Name: Informazioni strutturale da singola molecola di FRET esperimenti usando il Nano-Positioning System Veloce (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-09T12:30:00.000+00:00
Duration: 12 min 30 s
Description: Scopri come ottenere dati FRET a singola molecola usando il microscopio TIRF e il software FastNPS per l'analisi strutturale delle biomolecole. Questo metodo combina misurazioni quantitative con inferenza bayesiana.

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Gli autori ringraziano B. Gruchmann per i disegni meccanici della camera di flusso. Inoltre, desideriamo esprimere la nostra gratitudine a Max Beckers e Florian Drechsler per i commenti e le discussioni approfondite riguardanti l'NPS e il motore di campionamento sottostante.

<ol><li>Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-Particle+Cryo-EM+at+Crystallographic+Resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Single-Particle Cryo-EM at Crystallographic Resolution.</a> Cell. 161, 450-457 (2015).</li>
<li>Garman, E. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developments+in+X-ray+Crystallographic+Structure+Determination+of+Biological+Macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Developments in X-ray Crystallographic Structure Determination of Biological Macromolecules.</a> Science. 343 (6175), 1102-1108 (2014).</li>
<li>Sali, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Outcome+of+the+First+wwPDB+Hybrid%2FIntegrative+Methods+Task+Force+Workshop%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Outcome of the First wwPDB Hybrid/Integrative Methods Task Force Workshop.</a> Structure. 23, 1156-1167 (2015).</li>
<li>Hopfner, K. P., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+nucleic+acid+translocases%3A+lessons+from+structural+biology+and+single-molecule+biophysics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of nucleic acid translocases: lessons from structural biology and single-molecule biophysics.</a> Curr Opin Struct Biol. 17, 87-95 (2007).</li>
<li>Ando, T., Uchihashi, T., Kodera, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-speed+AFM+and+applications+to+biomolecular+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biophys%22%5BJournal%5D)">High-speed AFM and applications to biomolecular systems.</a> Annu Rev Biophys. 42, 393-414 (2013).</li>
<li>Neuman, K. K. C., Nagy, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+force+spectroscopy%3A+optical+tweezers%2C+magnetic+tweezers+and+atomic+force+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Single-molecule force spectroscopy: optical tweezers, magnetic tweezers and atomic force microscopy.</a> Nat Methods. 5, 491-505 (2008).</li>
<li>Yildiz, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Myosin+V+walks+hand-over-hand%3A+single+fluorophore+imaging+with+1.5-nm+localization%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Myosin V walks hand-over-hand: single fluorophore imaging with 1.5-nm localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li>
<li>Joo, C., Balci, H., Ishitsuka, Y., Buranachai, C., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+Single-Molecule+Fluorescence+Methods+for+Molecular+Biology%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Advances in Single-Molecule Fluorescence Methods for Molecular Biology.</a> Annu Rev Biochem. 77 (1), 51-76 (2008).</li>
<li>Hohlbein, J., Craggs, T. D., Cordes, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation%3A+single-molecule+FRET+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation: single-molecule FRET and beyond.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1156-1171 (2014).</li>
<li>Stryer, L., Haugland, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+transfer%3A+a+spectroscopic+ruler%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Energy transfer: a spectroscopic ruler.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 58 (2), 719-726 (1967).</li>
<li>Rasnik, I., Myong, S., Cheng, W., Lohman, T. M., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA-binding+Orientation+and+Domain+Conformation+of+the+E.+coli+Rep+Helicase+Monomer+Bound+to+a+Partial+Duplex+Junction%3A+Single-molecule+Studies+of+Fluorescently+Labeled+Enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">DNA-binding Orientation and Domain Conformation of the E. coli Rep Helicase Monomer Bound to a Partial Duplex Junction: Single-molecule Studies of Fluorescently Labeled Enzymes.</a> J Mol Biol. 336 (2), 395-408 (2004).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+tracking+of+mRNA+exiting+from+RNA+polymerase+II%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule tracking of mRNA exiting from RNA polymerase II.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 105 (1), 135-140 (2008).</li>
<li>Schröder, G. F., Grubmüller, H. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0010465504000748">FRETsg: Biomolecular structure model building from multiple FRET experiments.</a> Comput Phys Commun. 158 (3), 150-157 (2004).</li>
<li>Margittai, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+fluorescence+resonance+energy+transfer+reveals+a+dynamic+equilibrium+between+closed+and+open+conformations+of+syntaxin+1%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Single-molecule fluorescence resonance energy transfer reveals a dynamic equilibrium between closed and open conformations of syntaxin 1.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (26), 15516-15521 (2003).</li>
<li>Kalinin, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+toolkit+and+benchmark+study+for+FRET-restrained+high-precision+structural+modeling%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A toolkit and benchmark study for FRET-restrained high-precision structural modeling.</a> Nat Methods. 9 (12), 1218-1227 (2012).</li>
<li>Choi, J. <a target="_blank" href="http://www.nature.com/nsmb/journal/v23/n2/full/nsmb.3148.html">N6-methyladenosine in mRNA disrupts tRNA selection and translation-elongation dynamics.</a> Nat Struct Mol Biol. 23 (August 2015), 110-115 (2015).</li>
<li>Svensson, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FRET-based+trilateration+of+probes+bound+within+functional+ryanodine+receptors%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">FRET-based trilateration of probes bound within functional ryanodine receptors.</a> Biophys J. 107 (9), 2037-2048 (2014).</li>
<li>Stephenson, J. D., Kenyon, J. C., Symmons, M. F., Lever, A. M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterizing+3D+RNA+structure+by+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Characterizing 3D RNA structure by single molecule FRET.</a> Methods. (2016), 1-11 (2016).</li>
<li>Lee, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+FRET+measurements+within+single+diffusing+biomolecules+using+alternating-laser+excitation%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Accurate FRET measurements within single diffusing biomolecules using alternating-laser excitation.</a> Biophys J. 88 (4), 2939-2953 (2005).</li>
<li>McCann, J. J., Choi, U. B., Zheng, L., Weninger, K., Bowen, M. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimizing+methods+to+recover+absolute+FRET+efficiency+from+immobilized+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Optimizing methods to recover absolute FRET efficiency from immobilized single molecules.</a> Biophys J. 99 (3), 961-970 (2010).</li>
<li>Brunger, A. T., Strop, P., Vrljic, M., Chu, S., Weninger, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Three-dimensional+molecular+modeling+with+single+molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Three-dimensional molecular modeling with single molecule FRET.</a> J Struct Biol. 173, 497-505 (2011).</li>
<li>Schuler, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+of+protein+structure+and+dynamics+-+a+primer%5BTitle%5D)+AND+%22J+nanoboitechnology%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET of protein structure and dynamics - a primer.</a> J nanoboitechnology. 11, Suppl 1. 1-17 (2013).</li>
<li>Choi, U. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET-derived+model+of+the+synaptotagmin+1-SNARE+fusion+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET-derived model of the synaptotagmin 1-SNARE fusion complex.</a> Nat Struct Mol Biol. 17 (3), 318-324 (2010).</li>
<li>Dale, R. E., Eisinger, J., Blumberg, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+orientational+freedom+of+molecular+probes.+The+orientation+factor+in+intramolecular+energy+transfer%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">The orientational freedom of molecular probes. The orientation factor in intramolecular energy transfer.</a> Biophys J. 26 (2), 161-193 (1979).</li>
<li>Kapanidis, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternating-laser+excitation+of+single+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Acc+Chem+Res%22%5BJournal%5D)">Alternating-laser excitation of single molecules.</a> Acc Chem Res. 38 (7), 523-533 (2005).</li>
<li>Muschielok, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+nano-positioning+system+for+macromolecular+structural+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A nano-positioning system for macromolecular structural analysis.</a> Nat Methods. 5 (11), 965-971 (2008).</li>
<li>Muschielok, A., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+nano-positioning+system+to+the+analysis+of+fluorescence+resonance+energy+transfer+networks%5BTitle%5D)+AND+%22J+Phys+Chem+B%22%5BJournal%5D)">Application of the nano-positioning system to the analysis of fluorescence resonance energy transfer networks.</a> J Phys Chem B. 115 (41), 11927-11937 (2011).</li>
<li>Andrecka, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano+positioning+system+reveals+the+course+of+upstream+and+nontemplate+DNA+within+the+RNA+polymerase+ii+elongation+complex%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Nano positioning system reveals the course of upstream and nontemplate DNA within the RNA polymerase ii elongation complex.</a> Nucleic Acids Res. 37 (17), 5803-5809 (2009).</li>
