Name: Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min
Description: Scopri un metodo PCR ad alto rendimento per rilevare patogeni respiratori nel cane e nel cavallo utilizzando piastre nanoscale. Questa tecnica migliora l'efficienza diagnostica veterinaria e supporta la sorveglianza OneHealth.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Il lavoro su saggi patogeno respiratorio qui descritti è stato sostenuto da fondi per lo sviluppo interno Cornell Animal Health Centro Diagnostico. Sviluppo della scala nanometrica flusso di lavoro PCR e sistemi di garanzia di qualità è stato parzialmente finanziato (FOA PA-13-244) e svolto in collaborazione con Veterinary Laboratory Investigation la Food and Drug Administration e Response Network (FDA Vet-LIRN) sotto Grant No 1U18FD005144- 01. I costi di pubblicazione sono stati sponsorizzati da VWR e Quanta Biosciences. Ringraziamo Gabrielle Nickerson, Roopa Venugopalan, Veldina Camo, Xiulin Zhang, Jinzhi Yu, Wang Weihua, e Katrina Walker per la loro assistenza con la scrittura e la revisione del protocollo. Ringraziamo Mike Carroll per filmare le interviste agli autori. Abbiamo finalmente Ringraziamo l&#39;editor e tre revisori anonimi per i loro utili commenti.

<ol><li>Kalinina, O., Lebedeva, I., Brown, J., Silver, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+scale+PCR+with+TaqMan+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter scale PCR with TaqMan detection.</a> Nucleic Acids Res. 25 (10), 1999-2004 (1997).</li>
<li>Morrison, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanoliter+high+throughput+quantitative+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nanoliter high throughput quantitative PCR.</a> Nucleic Acids Res. 34 (18), e123(2006).</li>
<li>Bustin, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+mRNA+using+real-time+reverse+transcription+PCR+%28RT-PCR%29%3A+trends+and+problems%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Quantification of mRNA using real-time reverse transcription PCR (RT-PCR): trends and problems.</a> J Mol Endocrinol. 29 (1), 23-39 (2002).</li>
<li>McCall, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+benchmark+for+microRNA+quantification+algorithms+using+the+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+bioinformatics%22%5BJournal%5D)">A benchmark for microRNA quantification algorithms using the OpenArray platform.</a> BMC bioinformatics. 17 (1), 138(2016).</li>
<li>Pozzi, A., Previtali, C., Cenadelli, S., Gandini, L., Galli, A., Bongioni, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+traceability+of+cattle+using+an+OpenArray+genotyping+platform%5BTitle%5D)+AND+%22Anim+Genet%22%5BJournal%5D)">Genetic traceability of cattle using an OpenArray genotyping platform.</a> Anim Genet. 47 (1), 133-134 (2016).</li>
<li>Grigorenko, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplex+screening+for+blood-borne+viral%2C+bacterial%2C+and+protozoan+parasites+using+an+OpenArray+platform%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">Multiplex screening for blood-borne viral, bacterial, and protozoan parasites using an OpenArray platform.</a> J Mol Diagn. 16 (1), 136-144 (2014).</li>
<li>Shu, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Design+and+performance+of+the+CDC+real-time+reverse+transcriptase+PCR+swine+flu+panel+for+detection+of+2009+A+%28H1N1%29+pandemic+influenza+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Design and performance of the CDC real-time reverse transcriptase PCR swine flu panel for detection of 2009 A (H1N1) pandemic influenza virus.</a> J Clin Microbiol. 49 (7), 2614-2619 (2011).</li>
<li>Elia, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+equine+herpesvirus+type+1+by+real+time+PCR%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Detection of equine herpesvirus type 1 by real time PCR.</a> J Virol Methods. 133 (1), 70-75 (2006).</li>
<li>Dreier, J., Störmer, M., Kleesiek, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Bacteriophage+MS2+as+an+Internal+Control+in+Viral+Reverse+Transcription-PCR+Assays%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Use of Bacteriophage MS2 as an Internal Control in Viral Reverse Transcription-PCR Assays.</a> J Clin Microbiol. 43 (9), 4551-4557 (2005).</li>
<li>Pusterla, N., Hussey, G. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Equine+Herpesvirus+1+Myeloencephalopathy%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Equine+Pract%22%5BJournal%5D)">Equine Herpesvirus 1 Myeloencephalopathy.</a> Vet Clin North Am Equine Pract. 30 (3), 489-506 (2014).</li>
<li>Firth, C., Lipkin, W. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genomics+of+emerging+pathogens%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genomics+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">The genomics of emerging pathogens.</a> Annu Rev Genomics Hum Genet. 14, 281-300 (2013).</li>
<li>Lecuit, M., Eloit, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+potential+of+whole+genome+NGS+for+infectious+disease+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22Expert+Rev+Mol+Diagn%22%5BJournal%5D)">The potential of whole genome NGS for infectious disease diagnosis.</a> Expert Rev Mol Diagn. 15 (12), 1517-1519 (2015).</li>
<li>Dunne, G., Gurfield, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+Veterinary+Diagnostic+Laboratory%2C+a+Model+for+the+One+Health+Initiative%5BTitle%5D)+AND+%22Vet+Clin+North+Am+Small+Anim+Pract%22%5BJournal%5D)">Local Veterinary Diagnostic Laboratory, a Model for the One Health Initiative.</a> Vet Clin North Am Small Anim Pract. 39 (2), 373-384 (2009).</li>
<li>Moutailler, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Co-infection+of+Ticks%3A+The+Rule+Rather+Than+the+Exception%5BTitle%5D)+AND+%22PLOS+Negl+Trop+Dis%22%5BJournal%5D)">Co-infection of Ticks: The Rule Rather Than the Exception.</a> PLOS Negl Trop Dis. 10 (3), e0004539(2016).</li>
</ol>

Marcia Slater e Elen Ortenberg sono dipendenti di Thermo Fisher Scientific Inc. che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo articolo.

