testo. La piastra qui utilizzata è configurata con 18 bersagli in triplice copia.

Aggiungere il terreno ai tamponi e ai lavaggi tracheali in modo che ci siano almeno uno o due millilitri di liquido. Agitare energicamente il tampone e il DMEM nel tubo. Quindi, utilizzare una pipetta per trasferire circa 1 millilitro di terreno in una nuova provetta.

Aggiungere 235 microlitri di tampone di lisi e 175 microlitri di campione a ciascuna provetta a microsfere. Procedere con il protocollo del produttore per estrarre l'acido nucleico totale. Prepararsi per la trascrizione inversa e la pre-amplificazione dell'acido nucleico o del preamplificatore come descritto nel protocollo di testo, verificando prima la mappa del campione.

Aggiungere 8,5 microlitri di preamp master mix e 5,5 micro litri di campione di DNA/RNA a ciascun pozzetto di una piastra standard a 96 pozzetti utilizzando solo il lato sinistro della piastra. Dopo aver combinato i campioni, i controlli positivi e negativi con la miscela del preamplificatore, sigillare accuratamente la piastra standard a 96 pozzetti con una guarnizione adesiva trasparente. Rimuovere il sigillo in eccesso utilizzando una lama di rasoio per evitare la formazione di fessure di tenuta durante il ciclismo.

Centrifugare la piastra sigillata per 20 secondi utilizzando una centrifuga per piastre PCR. Verificare che tutti i reagenti siano combinati sul fondo dei pozzetti della piastra. Dopo aver acceso un termociclatore convenzionale, selezionare il programma di ciclo del preamplificatore e avviare il programma.

Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel termociclatore solo quando la parte inferiore del termociclatore raggiunge la temperatura richiesta per la produzione di cDNA monitorando la lettura della temperatura sullo schermo. Una volta completato il funzionamento del preamplificatore, verificare che la piastra sia rimasta sigillata. Dopo aver indossato i doppi guanti e i coperchi delle maniche, rimuovere il sigillo dal preamp piastra.

Quindi, rimuovere e gettare con cura i guanti esterni. Diluire i prodotti del preamplificatore da uno a cinque aggiungendo 56 microlitri di tampone TE a ciascun pozzetto delle colonne da uno a sei della piastra del preamplificatore a 96 pozzetti e mescolando pipettando su e giù. Per fare ciò, andare solo al primo arresto della pipetta, aspirare dal basso ed erogare più in alto ma non creare bolle.

Aggiungere il buffer TE a tutte e sei le colonne indipendentemente dai pozzetti inutilizzati. Prepararsi per il trasferimento a 384 pozzetti alla piastra di amplificazione come descritto nel protocollo di testo. Al termine delle fasi di preparazione, indossare nuovi guanti doppi ben aderenti e coprimaniche.

A causa degli elevati tassi di evaporazione durante il pipettaggio di bassi volumi, è fondamentale dosare la miscela master e il campione in modo efficiente e sigillare immediatamente la piastra. Aggiungere 2,5 microlitri di master mix di amplificazione a una piastra a 384 pozzetti. Le targhe bianche vengono utilizzate qui a scopo dimostrativo, ma le targhe nere dovrebbero essere utilizzate per ridurre l'affaticamento degli occhi.

Trasferire 2,5 microlitri del prodotto preamplificatore diluito sulla piastra a 384 pozzetti secondo la mappa nel protocollo di testo. I dadi colorati mostrati qui illustrano la sequenza di trasferimento per una pipetta a canale fisso. Coprire immediatamente la piastra con un foglio di alluminio.

Eliminare i guanti esterni e i coperchi delle maniche. Centrifugare la piastra a 384 pozzetti per 20 secondi nella centrifuga per piastre PCR. Non rimuovere la guarnizione in alluminio, ma posizionare la piastra a 384 pozzetti nel gestore del liquido.

Aprire la confezione contenente una piastra di amplificazione incassata e posizionarla con cura nel gestore di liquidi nella prima fessura con il numero di serie a destra, tenere la custodia per i bordi senza toccare la superficie della piastra. Rimuovere la guarnizione di alluminio dalla piastra a 384 pozzetti all'interno del gestore di liquidi una volta che tutto è a posto. Fare clic su Avanti e quindi selezionare tutte le caselle man mano che ogni passaggio è completato.

Chiudere lo sportello del dispositivo di movimentazione dei liquidi e avviare immediatamente il processo di riempimento. Rimani accanto al gestore del liquido e procedi immediatamente al passaggio successivo una volta riempita la piastra. Mentre il dispositivo di erogazione del liquido è in funzione, rimuovere la pellicola protettiva dal fondo del coperchio di una custodia.

