Informazioni strutturale da singola molecola di FRET esperimenti usando il Nano-Positioning System Veloce

L'obiettivo generale del sistema di posizionamento Fast Nano è quello di fornire informazioni strutturali in tempo reale sulle biomolecole combinando esperimenti FRET a singola molecola con una rigorosa analisi statistica. Questo metodo risponde a domande chiave nel campo della biologia strutturale, come la localizzazione di domini flessibili in macromolecole dove gli strumenti standard di biologia strutturale non possono essere applicati. Il principale miglioramento dell'NPS veloce rispetto ad altri strumenti strutturali basati su FRET è che diversi modelli di coloranti possono essere confrontati utilizzando non solo le posizioni più probabili, ma una distribuzione di probabilità tridimensionale.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina i dati strutturali del database delle proteine con le misure quantitative di fluorescenza di una singola molecola. Per iniziare la procedura, assemblare una camera di flusso e un portacampioni. Per preparare le viti di ingresso e uscita, avvitare il tubo di silicone nelle viti a linguetta cava e tagliare il tubo dritto su entrambe le estremità con una lama di rasoio.

Avvitare le viti a linguetta al portacampioni. Allineare i fori del vetrino al quarzo della camera di flusso con le filettature del supporto del campione. Serrare delicatamente le viti del supporto del bicchiere per fissare la camera di flusso in posizione.

Infilare pezzi di tubo in silicone lunghi 20 centimetri nelle viti di ingresso e uscita. Lavare la camera di flusso con 500 microlitri di PBS. Quindi lavare la camera di flusso con 100 microlitri di soluzione di neutravidina in PBS, assicurandosi che si formi una gocciolina all'estremità del tubo di ingresso per evitare che l'aria entri nella camera del campione.

Bloccare il tubo di ingresso e di uscita dopo ogni manipolazione per escludere l'aria dalla camera di flusso. Incubare la camera per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare la soluzione di neutravidina con 500 microlitri di PBS.

Aggiungere una goccia di olio da immersione sul prisma e avvitare il prisma sulla camera del campione. I dati FRET a singola molecola vengono acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale. Avviare il software della fotocamera e il software del piezomotore dello stage.

Montare la camera sul tavolino micrometrico del microscopio TIRF orizzontalmente, il più dritto possibile e in modo tale da intersecare tutti e tre i laser. Aggiungere il liquido di immersione e mettere a fuoco l'obiettivo del microscopio controllando i riflessi IR. Impostare i parametri della fotocamera, il percorso del file e i parametri di incremento automatico.

Avvia il feed live della telecamera e sbianca la fluorescenza di fondo utilizzando tutti e tre i laser con intensità massima. Quindi, abbassare l'intensità del laser. Quindi, caricare 100 microlitri di una soluzione di perline fluorescenti nella camera.

Attendere 10 minuti affinché le perline si leghino alla superficie della camera. Registra un filmato con un campo visivo da 50 a 100 perline ed esegui un'analisi batch con una soglia di rilevamento del picco elevata. Carica il file del filmato e scegli due perline con centri distinti agli angoli opposti del campo visivo.

Seleziona i pixel di massima intensità in quelle perline. Rimuovere e pulire il prisma. Preparare una seconda camera per campioni e avvitare il supporto del prisma sulla camera.

Montare la camera sul tavolino micrometrico. Quindi, caricare nella camera 100 microlitri di una soluzione da 50 a 100 picomolari di campione marcato con fluorescenza biotinilata. Attendere che le molecole si leghino alla superficie della camera.

Contemporaneamente fare clic su Prendi segnale per avviare la registrazione e accendere il laser di eccitazione del donatore. Regola la potenza del laser per assicurarti che almeno l'80% delle molecole nel campo visivo siano sbiancate, quindi sposta la camera per mostrare un'area non sbiancata e registra il filmato successivo. Sbiancare il resto della camera del campione in questo modo.

Dopo le misurazioni al microscopio TIRF, i dati FRET a singola molecola acquisiti devono essere analizzati per ottenere l'efficienza FRET media. Eseguire un'analisi batch dei filmati donatori e accettori del campione. Quindi, caricare i file del filmato in batch nel software di analisi dei dati.

Cliccare sul pulsante NON selezionato per indicare le singole fasi FRET. Fare clic sull'inizio del periodo FRET, quindi sul punto temporale in cui l'intensità dell'accettore diminuisce a causa dello sbiancamento e infine sul punto temporale in cui l'intensità del donatore diminuisce a causa dello sbiancamento. Nella finestra successiva, selezionare Sì per mantenere la traccia di efficienza FRET selezionata.

Una volta che ogni molecola è stata analizzata, salva le tracce e analizza il filmato successivo. Una volta completata l'analisi, eseguire uno script per combinare i risultati FRET. Importare il file FRET combinato per fotogramma nel software di analisi dei dati utilizzando l'opzione di input predefinita.

