Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

Viene presentato un protocollo per la sintesi e la cationizzazione della magnetoferritina drogata con cobalto, nonché un metodo per magnetizzare rapidamente le cellule staminali con magnetoferritina cationizzata.

L'obiettivo generale di questo metodo è quello di sintetizzare una nanoparticella magnetica all'interno di una gabbia proteica e quindi di funzionalizzare la proteina in modo tale da consentire un rapido attaccamento della nanoparticella magnetica alle cellule. Questo metodo può essere utilizzato per generare nanoparticelle magnetiche che consentono una marcatura magnetica rapida ed efficiente delle cellule, che è importante per applicazioni come la risonanza magnetica o la separazione magnetica delle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la magnetizzazione cellulare può essere ottenuta utilizzando basse concentrazioni di nanoparticelle e brevi tempi di incubazione, il che previene potenziali effetti negativi dovuti all'esposizione alle nanoparticelle.

Per iniziare, deossigenare 500 millilitri di acqua deionizzata inserendo nell'acqua un tubo collegato a una bombola di azoto gassoso e sigillando il recipiente con pellicola trasparente. Quindi, far bollire l'azoto gassoso per circa 60 minuti. Riscaldare un bagno d'acqua collegato al recipiente di reazione a doppia camicia a 65 gradi Celsius.

Quindi, aggiungere 75 millilitri di tampone HEPES da 50 millimolari, pH 8,6 nel recipiente di reazione. Sigillare il recipiente e deossigenare facendo gorgogliare azoto gassoso attraverso la soluzione tampone per circa 20 minuti. Allo stesso tempo, mescolare la soluzione tampone utilizzando un agitatore magnetico.

Dopo aver deossigenato la soluzione tampone HEPES, rimuovere la provetta di azoto dal tampone, mantenendola sospesa sopra la soluzione per mantenere un'atmosfera di azoto. Aggiungere l'apoferritina per ottenere una concentrazione finale di 3 milligrammi per millilitro. Continuare l'agitazione magnetica, ma ridurre la velocità di agitazione se si verifica la formazione di schiuma.

Per la sintesi della magnetoferritina, utilizzare due pompe a siringa per iniettare contemporaneamente 10,1 millilitri del precursore ferro-cobalto e 10,1 millilitri di perossido di idrogeno nella soluzione di apoferritina a una velocità di flusso di 0,15 millilitri al minuto. Continuare con i passaggi di sintesi come descritto nel protocollo di testo. Quindi, caricare il campione su una colonna contenente una matrice cationica utilizzando una pompa peristaltica a una portata di 10 millilitri al minuto.

Lavare la colonna con circa 100 millilitri di tampone di marcia utilizzando una pompa a gradiente ad una portata di 10 millilitri al minuto. Per eluire la proteina, lavare la colonna con 150 millilitri di concentrazioni crescenti di cloruro di sodio e tampone tris a 10 millilitri al minuto. Quando la proteina eluisce a una concentrazione di cloruro di sodio di 500 millimolari, raccoglierla in frazioni di 50 millilitri utilizzando un collettore di frazioni automatizzato.

Concentrare i 150 millilitri di magnetoferritina a un volume di circa due millilitri utilizzando un'unità di filtro centrifugo da 15 millilitri seguita da un'unità di volume di quattro millilitri. Fare riferimento alle istruzioni del produttore delle unità filtro centrifughe per un protocollo dettagliato di questa procedura. Quindi, caricare il campione concentrato su una colonna di filtrazione su gel utilizzando un circuito di iniezione.

Lavare la colonna con tampone di scorrimento a una velocità di flusso di 1,3 millilitri al minuto. Raccogli frazioni da sei millilitri utilizzando un raccoglitore di frazioni automatizzato. I monomeri proteici eluiscono per ultimi.

A questo punto, la magnetoferritina purificata può essere conservata a quattro gradi Celsius fino alla cationizzazione. Per 10 milligrammi di magnetoferritina, pesare 374 milligrammi di DMPA e sciogliere in 2,5 millilitri di tampone MES da 200 millimolari. Regolare il pH della soluzione a circa sette utilizzando acido cloridrico concentrato.