Questa procedura è stata utilizzata per il test di routine di patogeni respiratori nel nostro laboratorio nel corso di sei mesi (2-3 volte a settimana). Abbiamo anche avuto successo usando la stessa procedura per enterica profiling patogeno in campioni fecali e batteri isolati su un piatto personalizzato separatamente. Una volta che le piastre vengono prodotte, personale esperto in grado di completare i passaggi 2-7 entro una giornata lavorativa standard. Le fasi più critiche sono la corretta tenuta della piastra preamplificatore, il trasferimento dei campioni preamplificati fra piastre (che deve essere fatto rapidamente per evitare l&#39;evaporazione), ed il rivestimento finale della piastra di amplificazione. L&#39;uso del foglio di macro come guida per l&#39;analisi risultato (controllo curve per campioni e controlli) era anche critica in quanto riduce notevolmente la quantità di tempo e lavoro di ufficio necessario per questo processo. Il foglio di calcolo macro fornito è un esempio; avrebbe bisogno di essere modificato o ricreato per piatti con diverse configurazioni. Questo può essere facilmente performed da qualcuno con conoscenze di base foglio di calcolo. A causa della piccola quantità di campione caricato sulla piastra di amplificazione (33 nl), è necessario pre-amplificazione. Nella ottimizzazione di questo protocollo (non mostrato), abbiamo confrontato una serie di parametri di preamplificazione compreso il master mix, aggiunta di primer casuali, il numero di cicli, tempo di ricottura, e diluizione prima dell&#39;amplificazione. Ogni bersaglio aveva le sue condizioni ottimali, e quelli qui descritti rappresentano quelli che ha dato il limite migliore della complessiva rilevazione per il nostro pannello. Questo pannello copre un&#39;ampia gamma di obiettivi patogeni e tipi di campione che si incontrano nei test diagnostico veterinario di routine, ma le modifiche alle procedure di preamplificazione può essere necessaria per diversi pannelli. Le condizioni di amplificazione quelle ottimizzati sono basate su uno standard sonda basata protocollo in tempo reale PCR con un 10 min a 95 ° C attivazione enzimatica seguita da denaturazione a 95 ° C e AnnEaling / estensione a 60 ° C. I primer e le sonde sono pre-stampati sulle piastre anche utilizzando condizioni produttore ottimizzato e quindi non richiedono titolazione. Combinando i passaggi trascrizione inversa e pre-amplificazione per tutti i campioni (indipendentemente dal tipo di destinazione) è necessario per mantenere l&#39;efficienza del flusso di lavoro. Avere tutti i campioni trascrizione inversa è anche utile per massimizzare la sensibilità. Inoltre, l&#39;uso di una miscela master per il preamplificatore ottimizzata per inibitori riduce permette versatilità nel combinare diversi tipi di campione sulla stessa piastra. Il Center for Disease Control (CDC) saggio matrice di influenza descritto da Shu et al. 7 e adattato qui per le reazioni scala nanolitro è una influenza universale Un test che è appropriato per i campioni di prova da esseri umani e animali da compagnia. E &#39;stato progettato per il rilevamento universale del gene matrice di tutti i virus dell&#39;influenza A usando rea scala microlitroAZIONI. E &#39;stato utilizzato in tutto il mondo come parte di un Panel virus CDC influenza umana e di un pannello di influenza suina CDC. Il EHV-1 test 8 adattato qui rileva un importante patogeno respiratorio dei cavalli che possono causare aborti e malattie neurologiche (recensito da Pusterla e Hussey 10). Il significato di adattare questi test per una piattaforma high-throughput con un controllo interno specie indipendente è che possono essere incorporati in un approccio di sorveglianza OneHealth. Avendo entrambi questi saggi su una piattaforma di test high-throughput faciliterà la preparazione alle emergenze per le strutture cliniche, ricoveri, e gli eventi di prestazioni. I risultati sopra descritti erano rappresentative di tutti gli obiettivi sulla piastra con l&#39;eccezione di Mycoplasma CYNOS, che ha mostrato considerevolmente più variazione delle prestazioni analitica. Questo è probabilmente dovuto alla temperatura di sub-ottimali di fusione (T m) dei primer, che idealmente dovrebbe essere 58-60 &amp;# 176; C (la sonda ideale Tm è 68-70 ° C). Una limitazione di questa piattaforma è che ci vuole più tempo per progettare e realizzare le piastre che per ordinare le singole sonde, che limita la capacità di modificare rapidamente le sequenze. Un&#39;altra limitazione di PCR in tempo reale, in generale, è l&#39;incapacità di rilevare romanzo o patogeni inattesi. Questo può essere superato in una certa misura progettando saggi che hanno sequenze di specie diverse, ma imparziali metodologie basate genoma sequenziamento sono più adatti per la scoperta di nuovi agenti. 11,12 Nanoscale PCR in tempo reale permette un nuovo paradigma per la sindrome-based piuttosto che specie basati su test, che è utile per ridurre reagenti e costo del lavoro in diagnostica molecolare ad alto throughput. Su larga scala test panel da questo approccio può facilitare gli sforzi di sorveglianza OneHealth come quelli descritti da Dunne e Gurfield 13 e Moutailler et al. 14. La raccolta dei campioni di tamponi precoce,generalmente entro 3 giorni di manifestazione clinica, offre la migliore possibilità di identificare la presenza di patogeni respiratori. Infettiva comparsa della malattia è spesso imprevedibile, e le prove che possono essere eseguite su diverse specie, senza la necessità di modifica dei reagenti sono ideali per la preparazione. Le future applicazioni di questa tecnologia sono suscettibili di essere in pathotyping, profilatura resistenza antimicrobica, ed ulteriori pannelli di diagnostica clinica sindrome-based. Nanoscale PCR in tempo reale è molto utile per lo screening rapido, high-throughput di molteplici tipi di campioni e patogeni, e sarebbe completato da approcci imparziali o parzialmente distorti sequenziamento-based per l&#39;individuazione di nuove ed emergenti agenti patogeni.