<li>Treutlein, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+Architecture+of+a+Minimal+RNA+Polymerase+II+Open+Promoter+Complex%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Dynamic Architecture of a Minimal RNA Polymerase II Open Promoter Complex.</a> Mol Cell. 46 (2), 136-146 (2012).</li>
<li>Nagy, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+architecture+of+the+archaeal+RNA+polymerase+open+complex+from+single-molecule%5BTitle%5D)+AND+%22FRET+and+NPS.+Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Complete architecture of the archaeal RNA polymerase open complex from single-molecule.</a> FRET and NPS. Nat Commun. 6, 6161(2015).</li>
<li>Grohmann, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Initiation+Factor+TFE+and+the+Elongation+Factor+Spt4%2F5+Compete+for+the+RNAP+Clamp+during+Transcription+Initiation+and+Elongation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">The Initiation Factor TFE and the Elongation Factor Spt4/5 Compete for the RNAP Clamp during Transcription Initiation and Elongation.</a> Mol Cell. 43 (2), 263-274 (2011).</li>
<li>Beckers, M., Drechsler, F., Eilert, T., Nagy, J., Michaelis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+structural+information+from+single-molecule+FRET%5BTitle%5D)+AND+%22Faraday+Discuss%22%5BJournal%5D)">Quantitative structural information from single-molecule FRET.</a> Faraday Discuss. 184, 117-129 (2015).</li>
<li>Bennink, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Unfolding+individual+nucleosomes+by+stretching+single+chromatin+fibers+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Unfolding individual nucleosomes by stretching single chromatin fibers with optical tweezers.</a> Nat Struct Biol. 8 (7), 606-610 (2001).</li>
<li>Chandradoss, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+passivation+for+single-molecule+protein+studies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Surface passivation for single-molecule protein studies.</a> J Vis Exp. (86), e50549(2014).</li>
<li>Würth, C., Grabolle, M., Pauli, J., Spieles, M., Resch-Genger, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Relative+and+absolute+determination+of+fluorescence+quantum+yields+of+transparent+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Relative and absolute determination of fluorescence quantum yields of transparent samples.</a> Nat Protoc. 8 (8), 1535-1550 (2013).</li>
<li>Lakowicz, J. R. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLakowicz%2C+JR+%22Principles+of+Fluorescence+Spectroscopy%22">Principles of Fluorescence Spectroscopy</a>. , Springer US. Boston, MA. (2006).</li>
<li>Korkhin, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evolution+of+complex+RNA+polymerases%3A+The+complete+archaeal+RNA+polymerase+structure%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">Evolution of complex RNA polymerases: The complete archaeal RNA polymerase structure.</a> PLoS Biol. 7 (5), (2009).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Vi presentiamo la procedura di installazione e sperimentale per determinare con precisione l&#39;efficienza FRET tra coloranti collegati tramite linker flessibili ai biomacromolecole, vale a dire, acidi nucleici e / o proteine. Per garantire precise misurazioni smFRET (punto 3), è fondamentale per escludere l&#39;aria dalla camera di flusso in qualsiasi momento durante la misurazione. Inoltre, assicurarsi di non sovraccaricare la camera di flusso con fluorofori. I fluorofori devono essere chiaramente separate per garantire la corretta analisi. Come coppie smFRET, che non presentano sbiancamento del donatore devono essere esclusi dall&#39;analisi, assicurarsi che&gt; 80% delle molecole nel campo visivo sono sbiancato alla fine del film. Per tenere conto di disomogeneità nel campione del β-fattore e il γ-factor, correzione cross-talk e relative efficienze di rilevamento del canale donatore e accettore, rispettivamente, sono calcolati per ogni FRET accoppiare singolarmente. <p class= &quot;Jove_content&quot;&gt; Le impostazioni della fotocamera (tempo di integrazione, di elettroni guadagno moltiplicatore di guadagno pre-amplificatore e di tasso di lettura descritto nella Sezione 3.9) deve essere impostata su valori che danno il miglior compromesso tra rapporto segnale-rumore, gamma dinamica e il tempo-risoluzione. Hanno bisogno di essere ri-aggiustato per i diversi esperimenti o se l&#39;hardware diverso viene utilizzato. I numeri di frame devono essere sufficientemente elevato per assicurare che la maggior parte del donatore molecole candeggiante entro il tempo di osservazione. Per le misure sul spettrometro di fluorescenza (sezioni 7 a 9) un buon compromesso tra l&#39;intensità del segnale e la risoluzione spettrale dei dati registrati deve essere trovato. A tal fine le fessure eccitazione ed emissione percorso dello spettrometro a fluorescenza devono essere adattati in funzione dello strumento utilizzato e la concentrazione del campione. Inoltre, vi presentiamo il metodo di analisi Fast-NPS per ottenere informazioni strutturali di MACROM transitoria o dinamicacomplessi olecular. NPS è stata applicata per rivelare il percorso del non-modello filamento di DNA e la posizione dei fattori di trascrizione iniziazione nel archeali complesso aperto RNA polimerasi. Utilizzando la rete di più di 60 diverse misure di distanza, abbiamo dimostrato che Fast-NPS, equipaggiata con un motore di campionamento di recente implementato (Eilert, T., Beckers, M., Drechsler, F., &amp; Michaelis, J. in preparazione), riduce il tempo necessario per l&#39;analisi di questa rete smFRET complessa ≈2 ordini di grandezza, rispetto al metodo di NPS globale originale 27. la robustezza dell&#39;algoritmo è radicata in un campionatore Metropolis-entro-Gibbs in combinazione con un sistema di rinvenimento parallelo. Fast-NPS mostra riproducibilità esatta dei risultati della rete ed è coerente con i risultati pubblicati in precedenza 30. Diversi metodi sono stati pubblicati con l&#39;obiettivo di dedurre informazioni strutturali da misure smFRET 11 </sup&gt;, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18. Tutti questi approcci forniscono solo un modello specifico colorante. Così, coloranti, che non soddisfano le ipotesi formulate dal rispettivo modello, non possono essere utilizzati o portare a false informazioni strutturali. Fast-NPS, al contrario, permette di selezionare per ogni molecola di colorante un modello diverso. Questo aiuta a spiegare diverso comportamento conformazionale di entrambi, la molecola di colorante stesso, nonché il linker usato per il suo fissaggio. Le frazioni molecolari locali della molecola di colorante, come pure le sue proprietà fisiche determinerà quale modello è più appropriato. Per la rete smFRET analizzato del complesso di inizio archeali, un assunto isotropo per tutti molecole di colorante porta ad una diminuzione drastica in la dimensione dei volumi credibili rispetto al modello classico. In combinazione con una posizione dinamica media per tutti colorante molecole la mediana di tutti dimensioni volumetriche credibili (al 95%) si riduce a meno di 0,5 nm 3. Tuttavia, questi posteriori molecola di colorante non è più coerente con le loro misurazioni sono smFRET, indicando che le ipotesi fatte portare a false informazioni strutturali. Al contrario, i posteriori determinati nel modello classico sono coerenti con le efficienze smFRET determinati. Come l&#39;assunzione di posizione isotropo e / o dinamico media per tutti i coloranti portare a incongruenze, Fast-NPS consente priori molecola di colorante in cui ogni colorante può essere assegnato uno dei cinque modelli. Ogni modello utilizza lo stesso volume accessibile. L&#39;algoritmo per il calcolo dei AVs colorante fa numerose assunzioni. Dapprima, la forma spaziale della fluoroforo è approssimata da una sfera. Così, un diametro tenendo conto WID del fluoroforoesimo, l&#39;altezza e lo spessore dovrebbe essere usato (sezione 12). Inoltre, la forma del linker è approssimata da un&#39;asta flessibile. I valori presentati nella sezione 12 sono stati calcolati per il colorante Alexa 647 collegato tramite un linker 12-C. Ad oggi, non è possibile determinare con precisione a priori quale modello è più adatto, in una geometria sperimentale, e quindi tutti i modelli deve essere testato. In generale, si sceglierà il modello che dà la più piccola dimensione posteriore possibile, pur essendo coerente con i dati. Per verificare se una scelta di modelli è coerente con i dati smFRET, calcoliamo sia il posteriore e la probabilità. Consistenza significa che oltre il 90% dei campioni raccolti posteriore sono all&#39;interno dell&#39;intervallo di confidenza 95% del rischio. Se è vero che il basso l&#39;anisotropia, minore è l&#39;incertezza di distanza, in una rete smFRET disposizioni geometriche delle molecole di colorante devono anche essere presi in considerazione. Così, mentre representing molecole di colorante con una bassa anisotropia di fluorescenza con un modello ISO è una tipica prima scelta, il test di coerenza fornisce un mezzo più diretto per la selezione del modello di tintura corretta. La scelta ottimale di modelli colorante può portare ad un drastico aumento precisione localizzazione e allo stesso tempo mantenere la consistenza della rete con i dati di FRET. Per riassumere, Fast-NPS consente di ottenere informazioni strutturali e dinamiche di grandi complessi macromolecolari. In contrasto con i metodi strutturali comuni come la cristallografia a raggi X o la microscopia elettronica crio questo permette di monitorare complessi altamente flessibili o transitori, così ampliando notevolmente la nostra comprensione meccanicistica dei processi biologici complessi.