Lasciare la pellicola superiore in posizione. Adescare il nastro rosso tirandolo leggermente per sganciarlo dall'adesivo. Rimuovere la piastra di amplificazione caricata dal dispositivo di movimentazione del liquido e posizionarla delicatamente nella pressa per piastre con il numero di serie a destra.

Posiziona il coperchio sopra il piatto con l'estremità dentellata a destra e l'adesivo sul fondo. Tirare verso il basso la leva della pressa della piastra chiudendola con cautela, la luce lampeggerà per 20 secondi. Non toccare la pressa per piastre durante questo periodo.

Una volta che la luce diventa verde fissa, sollevare la leva e rimuovere con cautela la piastra sigillata tenendola sui bordi. Tenendo la piastra di amplificazione sigillata verticalmente per i bordi della custodia, inserire immediatamente la punta della siringa nella porta di caricamento all'estremità della custodia, quindi erogare lentamente il fluido di immersione con un movimento delicato e continuo per riempire lo spazio tra la piastra e il coperchio. Lasciare una piccola bolla d'aria nell'angolo una volta che la piastra è immersa.

Continuando a tenere la piastra verticalmente per i bordi, sigillare la porta di caricamento inserendo il tappo nella porta e ruotando il tappo in senso orario, applicare una pressione sufficiente fino a quando la maniglia non si rompe. Pulire la custodia con un panno privo di lanugine accuratamente spruzzato con etanolo. Per asciugare la custodia, strofinare la custodia verso il basso con un panno pulito.

Portare la piastra sigillata alla macchina di amplificazione. Nella scheda dello strumento, selezionare la console dello strumento. Selezionare l'impianto di amplificazione e quindi fare clic sul pulsante di apertura della porta.

Posizionare la piastra di amplificazione nella prima fessura dell'adattatore della piastra, verificando che l'adattatore sia correttamente allineato con uno nell'angolo in alto a sinistra. Orientare la piastra con il codice a barre rivolto verso l'alto e verso la parte anteriore dello strumento. Dopo aver fatto clic sul pulsante Chiudi porta, vai alla scheda Home nella parte inferiore dello schermo.

Nel menu Esegui, selezionare OpenArray. Fare clic su Ottieni ID targa. Per iniziare la corsa, fare clic su avvia corsa.

Apri un foglio di calcolo contenente la macro dei risultati. Nel file di dati esportato, fare clic con il pulsante destro del mouse sulla scheda nella parte inferiore dello schermo e selezionare sposta o copia. Nel campo da prenotare, selezionare la macro dei risultati.

Quindi fare clic su sposta alla fine e selezionare la casella denominata crea copia. Infine, fai clic su OK. Elimina la vecchia scheda di esportazione e rinomina la scheda appena aggiunta come esportazione.

Fare clic su Visualizza, quindi su macro, quindi selezionare macro, quindi fare clic su Esegui. Quindi, ripeti l'operazione per Macro2 facendo clic su Visualizza e poi su Macro, selezionando Macro2 e facendo clic su Esegui. Nel software della macchina di amplificazione, controllare le curve per ogni campione e confrontarle con la tabella macro selezionando il grafico di analisi/amplificazione sul lato sinistro dello schermo.

Quindi, selezionare la scheda del campione e fare clic su ciascun campione per confermare che ci siano due o tre curve di amplificazione positive per ciascuno dei risultati positivi nella tabella. Le letture della fluorescenza vengono confrontate con i cicli di amplificazione per illustrare che la PCR in tempo reale è stata eseguita con successo. La maggior parte dei campioni ha raggiunto livelli di soglia relativi tra i cicli due e 25 della reazione PCR in tempo reale.

Le curve standard eseguite in tre giorni diversi vengono tracciate per dimostrare la linearità e la gamma di amplificazione utilizzando controlli positivi. I valori di soglia del ciclo sono tracciati rispetto alla base logaritmica 10 del numero di copie dello standard dell'acido nucleico. Le due macro inseriranno i nomi dei campioni nella prima colonna e la media dei tre valori Ct per ogni target per quelli con risultati positivi.

I target che non sono stati amplificati appaiono vuoti in questa tabella. Vengono mostrati i risultati quantitativi per 10 campioni clinici e quattro controlli di routine, come in questo caso, il controllo di amplificazione negativo dovrebbe essere negativo per tutti i bersagli e il controllo di estrazione negativo dovrebbe contenere solo il controllo interno. Un campione di questo set mostra un controllo interno fallito, che indica la presenza di inibitori nel campione.

Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di PCR su scala nanometrica. Questa procedura semplificherà l'esecuzione di pannelli basati sulla sindrome nella diagnostica veterinaria. Questo metodo può essere adattato per includere saggi per agenti eziologici di molte diverse malattie infettive.