Con la domanda per la rilevazione rapida e completa di molteplici agenti in diagnostica clinica per l&#39;uomo e gli animali, unico organismo metodi diagnostici molecolari per il rilevamento degli agenti patogeni sono gravosi se non usato per un gran numero di campioni in fase di sperimentazione per una singola malattia. Nel contesto veterinaria, high throughput metodologie diagnostiche sono particolarmente importanti a causa della necessità supplementare per coprire patogeni da un&#39;ampia varietà di specie. OneHealth approcci per la gestione delle malattie di origine alimentare e la sorveglianza degli agenti patogeni emergenti sono esempi di esigenze di test che includono un numero di batteri, virus (DNA o RNA based), parassiti e funghi. La sfida di combinare test per più analiti insieme (multiplexing) al fine di migliorare l&#39;efficienza di test è una possibile perdita di sensibilità e un grande peso per l&#39;ottimizzazione e la validazione di saggi. in tempo reale scala nanoliter reazione a catena della polimerasi (PCR) è un alternativo per la pratica di multiplazione che permette molte reazioni separate di eseguire contemporaneamente sullo stesso campione 1. La piattaforma OPENARRAY è un&#39;applicazione di questo principio 2; combina la tecnologia dei microarray con real-time PCR. Basato sul concetto di multiplexing spaziale, ogni campione viene testato per un gran numero di bersagli in separato fori passanti. Questa piattaforma è stata inizialmente utilizzata con legame al DNA a doppio filamento Cyanine a base chimica 2 ed è ora disponibile per la chimica sonda-based utilizzando sonde tempra scuri 3. Questa piattaforma è stata principalmente utilizzato per la profilazione genetica negli esseri umani e negli animali 4 5. E &#39;stato recentemente adattato per rilevare il DNA e RNA agenti patogeni da Grigorenko et al. 6 utilizzando una procedura in due fasi inversa trascrizione / pre-amplificazione (preamplificatore). Descriviamo qui di una procedura preamplificatore a base one-step per la rilevazione di entrambi i tipi di agenti patogeni nel sec respiratoriaretions e una varietà di altri tipi di campioni che possono essere eseguite interamente in una giornata lavorativa normale. Al completamento del preamplificatore one-step, i campioni vengono trasferiti ad una piastra a 384 pozzetti, che è il formato accettato dal sistema di gestione dei liquidi automatizzato che viene con questa piattaforma nanoscala PCR. Il sistema disegna il master mix e il campione su tutta la superficie di un massimo di 4 piastre (192 campioni e controlli) alla volta. In seguito a questo processo di caricamento, si descrive come i campioni sono amplificati e analizzati utilizzando un foglio di calcolo macro che riassume la media di 3 repliche tecnici per ogni combinazione campione / target in una tabella che si inserisce in una pagina stampata. è stato stabilito un metodo uniforme per l&#39;analisi del DNA e / o RNA estratto da campioni che utilizzano questa piattaforma. Un&#39;ampia varietà di campioni sono stati estratti, retrotrascritto, e pre-amplificato in un formato a 96 pozzetti, minimizzando la possibilità di errori. campioni respiratori testati inclusi tamponi nasali, tamponi faringei profondi,lavaggi trans-tracheale, lavaggio broncoalveolare, e tessuto polmonare. Poiché alcuni degli agenti testati possono anche essere presenti nel sangue periferico o feci, abbiamo incorporato questi tipi di campioni nella procedura. Questo flusso di lavoro consente di risparmiare tempo e risorse rispetto alla corsa esperimenti in più piatti, permettendo test efficiente attraverso patogeno e la tossina rilevazione gene pannello a base al posto di test individuale. Il pannello respiratoria dimostrato qui aveva 18 saggi di ogni stampati in triplice copia fori passanti, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. I patogeni equine rilevati inclusi adenovirus equina 1 e 2, il virus arterite equina, equina virus rinite A e B, equina herpesvirus (AAT) tipi 1 e 4, e Streptococcus equi. I patogeni canino incluso canine coronavirus respiratorio (betacoronavirus), virus del cimurro canino, adenovirus canino, virus parainfluenza canina, pneumovirus canina, Bordetella bronchiseptica e Mycoplasma CYNOS. UNl&#39;influenza universale sono stati inclusi anche un saggio e un controllo interno (MS2 RNA fago).