Determinare la struttura di una biomolecola è un prerequisito chiave per comprendere la sua funzione. Due metodi consolidati per la determinazione della struttura sono la microscopia crio-elettroni e raggi X cristallografia 1, 2. Oggi, entrambi i metodi forniscono alta risoluzione informazioni strutturali con risoluzione fino al livello angstrom. Questi due metodi sono stati ampiamente utilizzati per chiarire la struttura di grandi biomolecole come complessi proteici. Anche se i metodi esistenti sono costantemente state migliorate nel corso degli ultimi decenni, la complessità delle strutture biologiche pone ancora una sfida importante per la biologia strutturale, in particolare quando le grandi, dinamiche e transitori complessi sono indagati 3. Al fine di studiare le dinamiche di complessi macromolecolari e il rapporto struttura-funzione, in particolare, le metodologie a singola molecola hanno provided informazioni utili 4. Diverse nuove strategie sono state sviluppate fornendo un approccio ortogonale di acquisire informazioni strutturali e dinamiche. Esempi sono ad alta velocità AFM 5, manipolazione meccanica 6, a fluorescenza localizzazione microscopia a 7, così come singola molecola trasferimento di energia per risonanza (smFRET) 8, 9. Da molto presto FRET è stato definito un righello molecolare, a causa della dipendenza distanza sulla scala di lunghezza di biomacromolecole 10. Uno particolarmente interessante applicazione smFRET è quello di utilizzare le informazioni distanza ottenuta da misurazioni smFRET dedurre informazioni 11, 12, 13, 14, 15 strutturale &gt;, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23. Grazie alla elevata risoluzione temporale del smFRET, la posizione delle parti mobili di una struttura proteica può essere localizzato. Tuttavia, al fine di estrarre informazioni quantitative da dati smFRET importanti parametri di correzione sulle molecole di colorante necessario determinare durante la misura 24. Con questi fattori di correzione, l'efficienza FRET E FRET può essere calcolato con la formula <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq1.jpg"> , dove A e D Figura 2). I conti β-fattore per il cross-talk, la fuoriuscita di emissione del donatore nel canale accettore ed è calcolato <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq2.jpg"> dove 'A e I' d sono le intensità di fluorescenza del donatore e la molecola accettore dopo fotobleaching della molecola accettore. La γ-fattore corregge la differenza in termini di efficienza di rilevazione relativi nei due canali nonché le differenze nel rendimento di fluorescenza quantica del donatore e il colorante accettore. Si è calcolata da ogni individuo traccia temporale dai Si noti, che questa descrizione trascura eccitazione diretta della molecola accettore, che talvolta diventa importante e avrebbe bisogno di essere corretto per pure. Per determinare tali fattori di correzione è utile per eccitare sia il donatore e l'accettore in uno schema alternato 25 per distinguere tra i cambiamenti foto-fisiche e dinamiche strutturali. Al fine di ottenere non solo l'efficienza smFRET quantitativi, ma anche informazioni strutturali quantitative, il sistema Nano-posizionamento (NPS) è stato introdotto nel 2008 26. Il nome è stato scelto sulla base delle sue somiglianze con il Global Positioning System basato su satellite (GPS). La NPS è una tecnica ibrida che combina smFRET e X-ray dati cristallografia per la localizzazione di posizioni colorante sconosciuti in complessi biomacromolecular. la cStruttura rystal serve come un quadro di riferimento ei risultati smFRET vengono utilizzati per ottenere informazioni distanza tra una posizione sconosciuta fluoroforo (antenna) e una posizione nota dalla struttura cristallina (satellite). In esperimenti consecutivi le distanze tra l'antenna e diversi satelliti sono misurati e la posizione dell'antenna è determinata mediante un sistema di analisi statisticamente rigoroso basato sulla stima dei parametri bayesiana. Come risultato, non solo la posizione più probabile dell'antenna viene calcolata, ma la sua distribuzione completa incertezza 3D, la cosiddetta posteriori, visualizzata da volumi credibili. Inoltre, NPS è stata ampliata per consentire l'analisi delle reti complete smFRET 27. La NPS è stato utilizzato per risolvere un certo numero di importanti questioni trascrizione eucariotico, cioè il corso del DNA monte, il DNA non-modello e l'mRNA nascente all'interno della RNA polimerasi II allungamento complex 12, 28, dimostra altresì l'effetto di inizio della trascrizione fattori 26 e l'architettura dinamica di un open-promotore complesso 29. Inoltre, il NPS è stato utilizzato per chiarire la struttura del archaeal RNA polimerasi complesso aperto 30 e in particolare la posizione del fattore di trascrizione iniziazione TFE, che si lega competitivamente allo stesso sito come fattore di trascrizione allungamento Spt4 / 5 31. Da allora, un certo numero di approcci strutturali basate smFRET state pubblicate 15, 18, 21, 23. Quando si confrontano diversi metodi strutturali basati smFRET, diventa chiaro che l'apparente precisione del metodo è fortemente dipendente dalla particolare scelta di modelli di tintura. Si deve notare chemolecole di colorante possono presentare comportamento spaziale e orientativo diverso a seconda del loro ambiente locale. A tal fine, fast-NPS stato introdotto 32. Fast-NPS utilizza un algoritmo di campionamento advanced riducendo i tempi di calcolo drasticamente. Inoltre, fast-NPS permette di eseguire una analisi strutturale e per ogni molecola di colorante l'utente può scegliere tra una serie di cinque diversi modelli di tintura che verrà descritto in seguito. Il modello più conservativo, chiamato classico, si assume che il colorante occupa solo una, ma sconosciuto, posizione. In questa posizione, il fluoroforo può ruotare liberamente all'interno di un cono, la cui dimensione è determinata dalla rispettiva (dipendente dal tempo) anisotropia di fluorescenza. L'orientamento del cono non è noto, il che porta a grandi incertezze nella conversione efficienze smFRET misurate in distanze. A questo proposito, il modello è conservatore, poiché porterà alla più piccola precisione rispetto alle altre modalità dyeLS. Solo per distanze molto brevi qualora le ipotesi formulate dal piombo modello classico ad una determinazione della posizione notevolmente errato. Per valori tipici smFRET, la posizione corretta è sempre racchiuso nel comparativamente grande volume credibile. Tuttavia, poiché una maggiore precisione è desiderabile, è importante sviluppare e testare modelli coloranti alternativi, che potrebbe contribuire a migliorare la precisione. Se il colorante gira molto più velocemente rispetto alla durata della fluorescenza intrinseca, il cosiddetto modello iso può essere applicata. Qui, il fattore di orientamento kappa 2 (necessario per il calcolo del raggio Förster caratteristica isotropo <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782eq4.jpg"> ) È impostato su 2/3. Come risultato, i volumi credibili calcolate sono quasi due ordini di grandezza inferiore rispetto a quelle del modello classico 32. Nel caso in cui il fluoroforo si trova in un ambiente che consente non solo reori velocesentazione, ma il movimento in più veloce in tutto il suo volume accessibile, il modello meanpos-iso devono essere utilizzati. In questo modello, il colorante occupa effettivamente solo una posizione media, dove la media spaziale è rappresentato da una conversione distanza polinomio 15. Questo modello si applica se per esempio il colorante (comunemente idrofobica) è collegata ad una regione idrofila, per esempio, il DNA. Applicazione del modello meanpos-iso comporta un'ulteriore riduzione delle dimensioni dei volumi credibili per un fattore di circa due. Tuttavia, un colorante legata ad una proteina potrebbe