Traccia i dati come un istogramma e usa lo strumento di adattamento della curva non lineare per adattarli a una gaussiana. Il valore di superamento è l'efficienza FRET principale. Utilizzare l'UV VIS e la spettroscopia fluorescente per determinare il raggio di Forster isotropo e i valori di anisotropia allo stato stazionario per ciascun colorante.

Il sistema di nano-posizionamento è stato ispirato dal noto GPS, in quanto localizziamo una posizione sconosciuta, l'antenna, con diverse posizioni note, i satelliti. Per iniziare l'analisi NPS, avviare il software FastNPS e creare un nuovo jobfile. Per definire le priorità di posizione delle antenne e dei satelliti etichettati, nella finestra ModelDyePrior, immettere la risoluzione spaziale della posizione da definire.

Escludere l'interno della macromolecola caricando il file PDB centrato corrispondente. Immettere il diametro del colorante e la distanza di scheletratura. Inserire le coordinate di posizione minima e massima della possibile posizione del colorante.

Se la posizione da definire è un satellite, selezionare l'attacco del colorante tramite il linker flessibile e immettere le coordinate dell'atomo dal file PDB centrato. Inserire la lunghezza e il diametro del linker. Fare clic su calcola volume accessibile, salvare la posizione precedente ed esportarla per la visualizzazione.

Ripetere questa procedura per tutti i satelliti e le antenne. Una volta definite le posizioni, aprire la finestra Definisci misura e creare una nuova molecola di colorante. Caricare la posizione precedente associata a quel colorante.

Riempi l'anisotropia della fluorescenza, seleziona un modello di colorante appropriato e attiva il colorante. Ripeti questo processo fino a quando tutti i coloranti sono stati definiti. Quindi, crea una nuova misurazione.

Selezionare una coppia di FRET tra i coloranti definiti. Inserire l'efficienza FRET a singola molecola con errore e il raggio di Forster isotropo di questa coppia di coloranti e attivare la misurazione. Ripeti l'operazione per tutte le coppie di coloranti.

Quindi, apri la finestra di calcolo. Se i coloranti sono stati assegnati a modelli diversi, selezionare Definito dall'utente. In caso contrario, selezionare il modello da utilizzare per tutti i coloranti.

Eseguire il calcolo e aprire la finestra dei risultati. Quando si utilizza FastNPS, è importante ricordare di adattare i modelli per tutti i coloranti al fine di ridurre al minimo i volumi credibili, pur rimanendo ovviamente coerenti. Se la consistenza è inferiore al 90%, fai clic su Coerenza dettagliata e identifica i coloranti comuni alle voci con una coerenza inferiore al 90%.

Aprire la finestra Definisci misura e modificare il modello del colorante in questione. Eseguire nuovamente il calcolo nella modalità Definito dall'utente. Esporta i volumi credibili dei coloranti singolarmente o in batch.

Apri i file di densità nel software di visualizzazione e regola la credibilità al livello desiderato. Le efficienze FRET a singola molecola sono state misurate tra molecole antenna sconosciute e diverse molecole satelliti note all'interno di un complesso promotore aperto di RNA polimerasi archea. L'analisi NPS di questi dati ha determinato i volumi credibili di queste molecole di colorante rispetto al complesso promotore aperto dell'RNA polimerasi archea.

Sono stati utilizzati cinque diversi modelli in cui sono state utilizzate le molecole di colorante e sono stati confrontati i risultati. I volumi credibili erano coerenti con i dati misurati quando calcolati con modelli che presumevano che il colorante potesse ruotare liberamente solo all'interno di un cono di orientamento sconosciuto. Il modello classico, in particolare, è il più conservativo, in quanto presuppone inoltre che la tintura si trovi in una posizione fissa.

Questo crea un volume credibile relativamente grande, ma il volume generalmente racchiude la posizione corretta. I modelli di precisione più elevata utilizzano il presupposto che il colorante sia completamente libero di ruotare durante la sua vita di fluorescenza. Il modello iso, come il modello classico, presuppone che il colorante si trovi in una posizione fissa all'interno del volume accessibile.

Il modello meanpos-iso assume la media dinamica su tutte le posizioni possibili. Sebbene i volumi credibili dei modelli iso siano molto più piccoli di quelli calcolati dai modelli non iso, sono incoerenti con i dati misurati. Volevamo sviluppare una tecnica che ci permettesse di catturare informazioni strutturali dinamiche di complessi transitori, un problema che non poteva essere affrontato dagli strumenti strutturali esistenti.

Una volta registrati i dati FRET a singola molecola, l'analisi FastNPS viene eseguita in un paio d'ore, consentendo un rapido confronto tra diversi modelli di coloranti. Seguendo questa procedura, altri metodi come le simulazioni MD possono essere eseguiti successivamente al fine di ottenere modelli strutturati coerenti con i dati FRET sperimentali a singola molecola.