<table><tbody><tr><td>Zap-OGlobin II reagente litico</td><td>Beckman Coulter</td><td>7546138</td><td>Reagente opzionale per la preparazione di campioni di sangue.</td></tr><tr><td>Kit di estrazione (MagMAX Total Nucleic Acid Isolation Kit)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>AM1840</td><td>È possibile sostituire altri kit di estrazione appropriati per i tipi di campione desiderati. Questo kit viene fornito con PBS, tampone di lisi e tampone di lavaggio.</td></tr><tr><td>2x miscela RT-qPCR One-Step (qScript XLT, One-Step RT-qPCR, ToughMix)</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95134-500</td><td></td></tr><tr><td>Pool di primer specifico per gene,</td><td>ordine personalizzato</td><td>IDT</td><td>Può essere generato dall'utente o acquistato con le piastre di amplificazione.</td></tr><tr><td>Miscela di primer casuale</td><td>New England Biolabs</td><td>S1330S</td><td></td></tr><tr><td>Piastra standard a 96 pozzetti</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>N8010560</td><td>Può trattarsi di qualsiasi piastra che si adatti alla macchina PCR convenzionale utilizzata.</td></tr><tr><td>Master Mix di amplificazione (Master Mix OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4462164</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione adesiva trasparente</td><td>Thermo-Fisher</td><td>430611</td><td></td></tr><tr><td>Guarnizione in lamina</td><td>Excel Scientific</td><td>AF-100</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 384 pozzetti</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4482221</td><td></td></tr><tr><td>Piastra di amplificazione (piastra QuantStudio 12K Flex OpenArray)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4470813</td><td>Può essere personalizzato con qualsiasi test conforme alle condizioni standard TaqMan.</td></tr><tr><td>Kit di accessori</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4469576</td><td>Contiene i coperchi della custodia, i tappi e il fluido di immersione.</td></tr><tr><td>Puntali AccuFill</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457246</td><td></td></tr><tr><td>Macchina di amplificazione (QuantStudio 12K Flex Real-Time PCR System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4471090</td><td></td></tr><tr><td>Liquid Handler (OpenArray AccuFill System)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4457243</td><td>Questo viene acquistato con la macchina di amplificazione.</td></tr><tr><td>Software di progettazione di primer (Primer Express)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4363991</td><td>Consultare le istruzioni del produttore per le specifiche dettagliate di primer e sonda.</td></tr><tr><td>Programma di analisi delle immagini (ImageJ)</td><td>NIH</td><td></td><td>Disponibile all'indirizzo http://imagej.nih.gov/ij/</td></tr> <tr><td>Programma per fogli di calcolo (Excel)</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Disponibile all'indirizzo</td></tr><tr><td>https://products.office.com/en-us/excel DMEM</td><td>Thermo-Fisher/Gibco</td><td>11965-092</td><td></td></tr><tr><td>Disgregatore tissutale (TissueLyser II)</td><td>Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Termociclatore convenzionale (Veriti)</td><td>Thermo-Fisher/Applied Biosystems</td><td>4375786</td><td>È possibile utilizzare qualsiasi termociclatore convenzionale con coperchio riscaldato.</td></tr><tr><td>Centrifuga per piastre per PCR</td><td>VWR</td><td>89184-608</td><td>Questo dispositivo ha una sola velocità (2.500 giri/min); il rotore si avvia quando il coperchio è chiuso e si arresta quando si preme il pulsante.</td></tr><tr><td>tampone TE</td><td>Millipore</td><td>8890-100ML</td><td>10 mM Tris(idrossimetil)amminometano cloridrato, 1 mM Acido etilendiamminotetraacetico, pH 8,0</td></tr></tbody></table>

detection high-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da nanoscale pcr

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

scala nanoliter real-time PCR utilizza multiplexing spaziale per consentire a più test da eseguire in parallelo su un singolo piatto senza gli svantaggi tipici di combinare insieme le reazioni. Abbiamo progettato e valutato un pannello basato su questo principio per identificare rapidamente la presenza di agenti patogeni comuni nei cani e cavalli con malattia respiratoria acuta. Questo manoscritto descrive un flusso di lavoro PCR diagnostico su scala nanometrica per la preparazione del campione, l&#39;amplificazione e l&#39;analisi di sequenze bersaglio patogeni, concentrandosi sulle procedure che sono diverse dalle reazioni scala microlitro. Nel pannello respiratoria presentato, 18 saggi sono stati ogni istituiti in triplice copia, che possono ospitare fino a 48 campioni per piastra. Una estrazione e di pre-amplificazione del flusso di lavoro universale è stato ottimizzato per la preparazione dei campioni high-throughput per ospitare molteplici matrici e gli agenti patogeni a base di DNA e RNA. dati rappresentativi sono presentati per un obiettivo RNA (influenza A matrice) e un obiettivo di DNA (herpesvirus equino1). La possibilità di testare in modo rapido e preciso per un gruppo completo sindrome a base di agenti patogeni è uno strumento prezioso per migliorare l&#39;efficienza e l&#39;ergonomia di test diagnostici e per la diagnosi della malattia respiratoria acuta e gestione.