legarsi reversibilmente a diverse patch idrofobiche suo volume stericamente accessibile (AV). Un fluoroforo che passa istantaneamente tra queste regioni, ma all'interno di una regione sottoposta a rotazione libera e movimento veloce localizzata è meglio descritta dal modello VAR-meanpos-iso. Per una situazione simile in cui il colorante non è libero di ruotare i VAR-meanpos modello si applica. più d etails su questi modelli si possono trovare nella nostra recente pubblicazione 32. Questi modelli offrono un vasto repertorio di conto specifico per i vari ambienti di un colorante potrebbero incontrare e loro applicazione ottimizza saggiamente la sua precisione di localizzazione. In Fast-NPS ogni molecola di colorante attaccato ad una posizione specifica può essere assegnato a un singolo modello, in modo tale che FRET-partner sono autorizzati ad avere modelli diversi. Questo consente la modellazione illimitata e vicino alla natura. Tuttavia, è importante che si compie test statistici rigorosi per garantire che il risultato ottenuto dalla combinazione modello finale è ancora in accordo con i dati sperimentali. Questi test sono inclusi nel software Fast-NPS. Per applicare Fast-NPS ai dati sperimentali è richiesta la misurazione (solo) tre parametri di input. In primo luogo, il colorante-coppia specifica isotropo Förster raggi (/54782/54782eq5.jpg "/&gt;) Devono essere determinate. Pertanto, la resa quantica (QY) del colorante donatori, gli spettri di emissione di fluorescenza del donatore e lo spettro di assorbimento accettore devono essere misurate. Queste misurazioni possono essere effettuate in bulk, utilizzando uno spettrometro standard ed uno spettrometro a fluorescenza. Per ogni coppia, l'R 0 viene quindi calcolato utilizzando la PhotochemCAD freeware e può essere usato nell'analisi NPS. Inoltre, il (tempo risolto) anisotropie fluorescenza delle molecole di colorante bisogno essere ottenuti utilizzando una polarizzazione (e tempo) spettrometro di fluorescenza sensibile. Tuttavia, i parametri di input più importanti per fast-NPS sono le efficienze smFRET misurati su una configurazione microscopia a fluorescenza singola molecola, come un microscopio riflessione a fluorescenza interna totale (TIRFM) . Qui, vi presentiamo un protocollo step-by-step per ottenere dati smFRET e l'applicazione di Fast-NPS (Figura 1).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Preparazione della camera di flusso</td></tr><tr><td>Portacampioni in metallo personalizzato</td><td></td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>vetrini in vetro quarzo, 76&nbsp; mm x 26&nbsp; mm</td><td>Technical Glass Products</td><td>26007</td><td></td></tr><tr><td>vetrini coprioggetti, 60 mm x 24&nbsp; mm</td><td>Marienfeld</td><td>101242</td><td></td></tr><tr><td>detergente, Hellmanex II</td><td>Hellma</td><td>320.001</td><td></td></tr><tr><td>acqua ultrapura da Synergy UV</td><td>Millipore</td><td>2512600</td><td></td></tr><tr><td>Detergente al plasma Zepto</td><td>Diener</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>(3-aminopropil)-trietossisilano, p.a.</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3648</td><td></td></tr><tr><td>metossi PEG-succinimidil valerato, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>MPEG-SVA-5000-1g</td><td></td></tr><tr><td>PEG-succinimidil valerato biotinilato, 5 kDa</td><td>Laysan Bio Inc.</td><td>BIOTIN-PEG-SVA-5000</td><td></td></tr><tr><td>Biocarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761 Sigma&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Carbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2127 Sigma-Aldrich&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>pellicola sigillante (Nescofilm)</td>Tubo flessibile in silicone <td>Fisher Scientific</td><td>12981805</td><td></td></tr><tr><td>Tygon, 0,8&nbsp; mm ID, 2,4&nbsp; Tubi in</td><td></td> polietilene a foro fine, diametro esterno <td></td> 720958 <td></td></tr><tr><td>0,58 mm, diametro esterno 0,96 mm (Smiths Medical)</td><td>Fisher Scientific</td><td>12665497</td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin</td><td>Life Technologies</td><td>A2666<</td><td></td></tr><tr>td colspan="4">Microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale</td></tr><tr><td>Nd:YAG Laser, 532 nm</td><td>Newport Spectra-Physics</td><td>EXLSR-532-100-CDRH</td><td></td></tr><tr><td>laser a stato solido pompato a diodi, 491 nm, laser a diodi Calypso</td><td>Cobolt</td><td>904010050</td><td></td></tr><tr><td>643 nm, iBeam smart</td><td>Toptica</td><td>iBEAM-SMART-640-S</td><td></td></tr><tr><td>specchio dicroico, 532 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-540</td><td></td></tr><tr><td>specchio dicroico, 476 RDC</td><td>Chroma</td><td>F33-476z</td><td></td></tr><tr>filtro<td>acusto-ottico</td><td>sintonizzabile AA Lente cilindrica piano-convessa Opto-Elettronica</td><td>AOTFnC-VIS</td><td></td></tr><tr><td>, f = 75 mm</td><td>Thorlabs</td><td>LJ1703L1-A</td><td></td></tr><tr><td>cilindrica piano-concava, f = -300&nbsp; mm</td><td>Prisma Thorlabs</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, PS 991</td> Lente di messa a fuoco <td>Thorlabs</td><td>PS991</td><td></td></tr><tr><td>, f = 75&nbsp; mm</td><td>Pompa a siringa Thorlabs</td><td>LA1608-B</td><td></td></tr><tr><td>, PHD 2000</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-2002</td><td></td></tr><tr><td>2 motori passo-passo, Z812B</td> Attuatore piezoelettrico <td>Thorlabs</td><td>Z812B</td><td></td></tr><tr><td>, PE4</td><td>Thorlabs</td><td>PE4</td><td></td></tr><tr><td>Laser a diodi IR</td><td>Edmund Optics</td><td>CPS808</td><td>parte del sistema di messa a fuoco</td></tr><tr><td>automatica specchio dicroico, 775 DCXR</td><td>Chroma</td><td>775 DCXR</td><td></td></tr><tr><td>rilevatore di rilevamento della posizione (PSD), PDP90A</td><td>Thorlabs</td><td>PDP90A</td><td>parte del sistema di messa a fuoco automatica</td></tr><tr><td>obiettivo ad immersione in acqua, Plan Apo 60X WI, NA 1.2</td><td>Nikon</td><td></td><td>MRD07601</td></tr><tr><td>specchio dicroico, 645 DCXR</td><td>Chroma</td><td>645 DCXR</td><td>parte del filtro di emissione del percorso di</td></tr><tr><td>emissione, 3RD550-510</td><td>Omega Optical</td><td>3RD550-510</td><td>canale verde in il filtro di emissione del percorso di</td></tr><tr><td>emissione, 3RD660-760</td><td>Omega Optical</td><td>3RD660-760</td> canale <td>rosso nel percorso di emissione</td></tr><tr><td>Telecamera EMCCD, iXon+ DU897EBV</td><td>Andor</td><td>AND-20-00032</td><td></td></tr><tr><td>Telecamera EMCCD, iXon3 DU897D-BV</td><td>Andor</td><td>AND-20-000141</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Varie</td></tr><tr><td>Varian 50</td><td>Cary</td><td></td><td>Spettrometro UV-VIS</td></tr><tr><td>Fluorolog2</td><td>SPEX</td><td></td><td>spettrometro a fluorescenza</td></tr><tr><td>Solis (V4.15)</td><td>Andor</td><td></td><td>software di controllo per la telecamera EM-CCD</td></tr><tr><td>Apt utility utente&nbsp; (V1.022)</td>Software <td>di controllo Thorlabs</td><td></td><td>per i motori piezoelettrici</td></tr><tr><td>Adesivo ottico Norland 68</td><td></td><td>Adesivo Thorlabs</td> PC-AFN-0.8 Perline fluorescenti <td></td></tr><tr><td>multispec rivestite in avidina</td> <td>Kisker Biotech</td><td></td><td>rosso Nilo</td>&nbsp;</tr><tr>Linguaggio tecnico di calcolo <td>Matlab</td><td>Mathworks</td><td></td><td>per software scritto su misura</td></tr><tr><td>Origin (V9.0)</td><td>Software scientifico di grafica e analisi dati</td> <td>Originlab</td><td></td></tr><tr><td>Hellma 105-202-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-202-15-40</td><td>cuvetta ad assorbimento da 1&nbsp; cm lunghezza percorso</td></tr><tr><td>Hellma 105-251-15-40</td><td>Hellma</td><td>105-251-15-40</td><td>cuvetta a fluorescenza con lunghezza percorso 3 mm</td></tr></tbody></table>