I risultati sono mostrati nelle figure 1 e 2 per un saggio rappresentante RNA (matrice influenza) e test DNA (EHV-1) con una combinazione di controlli positivi e campioni clinici presentati per test diagnostici di routine. I segnali di fluorescenza emessi durante questa reazione tipica sono mostrati in Figura 1, che riporta i valori di fluorescenza prime per ciclo. Tutti i valori di soglia relativo ciclo (CT) sono stati generati automaticamente dal software della macchina di amplificazione. Fluorescenza di fondo è stato utilizzato come metrica separata per la valutazione della qualità loading invece di inserirla nelle letture di fluorescenza prima di calcolare valori Ct. Il limite analitico di rilevazione (LOD) per ogni obiettivo è stato calcolato sulla base della media complessiva dei valori Ct al livello di rilevamento del 95% più 2 deviazioni standard in una pozza di controlli pertutti gli obiettivi. La diluizione più alta in cui almeno il 95% dei replicati sono risultati positivi per la metodica di rappresentanza era di 50 copie; rilevamento di 5 copie avuto successo nel 50% dei replicati. Nessuno dei due test è stato rilevato al di sotto di una copia. I limiti di determinazione per il dosaggio RNA e DNA sono stati calcolati a valori Ct di 21.92 e 20.05. Questi valori sono stati considerati i tagli per i valori di segnalazione come positivi contro sospetti (potenzialmente non ripetibile). Altri aspetti della performance analitica degli obiettivi è stata valutata utilizzando diluizioni seriali di controlli positivi pool eseguito in tre giorni diversi (Figura 2). Le efficienze medie delle analisi rappresentative RNA e DNA sono stati 101,1% e del 106,6%; l&#39;efficienza media complessiva per tutti i target era 101,3%. I saggi avevano anche buona linearità (R 2&gt; 0,98). Variazione all&#39;interno replicare fori passanti in genere era all&#39;interno deviazioni standard di 0,2 per entrambi i campioni clinici di und controlli. Non è stata osservata cross-reattività tra uno qualsiasi dei bersagli. Il foglio di lavoro Risultati finali nel file supplementare mostra risultati quantitativi rappresentativi per 10 campioni di diagnostica clinica e 4 controlli. I campioni clinici sono un sottoinsieme dei tipi di campioni di routine test, compresa nasali / orofaringei, tessuto polmonare, e campioni di feci. Un (equina) campione di feci in questa serie mostra un fallito controllo interno MS2, che indica la presenza di inibitori nel campione. Questo è tipicamente gestito dalla diluizione del campione eluito e / o ri-estrazione. Come è il caso qui, il controllo di amplificazione negativo deve essere negativo per tutte le destinazioni, e il controllo di estrazione negativo dovrebbe contenere solo il controllo interno. Nel set clinica, campioni prodotti valori Ct per betacoronavirus, Bordetella bronchiseptica, cimurro canino virus A, il virus parainfluenza canina, pneumovirus canino, e l&#39;influenzaUN. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781fig1.jpg" /> Figura 1. trame amplificazione. Letture di fluorescenza vengono riportati in cicli di amplificazione per il dosaggio RNA (A) e test DNA (B). I triangoli sono mostrati denota valori Ct. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig1large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781figure2.jpg" /> Figura 2. Le curve standard. Le curve standard dal dosaggio RNA e DNA testato in tre giorni diversi sono tracciati per dimostrare la linearità e la gamma di amplificazione utilizzando controlli positivi. Ciclo soglia valori (R) sono in grafico contro log (10) del numero di copie di RNA (A) o DNA ( <strong&gt; B) di serie. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54781/54781fig2large.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Tabella 1" src="/files/ftp_upload/54781/54781table1.jpg" /> Tabella 1. Schema del piatto e di destinazione posizioni di amplificazione. Le lastre utilizzate per la scala nanometrica in tempo reale test PCR su questa piattaforma sono microscopio dimensioni e sono disposti in 48 sottoarray di 64 fori passanti, con un totale di 3.072 fori passanti per reazioni individuali. Un sottoarray è mostrato qui, con 18 bersagli in triplice copia. Ogni campione viene aggiunto a una sottomatrice dal gestore liquido. Le piastre sono rivestite con composti idrofili e idrofobi per mantenere i reagenti in fori passanti tramite tensione superficiale. Il chip in acciaio inox è &quot;fotolitograficamente modellato e bagnato-attaccato per formare un allineamento rettilineo di 3.072 micro-lavorati, 320 micron diamete. R fori di 33 nl ogni &quot;2 abbreviazioni per gli obiettivi sono i seguenti: BCOR, canino coronavirus respiratorio (betacoronavirus); BORD, Bordetella bronchiseptica CAV, adenovirus canino; CPIV, virus parainfluenza canina; CPNV, pneumovirus canino; DISTA / B, canino cimurro virus A e B; EADV1 / 2, adenovirus equina 1/2; EAV, equina virus arterite; EHV1 / 4, equina a herpesvirus 1/4; ERVA / B, equina virus rinite A / B; IVM, influenza A matrice; MCYNOS, Mycoplasma CYNOS, MS2, controllo interno (MS2 RNA del fago); SEQU, Streptococcus equi. <img alt="Tabella 2" src="/files/ftp_upload/54781/54781table2.jpg" /> Viene mostrato Tabella 2. carta di trasferimento del piatto. Una mappa di trasferimento piatto color-coded per l&#39;utilizzo di una pipetta a 8 canali fissi per il trasferimento dalla piastra preamplificatore a 96 pozzetti alla piastra a 384 pozzetti. In alternativa, una pipetta regolabile può essere utilizzato. La stessa procedura viene eseguita ogni volta, indipendentemente h<html> ow molti campioni nella piastra. <img alt="File supplementare" src="/files/ftp_upload/54781/54781sup.jpg" /> Viene fornito il file supplementare. Un file di foglio di calcolo con attivazione macro che contiene due macro per i risultati di formattazione in una tabella di sintesi (come descritto nel protocollo). Un tipico tabella dei risultati generati dalle macro è incluso nel file (sotto Risultati finali). Le due macro riempiranno i nomi di esempio nella prima colonna (fino a 48 campioni) e la media dei tre valori Ct per ciascun bersaglio per quelli con risultati positivi; notare che gli obiettivi che non si amplificano appaiono vuoti in questa tabella. Questo può essere facilmente stampata su un pezzo di carta e utilizzato come riferimento per controllare efficacemente i dati grezzi. Nella scheda risultati finali, vengono mostrati risultati rappresentativi per i campioni clinici 10 e 4 controlli. Abbreviazioni per i nomi di analisi sono elencati nella legenda della tabella 1.www.jove.com/files/ftp_upload/54781/supplemental_code_file_R1.xlsm &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; Clicca qui per scaricare il file.

test high-throughput di DNA e RNA patogeni a base di nanoscala PCR è descritto con un cane sindromica e equini pannello PCR respiratorio.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

L'obiettivo generale di questa metodologia di test di PCR in tempo reale è rilevare contemporaneamente patogeni a DNA e a RNA in modo ad alto rendimento. Gli acidi nucleici provenienti da campioni clinici verranno preamplificati con un pool comune di primer caricato su una piastra OpenArray e analizzati per la presenza di patogeni. Questo metodo può contribuire a promuovere gli sforzi di sorveglianza OneHealth per le malattie infettive.Rispetto alle tecniche tradizionali, questo metodo consente di analizzare un numero maggiore di campioni per un numero maggiore di bersagli senza che questi competano tra loro, migliorando così l'efficienza dei test. Il metodo utilizza una piastra PCR personalizzata su scala nanometrica. I primer e le sonde vengono stampati sui bordi dei fori passanti e i campioni vengono caricati mediante un manipolatore di liquidi.Illustreremo il metodo su campioni clinici sottoposti a test per un pannello di patogeni respiratori di cavalli e cani. Per iniziare questa procedura, progettare la piastra come descritto nel protocollo testuale. La piastra utilizzata qui è configurata con 18 bersagli in triplice copia.Aggiungere mezzo ai tamponi e ai lavaggi tracheali in modo che ci sia almeno un millilitro a due millilitri di liquido. Vortexare vigorosamente il tampone e il DMEM nel tubo. Successivamente, utilizzare una pipetta per trasferire circa 1 millilitro di mezzo in un nuovo tubo.Aggiungere 235 microlitri di tampone di lisi e 175 microlitri di campione a ciascuna provetta con perline. Procedere secondo il protocollo del produttore per l'estrazione dell'acido nucleico totale. Prepararsi per la trascrizione inversa e la pre-amplificazione dell'acido nucleico o della preamp come descritto nel protocollo testuale, verificando innanzitutto la mappa dei campioni.Aggiungere 8,5 µL di preamp master mix e 5,5 µL di campione di DNA/RNA in ciascun pozzetto di una piastra standard da 96 pozzetti, utilizzando solo il lato sinistro della piastra. Dopo aver combinato i campioni, i controlli positivi e i controlli negativi con il preamp mix, sigillare accuratamente la piastra standard da 96 pozzetti con un sigillo adesivo trasparente. Rimuovere qualsiasi eccesso di sigillo utilizzando una lametta per prevenire la formazione di spazi nel sigillo durante il ciclo termico.Centrifugare la piastra sigillata per 20 secondi utilizzando uno spinner per piastre PCR. Verificare che tutti i reagenti siano raccolti sul fondo delle pozzette della piastra. Dopo aver acceso un termociclatore convenzionale, selezionare il programma di preamplificazione e avviare il programma.Posizionare la piastra a 96 pozzetti nel termociclatore solo quando la parte inferiore del termociclatore ha raggiunto la temperatura richiesta per la produzione di cDNA, monitorando la lettura della temperatura sullo schermo. Al termine della corsa di preamplificazione, verificare che la piastra sia rimasta sigillata. Dopo aver indossato doppi guanti e coperture per le maniche, rimuovere il sigillo dalla piastra di preamplificazione.Quindi, rimuovere con attenzione e scartare i guanti esterni. Diluire i prodotti di preamplificazione da uno a cinque aggiungendo 56 microlitri di tampone TE in ciascun pozzetto delle colonne da uno a sei della piastra di preamplificazione a 96 pozzetti e mescolando mediante pipettaggio su e giù. A tale scopo, spingere la pipetta solo fino al primo arresto, aspirare dal fondo e rilasciare più in alto, senza creare bolle.Aggiungere tampone TE a tutte e sei le colonne, indipendentemente dalle pozzette non utilizzate. Prepararsi per il trasferimento a 384 pozzette nella piastra di amplificazione come descritto nel protocollo testuale. Al termine dei passaggi di preparazione, indossare nuovi guanti doppi ben aderenti e coperture per le maniche.A causa delle elevate velocità di evaporazione durante la pipettaggio di bassi volumi, è fondamentale dispensare in modo efficiente il master mix e il campione e sigillare immediatamente la piastra. Aggiungere 2,5 µL di master mix per l'amplificazione in una piastra a 384 pozzetti. Le piastre bianche vengono utilizzate qui a scopo dimostrativo, ma si dovrebbero usare piastre nere per ridurre l'affaticamento visivo.Trasferire 2,5 µL del prodotto di preamplificazione diluito nella piastra a 384 pozzetti seguendo la mappa indicata nel protocollo testuale. I dadi colorati mostrati qui illustrano la sequenza di trasferimento per una pipetta a canale fisso. Coprire immediatamente la piastra in modo stretto con un sigillo in foglio di alluminio.Scartare i guanti esterni e i copri-maniche. Centrifugare la piastra a 384 pozzetti per 20 secondi nel centrifugatore per piastre PCR. Non rimuovere il sigillo in foglio di alluminio, ma posizionare la piastra a 384 pozzetti nel manipolatore liquidi.Aprire la confezione contenente la piastra di amplificazione incapsulata e posizionarla con attenzione nel manipolatore liquidi nello slot iniziale, con il numero di serie a destra; tenere la custodia per i bordi senza toccare la superficie della piastra. Rimuovere il sigillo in foglio di alluminio dalla piastra a 384 pozzetti all'interno del manipolatore liquidi una volta che tutto è posizionato correttamente. Fare clic su "Avanti", quindi selezionare tutte le caselle man mano che ogni passaggio viene completato.Chiudere la porta del distributore di liquidi e avviare immediatamente il processo di riempimento. Restare vicino al distributore di