informazioni strutturale da singola molecola di fret esperimenti usando il nano-positioning system veloce

Structural Information from Single-molecule FRET Experiments Using the Fast Nano-positioning System

Il trasferimento di energia di risonanza di Förster a molecola singola (smFRET) può essere utilizzato per ottenere informazioni strutturali su complessi biomolecolari in tempo reale. In tal modo, vengono utilizzate più misurazioni smFRET per localizzare una posizione sconosciuta del colorante all'interno di un complesso proteico mediante trilaterazione. Al fine di ottenere informazioni quantitative, il Nano-Positioning System (NPS) utilizza l'analisi probabilistica dei dati per combinare le informazioni strutturali della cristallografia a raggi X con i dati di fluorescenza di una singola molecola per calcolare non solo la posizione più probabile, ma anche la distribuzione di probabilità tridimensionale completa, definita posteriore, che indica l'incertezza sperimentale. Il concetto è stato generalizzato per l'analisi di reti smFRET contenenti numerose molecole di colorante. L'ultima versione di NPS, Fast-NPS, presenta un nuovo algoritmo che utilizza la stima dei parametri bayesiani basata sul campionamento Monte Carlo della catena di Markov e sul temperamento parallelo che consente l'analisi di grandi reti smFRET in un tempo relativamente breve. Inoltre, Fast-NPS consente il calcolo del posteriore scegliendo uno dei cinque diversi modelli per ogni colorante, che tengono conto del diverso comportamento spaziale e orientazionale esibito dalle molecole di colorante a causa del loro ambiente locale.
Qui presentiamo un protocollo dettagliato per ottenere dati smFRET e applicare il Fast-NPS. Forniamo istruzioni dettagliate per l'acquisizione dei tre parametri di input di Fast-NPS: i valori smFRET, nonché la resa quantica e l'anisotropia delle molecole di colorante. Recentemente, l'NPS è stato utilizzato per chiarire l'architettura di un complesso promotore aperto archeo. Questi dati vengono utilizzati per dimostrare l'influenza dei cinque diversi modelli di colorante sulla distribuzione posteriore.