liquidi e procedere subito al passaggio successivo non appena la piastra è piena. Mentre il distributore di liquidi è in funzione, rimuovere il film protettivo dalla parte inferiore di un coperchio del contenitore.Lasciare il film superiore al suo posto. Prime il nastro rosso tirando leggermente per staccarlo dall'adesivo. Rimuovere la piastra di amplificazione caricata dal manipolatore di liquidi e posizionarla delicatamente nella pressa per piastre con il numero di serie a destra.Posizionare il coperchio sulla piastra con l'estremità intagliata a destra e l'adesivo sul fondo. Abbassare con attenzione la leva della pressa per piastre chiudendola; la spia lampeggerà per 20 secondi. Non toccare la pressa per piastre durante questo periodo.Quando la spia luminosa diventa verde fissa, sollevare la leva ed estrarre con attenzione la piastra sigillata tenendola lungo i bordi. Tenendo la piastra di amplificazione sigillata in posizione verticale per i bordi della custodia, inserire immediatamente la punta della siringa nel portello di caricamento all'estremità della custodia, quindi rilasciare lentamente il liquido di immersione con un unico movimento delicato e continuo, riempiendo lo spazio tra la piastra e il coperchio. Una volta immersa la piastra, lasciare una piccola bolla d'aria in un angolo.Mantenendo la piastra verticalmente dai bordi, sigillare la porta di caricamento inserendo il tappo nella porta e ruotandolo in senso orario, applicando una pressione sufficiente fino a quando la manopola si stacca. Pulire l'involucro con un panno senza lanugine accuratamente spruzzato con etanolo. Per asciugare l'involucro, passare un panno pulito dall'alto verso il basso.Portare la piastra sigillata alla macchina di amplificazione. Nella scheda dello strumento, selezionare la console dello strumento. Selezionare la macchina di amplificazione e quindi fare clic sul pulsante per aprire la porta.Posizionare la piastra di amplificazione nel primo slot dell'adattatore per piastre, verificando che l'adattatore sia correttamente allineato con un uno nell'angolo in alto a sinistra. Orientare la piastra in modo che il codice a barre sia rivolto verso l'alto e verso la parte anteriore dello strumento. Dopo aver fatto clic sul pulsante chiudi porta, passare alla scheda home nella parte inferiore dello schermo.Sotto il menu di esecuzione, selezionare OpenArray. Fare clic su ottieni ID piastre. Per iniziare l'esecuzione, fare clic su avvia esecuzione.Aprire un foglio di calcolo contenente il macro risultati. Nel file di dati esportato, fare clic con il tasto destro sulla scheda in fondo allo schermo e selezionare Sposta o copia. Nel campo Libro di destinazione, selezionare macro risultati.Quindi fare clic su "sposta alla fine" e selezionare la casella con l'etichetta "crea copia". Infine, fare clic su "ok". Eliminare la vecchia scheda di esportazione e rinominare la nuova scheda aggiunta come "esportazione".Fare clic su Visualizza, quindi su Macro, selezionare la macro e fare clic su Esegui. Successivamente, ripetere l'operazione per Macro2 facendo clic su Visualizza, quindi su Macro, selezionando Macro2 e facendo clic su Esegui. Nel software della macchina di amplificazione, verificare le curve di ogni campione e controllo rispetto alla tabella macro selezionando Analisi/Grafico di amplificazione sul lato sinistro dello schermo.Quindi, selezionare la scheda campione e fare clic su ciascun campione per verificare che ci siano due o tre curve di amplificazione positive per ciascun risultato positivo riportato nella tabella. Le letture di fluorescenza sono riportate in funzione dei cicli di amplificazione per dimostrare che la PCR in tempo reale è stata eseguita con successo. La maggior parte dei campioni ha raggiunto livelli di soglia relativi tra i cicli 2 e 25 della reazione di PCR in tempo reale.Vengono tracciate curve standard su tre giorni diversi per dimostrare la linearità e l'intervallo di amplificazione utilizzando controlli positivi. I valori del ciclo soglia vengono riportati in grafico rispetto al logaritmo in base 10 del numero di copie dello standard di acido nucleico. Le due macro compilano i nomi dei campioni nella prima colonna e la media dei tre valori di Ct per ciascun target per i campioni con risultati positivi.I bersagli che non hanno amplificato risultano vuoti in questa tabella. Sono mostrati i risultati quantitativi per 10 campioni clinici e quattro controlli di routine; come in questo caso, il controllo negativo di amplificazione dovrebbe risultare negativo per tutti i bersagli e il controllo negativo di estrazione dovrebbe contenere soltanto il controllo interno. Un campione in questo set mostra un controllo interno non riuscito, il che indica la presenza di inibitori nel campione.Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come eseguire un esperimento di PCR su scala nanometrica. Questa procedura renderà più semplice l'esecuzione di pannelli basati su sindromi nella diagnostica veterinaria. Questo metodo può essere adattato per includere saggi per agenti eziologici di numerose malattie infettive diverse.

high-throughput-detection-respiratory-pathogens-animal-specimens

Research

Ricerca

JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Questo metodo descrive l'utilizzo di Infrared sistema colorante di imaging based per il rilevamento di H1N1 in bronchioalveolar lavaggio (BAL) fluido di topi infettati ad una sensibilità elevata. Questa metodologia può essere eseguita in uno 96 - o 384-bene piastra, richiede &lt;10 volume pl di materiale di prova e ha il potenziale per lo screening concomitante di agenti patogeni multipli.