La trascrizione è il primo passo per l'espressione genica in tutti gli organismi. In Archaea, trascrizione è effettuata da un singolo RNA polimerasi (RNAP). Rispetto al eucarioti, il archeali RNAP ha una somiglianza strutturale notevole alle loro controparti eucariotiche, pur avendo una macchina di trascrizione semplice. Così, Archaea può essere utilizzato come sistema modello per studiare eucariotica inizio trascrizione RNA polimerasi II (Pol II). Di recente, l'architettura completa del complesso aperto archeali RNA polimerasi è stata determinata dalla singola molecola tasto e NPS. I dati di analisi dei criteri di rete è stato utilizzato per costruire un modello del completo archeali aperta complesso promotore, che fornisce indicazioni utili nel meccanismo di trascrizione iniziazione. Per chiarire questa struttura, l'efficienza smFRET sono stati misurati tra molecole di colorante antenna sconosciuti situati all'interno del com promotore apertoPlex e diversi noti molecole di colorante satellitare che sono stati incorporati in cinque siti di riferimento nel RNAP, le cui posizioni sono noti da strutture cristallografiche (PPB-ID: 2WAQ) 37. I coloranti antenna erano attaccati a una delle diverse posizioni sul DNA non-template, TFB, TBP o TFE. L'intera rete utilizzata in questo studio consisteva di oltre 60 distanze misurate. Figura 7 riporta il modello del completo archeali complesso aperto promotore costruito dall'analisi NPS. Esso comprende il promotore DNA a doppia elica (chiaro e blu scuro), l'RNA polimerasi (grigio) e l'avvio fattori di trascrizione TBP (viola), TFB (verde) e TFE (giallo). Il modello si sovrappone con i risultati dell'analisi NPS, i volumi credibili, che sono stati calcolati utilizzando il modello classico (A), il modello ISO (B), il modello meanpos-ISO (C), il modello VAR-meanpos-iso (D) e il VaR-meanpos il modello (E). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig1.jpg"> Figura 1: Workflow di acquisizione ed elaborazione dei parametri necessari per il calcolo Fast-NPS. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig2.jpg"> Figura 2: esemplare intensità di fluorescenza traccia temporale di un evento smFRET. Le intensità di fluorescenza del donatore (verde) e la molecola accettore (rosso) che mostra le tre fasi caratteristiche, vale a dire che: smFRET, II: donatore di fluorescenza dopo photobleaching accettore, III: fluorescenza di fondo dopo photobleaching donatore.g2large.jpg "target =" _ blank "&gt; Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig3.jpg"> Figura 3: Rappresentazione schematica della camera di flusso per gli esperimenti smFRET. La camera di flusso è montato su un supporto in metallo personalizzata con i supporti di vetro acrilico. Il sandwich design della camera di flusso comprende un vetro di quarzo (silice fusa) scorrere con due fori per il fissaggio ingresso e uscita tubi, una pellicola sigillante e un vetrino che chiude la camera di flusso. Il prisma per l'illuminazione TIRF è montato sulla parte inferiore della camera di flusso. viti scheda Hollow forniscono l'ingresso e uscite per la camera di flusso. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img> alt = "Figura 4" src = "/ files / ftp_upload / 54782 / 54782fig4.jpg" /&gt; Figura 4: Preparazione del vetrino di quarzo e la pellicola sigillante. disegno meccanico del vetrino di quarzo che indica le posizioni dei fori (espressa in millimetri). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig5.jpg"> Figura 5: disegno meccanico della camera di flusso. Le misure per la porta-prisma di alluminio, acrilico titolari di vetro e alluminio telaio di montaggio sono espresse in millimetri. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> IGURA 6 "src =" / files / ftp_upload / 54782 / 54782fig6.jpg "/&gt; Figura 6: Rappresentazione schematica della configurazione TIRF prisma-tipo usato per gli esperimenti smFRET. Abbreviazioni per i componenti ottici: A, apertura; DM, specchio dicroico; F, filtro per le emissioni; L, obiettivo; M, specchio; O, obiettivo; P, prisma; PSD, posizione sensibile fotodiodo; S, campione; PS, fase di posizionamento; T, telescopio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 7" src="/files/ftp_upload/54782/54782fig7.jpg"> Figura 7: I risultati della simulazione delle diverse ipotesi di modello. Tutte le immagini mostrano la archeali RNA polimerasi (PDB-ID: 2WAQ, vista dall'alto) insieme al modello di promotore di DNA (rispettivamente tDNA e ntDNA in blu e ciano,), TBP (viola), TFB (verde) e TFE (giallo)nel archeali aprire complesso 30. I volumi credibili sono sovrapposti per i risultati della simulazione NPS di (A) il modello classico, (B) del modello ISO, (C) il modello meanpos-iso, (D) il modello VAR-meanpos-iso e (E) il var -meanpos modello. Tutti i volumi sono iscritti al 68% di credibilità. La reti VAR-meanpos classico e sono coerenti con i dati smFRET. Al contrario, le reti dove per tutti i coloranti si sceglie la iso, meanpos-iso o il modello VAR-meanpos-iso non sono coerenti con i dati misurati. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54782/54782fig7large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Presentiamo la procedura di configurazione e sperimentale per ottenere dati smFRET da grandi reti donatore-accettore con un microscopio TIRF. L'analisi passo-passo di queste misurazioni con il software di inferenza bayesiana Fast-NPS fornisce informazioni strutturali ad alta risoluzione attraverso l'applicazione di modelli di coloranti adattati.

Informazioni strutturale da singola molecola di FRET esperimenti usando il Nano-Positioning System Veloce

Single-molecule F&#246;rster Resonance Energy Transfer (smFRET) can be used to obtain structural information on biomolecular complexes in real-time. ...