High-throughput Metodo di rilevazione per il virus dell&#39;influenza

Integrato chip microfluidica termoplastico è stato sviluppato per l'utilizzo come diagnostica molecolare. Il chip esegue l'estrazione di acido nucleico, la trascrittasi inversa e PCR. Metodi per la fabbricazione e l'esecuzione del chip sono descritti.

Chip Fabrication Microfluidic e metodo per rilevare l&#39;influenza

Il sequenziamento di nanopore è una nuova tecnologia che consente un sequenziamento conveniente in posizioni remote e impostazioni di scarsa risorse. Qui, presentiamo un protocollo per il sequenziamento di mRNA da sangue intero che è compatibile con tali condizioni.

Sequenziamento dell'mRNA da sangue intero utilizzando il sequenziamento di NanoPore

In questo articolo viene descritto un protocollo ad alta produttività per una determinazione rapida e affidabile dei livelli di espressione genica in campioni C. elegans singoli o sfusi. Questo protocollo non richiede l'isolamento dell'RNA e produce cDNA direttamente dai campioni. Può essere utilizzato insieme a piattaforme qPCR multiplexate ad alta produttività in tempo reale.

RT-PCR quantitativo ad alta produttività in campioni C. elegans singoli e sfusi che utilizzano la tecnologia nanofluidica

Presentiamo un protocollo che combina l'amplificazione della polimerasi ricombinasi con un sistema CRISPR/Cas12a per il rilevamento di tracce di virus a DNA e costruisce una microscopia portatile per smartphone con una classificazione assistita dall'intelligenza artificiale per il rilevamento di virus a DNA point-of-care.

Sistema di rilevamento del virus del DNA basato su RPA-CRISPR/Cas12a-SPM e Deep Learning

Questo protocollo mira a quantificare l'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria da utilizzare per studi epidemiologici basati sulle acque reflue e a valutare il rischio di esposizione a SARS-CoV-2 in aerosol interni ed esterni. Questo protocollo descrive anche un approccio di sequenziamento a modello lungo dell'amplicone piastrellato per la caratterizzazione dell'intero genoma di SARS-CoV-2.

Quantificazione e caratterizzazione dell'intero genoma dell'RNA di SARS-CoV-2 in campioni di acque reflue e aria

Qui, presentiamo un flusso di lavoro rapido ed economico per la caratterizzazione dei genomi del virus della rabbia (RABV) utilizzando la tecnologia dei nanopori. Il flusso di lavoro ha lo scopo di supportare la sorveglianza basata sulla genomica a livello locale, fornendo informazioni sui lignaggi RABV circolanti e sul loro posizionamento all'interno delle filogenesi regionali per guidare le misure di controllo della rabbia.

Sequenziamento dell'intero genoma per una rapida caratterizzazione del virus della rabbia utilizzando la tecnologia Nanopore

Presentiamo due kit RT-qPCR one-step basati su sonde per i virus respiratori comuni. Il primo test è per SARS-CoV-2 (N), influenza A (H1N1 e H3N2) e influenza B. Il secondo è per SARS-Cov-2 (N) e MERS (UpE e ORF1a). Questi saggi possono essere implementati con successo in qualsiasi laboratorio specializzato.

Sviluppo di saggi RT-qPCR real-time multiplex per la rilevazione di SARS-CoV-2, influenza A/B e MERS-CoV

Vari agenti patogeni batterici possono causare infezioni del tratto respiratorio e portare a gravi problemi di salute se non rilevati con precisione e trattati tempestivamente. Il rilevamento rapido e accurato di questi patogeni tramite amplificazione isoterma mediata da loop fornisce una gestione e un controllo efficaci delle infezioni del tratto respiratorio in ambito clinico.

Rilevamento rapido di agenti patogeni batterici che causano infezioni del tratto respiratorio inferiore tramite amplificazione isotermica mediata da loop basata su chip microfluidico

Qui, descriviamo una procedura semplice e rapida per rilevare il DNA da agenti patogeni delle api, come Lotmaria passim e Nosema ceranae, utilizzando una lisi cellulare pronta per l'amplificazione, l'amplificazione della polimerasi ricombinasi e i saggi CRISPR/Cas12a.

Rilevamento del DNA in loco di parassiti tripanosomatidi e nosema ceranae attraverso lisi alcalina accoppiata al sistema RPA/CRISPR/Cas12a

Scopri un metodo PCR ad alto rendimento per rilevare patogeni respiratori nel cane e nel cavallo utilizzando piastre nanoscale. Questa tecnica migliora l'efficienza diagnostica veterinaria e supporta la sorveglianza OneHealth.

Detection High-throughput respiratorie patogeni nei campioni animali da Nanoscale PCR

Esplora altri video