L'obiettivo generale del sistema di posizionamento Fast Nano è quello di fornire informazioni strutturali in tempo reale sulle biomolecole combinando esperimenti FRET a singola molecola con una rigorosa analisi statistica. Questo metodo risponde a domande chiave nel campo della biologia strutturale, come la localizzazione di domini flessibili in macromolecole dove gli strumenti standard di biologia strutturale non possono essere applicati. Il principale miglioramento dell'NPS veloce rispetto ad altri strumenti strutturali basati su FRET è che diversi modelli di coloranti possono essere confrontati utilizzando non solo le posizioni più probabili, ma una distribuzione di probabilità tridimensionale.Il vantaggio principale di questa tecnica è che combina i dati strutturali del database delle proteine con le misure quantitative di fluorescenza di una singola molecola. Per iniziare la procedura, assemblare una camera di flusso e un portacampioni. Per preparare le viti di ingresso e uscita, avvitare il tubo di silicone nelle viti a linguetta cava e tagliare il tubo dritto su entrambe le estremità con una lama di rasoio.Avvitare le viti a linguetta al portacampioni. Allineare i fori del vetrino al quarzo della camera di flusso con le filettature del supporto del campione. Serrare delicatamente le viti del supporto del bicchiere per fissare la camera di flusso in posizione.Infilare pezzi di tubo in silicone lunghi 20 centimetri nelle viti di ingresso e uscita. Lavare la camera di flusso con 500 microlitri di PBS. Quindi lavare la camera di flusso con 100 microlitri di soluzione di neutravidina in PBS, assicurandosi che si formi una gocciolina all'estremità del tubo di ingresso per evitare che l'aria entri nella camera del campione.Bloccare il tubo di ingresso e di uscita dopo ogni manipolazione per escludere l'aria dalla camera di flusso. Incubare la camera per 15 minuti a temperatura ambiente. Quindi, lavare la soluzione di neutravidina con 500 microlitri di PBS.Aggiungere una goccia di olio da immersione sul prisma e avvitare il prisma sulla camera del campione. I dati FRET a singola molecola vengono acquisiti utilizzando un microscopio a fluorescenza a riflessione interna totale. Avviare il software della fotocamera e il software del piezomotore dello stage.Montare la camera sul tavolino micrometrico del microscopio TIRF orizzontalmente, il più dritto possibile e in modo tale da intersecare tutti e tre i laser. Aggiungere il liquido di immersione e mettere a fuoco l'obiettivo del microscopio controllando i riflessi IR. Impostare i parametri della fotocamera, il percorso del file e i parametri di incremento automatico.Avvia il feed live della telecamera e sbianca la fluorescenza di fondo utilizzando tutti e tre i laser con intensità massima. Quindi, abbassare l'intensità del laser. Quindi, caricare 100 microlitri di una soluzione di perline fluorescenti nella camera.Attendere 10 minuti affinché le perline si leghino alla superficie della camera. Registra un filmato con un campo visivo da 50 a 100 perline ed esegui un'analisi batch con una soglia di rilevamento del picco elevata. Carica il file del filmato e scegli due perline con centri distinti agli angoli opposti del campo visivo.Seleziona i pixel di massima intensità in quelle perline. Rimuovere e pulire il prisma. Preparare una seconda camera per campioni e avvitare il supporto del prisma sulla camera.Montare la camera sul tavolino micrometrico. Quindi, caricare nella camera 100 microlitri di una soluzione da 50 a 100 picomolari di campione marcato con fluorescenza biotinilata. Attendere che le molecole si leghino alla superficie della camera.Contemporaneamente fare clic su Prendi segnale per avviare la registrazione e accendere il laser di eccitazione del donatore. Regola la potenza del laser per assicurarti che almeno l'80% delle molecole nel campo visivo siano sbiancate, quindi sposta la camera per mostrare un'area non sbiancata e registra il filmato successivo. Sbiancare il resto della camera del campione in questo modo.Dopo le misurazioni al microscopio TIRF, i dati FRET a singola molecola acquisiti devono essere analizzati per ottenere l'efficienza FRET media. Eseguire un'analisi batch dei filmati donatori e accettori del campione. Quindi, caricare i file del filmato in batch nel software di analisi dei dati.Cliccare sul pulsante NON selezionato per indicare le singole fasi FRET. Fare clic sull'inizio del periodo FRET, quindi sul punto temporale in cui l'intensità dell'accettore diminuisce a causa dello sbiancamento e infine sul punto temporale in cui l'intensità del donatore diminuisce a causa dello sbiancamento. Nella finestra successiva, selezionare Sì per mantenere la traccia di efficienza FRET selezionata.Una volta che ogni molecola è stata analizzata, salva le tracce e analizza il filmato successivo. Una volta completata l'analisi, eseguire uno script per combinare i risultati FRET. Importare il file FRET combinato per fotogramma nel software di analisi dei dati utilizzando l'opzione di input predefinita.Traccia i dati come un istogramma e usa lo strumento di adattamento della curva non lineare per adattarli a una gaussiana. Il valore di superamento è l'efficienza FRET principale. Utilizzare l'UV VIS e la spettroscopia fluorescente per determinare il raggio di Forster isotropo e i valori di anisotropia allo stato stazionario per ciascun colorante.Il sistema di nano-posizionamento è stato ispirato dal noto GPS, in quanto localizziamo una posizione sconosciuta, l'antenna, con diverse posizioni note, i satelliti. Per iniziare l'analisi NPS, avviare il software FastNPS e creare un nuovo jobfile. Per definire le priorità di posizione delle antenne e dei satelliti etichettati, nella finestra ModelDyePrior, immettere la risoluzione spaziale della posizione da definire.Escludere l'interno della macromolecola caricando il file PDB centrato corrispondente. Immettere il diametro del colorante e la distanza di scheletratura. Inserire le coordinate di posizione minima e massima della possibile posizione del colorante.Se la posizione da definire è un satellite, selezionare l'attacco del colorante tramite il linker flessibile e immettere le coordinate dell'atomo dal file PDB centrato. Inserire la lunghezza e il diametro del linker. Fare clic su calcola volume accessibile, salvare la posizione precedente ed esportarla per la visualizzazione.Ripetere questa procedura per tutti i satelliti e le antenne. Una volta definite le posizioni, aprire la finestra Definisci misura e creare una nuova molecola di colorante. Caricare la posizione precedente associata a quel colorante.Riempi l'anisotropia della fluorescenza, seleziona un modello di colorante appropriato e attiva il colorante. Ripeti questo processo fino a quando tutti i coloranti sono stati definiti. Quindi, crea una nuova misurazione.Selezionare una coppia di FRET tra i coloranti definiti. Inserire l'efficienza FRET a singola molecola con errore e il raggio di Forster isotropo di questa coppia di coloranti e attivare la misurazione. Ripeti l'operazione per tutte le coppie di coloranti.Quindi, apri la finestra di calcolo. Se i coloranti sono stati assegnati a modelli diversi, selezionare Definito dall'utente. In caso contrario, selezionare il modello da utilizzare per tutti i coloranti.Eseguire il calcolo e aprire la finestra dei risultati. Quando si utilizza FastNPS, è importante ricordare di adattare i modelli per tutti i coloranti al fine di ridurre al minimo i volumi credibili, pur rimanendo ovviamente coerenti. Se la consistenza è inferiore al 90%, fai clic su Coerenza dettagliata e identifica i coloranti comuni alle voci con una coerenza inferiore al 90%.Aprire la finestra Definisci misura e modificare il modello del colorante in questione. Eseguire nuovamente il calcolo nella modalità Definito dall'utente. Esporta i volumi credibili dei coloranti singolarmente o in batch.Apri i file di densità nel software di visualizzazione e regola la credibilità al livello desiderato. Le efficienze FRET a singola molecola sono state misurate tra molecole antenna sconosciute e diverse molecole satelliti note all'interno di un complesso promotore aperto di RNA polimerasi archea. L'analisi NPS di questi dati ha determinato i volumi credibili di queste molecole di colorante rispetto al complesso promotore aperto dell'RNA polimerasi archea.Sono stati utilizzati cinque diversi modelli in cui sono state utilizzate le molecole di colorante e sono stati confrontati i risultati. I volumi credibili erano coerenti con i dati misurati quando calcolati con modelli che presumevano che il colorante potesse ruotare liberamente solo all'interno di un cono di orientamento sconosciuto. Il modello classico, in particolare, è il più conservativo, in quanto presuppone inoltre che la tintura si trovi in una posizione fissa.Questo crea un volume credibile relativamente grande, ma il volume generalmente racchiude la posizione corretta. I modelli di precisione più elevata utilizzano il presupposto che il colorante sia completamente libero di ruotare durante la sua vita di fluorescenza. Il modello iso, come il modello classico, presuppone che il colorante si trovi in una posizione fissa all'interno del volume accessibile.Il modello meanpos-iso assume la media dinamica su tutte le posizioni possibili. Sebbene i volumi credibili dei modelli iso siano molto più piccoli di quelli calcolati dai modelli non iso, sono incoerenti con i dati misurati. Volevamo sviluppare una tecnica che ci permettesse di catturare informazioni strutturali dinamiche di complessi transitori, un problema che non poteva essere affrontato dagli strumenti strutturali esistenti.Una volta registrati i dati FRET a singola molecola, l'analisi FastNPS viene eseguita in un paio d'ore, consentendo un rapido confronto tra diversi modelli di coloranti. Seguendo questa procedura, altri metodi come le simulazioni MD possono essere eseguiti successivamente al fine di ottenere modelli strutturati coerenti con i dati FRET sperimentali a singola molecola.

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Biochemistry

Biochimica

In questo articolo viene descritto come si ottiene FRET tracce di molecole di DNA individuale immobilizzato su una superficie utilizzando un microscopio a scansione automatica confocale.

Sistema automatico per le misure di fluorescenza singola molecola di superficie, immobilizzato Biomolecole

Descriviamo un metodo per localizzare fluorescente proteine ​​marcate nel microscopio elettronico. Fluorescenza viene prima localizzato con foto-attivato microscopia localizzazione su sezioni ultrasottili. Queste immagini vengono quindi allineati al microscopio elettronico della stessa sezione.

Nano-Fem: la localizzazione delle proteine ​​Usando Photo-attivato Microscopia Localizzazione e microscopia elettronica

Fluorofori singoli possono essere localizzati con precisione nanometrica utilizzando FIONA. Ecco un riassunto della tecnica FIONA è segnalato, e come condurre esperimenti Fiona è descritto.

Imaging di fluorescenza con One nanometri Precisione (FIONA)

In questo articolo viene descritto un metodo per studiare la struttura di un fotorecettore proteico utilizzando la microscopia a forza atomica (AFM). Il PeakForce Quantitative Nanomechanical Property Mapping (PF-QNM) rivela dimeri proteici intatti su una superficie di mica.

Microscopia a forza atomica di Red-Light Fotorecettori Uso della mappatura PeakForce Quantitative nanomeccanico Proprietà

Viene presentato un protocollo per accoppiare covalentemente una grande varietà di singole molecole su una punta AFM. Vengono fornite procedure ed esempi per determinare la forza di adesione e l'energia libera di queste molecole su supporti solidi e bio-interfacce.

Indagare singola molecola di adesione da Atomic Spectroscopy Forza

Recentemente sono stati sviluppati numerosi biosensori di forza basati su FRET, che consentono la risoluzione proteina-specifica della forza intracellulare. In questo protocollo, dimostriamo come uno di questi sensori, progettato per il linker della proteina del complesso nucleoscheletro-citoscheletro (LINC) Nesprin-2G, possa essere utilizzato per misurare le forze di actomiosina sul complesso nucleare LINC.

Un protocollo per l&#39;utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

Qui viene presentato un protocollo per esperimenti FRET ad alta precisione a livello di singola molecola. Inoltre, questa metodologia può essere usata per identificare tre stati conformazionali nel dominio legante del legame del recettore N-metil-D-aspartato (NMDA). Determinare le distanze precise è il primo passo verso la costruzione di modelli strutturali basati su esperimenti FRET.

FRET di alta precisione a singolo livello molecolare per la determinazione della struttura biomolecola

Questo dettagli del protocollo la costruzione e il funzionamento di un microscopio di rilevamento in tempo reale 3D singola particella capace di rilevamento su scala nanometrica fluorescente sonde ad alta velocità diffusiva e tassi di conteggio basso del fotone.

Un protocollo per il monitoraggio in tempo reale 3D singola particella

Il potenziamento della fluorescenza indotto da proteine a singola molecola risolto nel tempo è un utile sensore di prossimità spettroscopico a fluorescenza sensibile ai cambiamenti strutturali locali nelle proteine. Qui mostriamo che può essere usato per scoprire conformazioni locali stabili in α-sinucleina, che è altrimenti nota come globulare non strutturata e instabile quando misurata usando il righello FRET a lungo raggio.

Utilizzo del miglioramento della fluorescenza indotta da proteine risolte nel tempo per identificare le conformazioni locali stabili un monomero α-sinucleina alla volta

Questo articolo presenta un metodo per l'analisi spaziotemporale di sonde mobili a singola molecola basate sul trasferimento di energia di risonanza di Förster (smFRET) utilizzando la microscopia a fluorescenza a campo largo. Il toolkit software di nuova concezione consente la determinazione delle tracce temporali smFRET delle sonde in movimento, compresa la corretta efficienza FRET e le posizioni molecolari, come funzioni del tempo.

Analisi spaziotemporale bidimensionale automatizzata di sonde FRET mobili a singola molecola

Questo protocollo descrive l'applicazione della microscopia a forza atomica e della spettroscopia infrarossa su scala nanometrica per valutare le prestazioni della spettroscopia infrarossa fototermica su scala nanometrica nella caratterizzazione di campioni multipolimerici tridimensionali.

Progressi nella spettroscopia infrarossa su scala nanometrica per esplorare sistemi polimerici multifase

Scopri come ottenere dati FRET a singola molecola usando il microscopio TIRF e il software FastNPS per l'analisi strutturale delle biomolecole. Questo metodo combina misurazioni quantitative con inferenza bayesiana.

Informazioni strutturale da singola molecola di FRET esperimenti usando il Nano-Positioning System Veloce

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