I fumi tossici vengono rilasciati quando si regola il pH della soluzione DMPA con acido cloridrico. Assicurati di maneggiare questi materiali in una cappa aspirante. Aggiungere 2,5 millilitri di soluzione di magnetoferritina a quattro milligrammi per millilitro.

Aggiungere un agitatore magnetico e mescolare per due ore per equilibrare. Dopo aver regolato la soluzione a pH 5,0, aggiungere 141 milligrammi di polvere EDC alla soluzione di magnetoferritina DMPA. Continuate a mescolare per tre ore e mezza.

Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron per rimuovere eventuali precipitati e dializzare la proteina come descritto nel protocollo di testo. Colture hMSC come descritto nel protocollo di testo. Lavare le celle placcate con due millilitri di PBS a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere un millilitro della soluzione sterilizzata di magnetoferritina cationizzata alle cellule placcate prima di incubare per il periodo di tempo desiderato. Lavare le cellule con PBS, quindi raccoglierle aggiungendo 0,5 millilitri di tripsina-EDTA e incubando a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver aggiunto un millilitro di terreno di coltura per inattivare la tripsina EDTA, trasferire la soluzione in una provetta da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 524 volte G.Scartare il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 millilitri di tampone di separazione magnetica.

Quindi, attacca il magnete al supporto multiplo e aggiungi una colonna di separazione magnetica al magnete. Posizionare un filtro di pre-separazione sulla colonna. Quindi, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di separazione magnetica al filtro di pre-separazione e lasciarlo scorrere sia attraverso il filtro che la colonna per lavarli.

Quindi, posizionare una provetta da centrifuga da 15 millilitri sotto la colonna e aggiungere 0,5 millilitri della sospensione cellulare al serbatoio del filtro della colonna di separazione magnetica. Quando il serbatoio è vuoto, aggiungere 0,5 millilitri di tampone di separazione magnetica. Quando il serbatoio si svuota di nuovo, aggiungere altri 0,5 millilitri di tampone di separazione magnetica.

Ripetere il lavaggio ancora una volta, per un volume totale di tampone di separazione magnetica di 1,5 millilitri. Questa fase di lavaggio eluisce tutte le celle non magnetizzate dalla colonna. Rimuovere la colonna dal magnete e metterla in una provetta da centrifuga fresca da 15 millilitri.

Quindi, rimuovere il filtro dal serbatoio della colonna. Aggiungere 1 millilitro di tampone di separazione magnetica al serbatoio e spingere immediatamente attraverso la colonna utilizzando lo stantuffo fornito dal produttore. Questo eluisce le celle magnetizzate dalla colonna nella provetta da centrifuga.

Procedere con l'esecuzione della quantificazione del ferro come descritto nel protocollo di testo. Le immagini al microscopio elettronico a trasmissione di campioni di magnetoferritina colorati negativamente hanno mostrato che le nanoparticelle si sono formate all'interno della gabbia proteica. Le misure del potenziale zeta confermano che la magnetoferritina ha ottenuto una carica superficiale positiva dopo la cationizzazione.

L'esposizione di cellule staminali mesenchimali umane alla magnetoferritina cationizzata per un minuto ha provocato la magnetizzazione del 92% della popolazione cellulare e la consegna di 3,6 picogrammi di ferro per cellula. L'aumento del tempo di incubazione a 15 minuti ha provocato la magnetizzazione dell'intera popolazione cellulare. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di come sintetizzare una nanoparticella magnetica all'interno della cavità dell'apoferritina aggiungendo in sequenza precursori di sali metallici alla soluzione proteica.

E poi, come cationizzare chimicamente la proteina usando l'accoppiamento TMPA. Una volta padroneggiata, la sintesi, la purificazione e la cationizzazione della magnetoferritina possono essere eseguite in tre giorni se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante evitare la contaminazione da ossigeno e mantenere la temperatura e il pH corretti durante la sintesi della magnetoferritina.

A seguito di questa procedura, altri carichi come punti quantici o agenti terapeutici possono essere incapsulati nella gabbia dell'apoferritina cationizzata per ottenere una consegna più efficiente di tali materiali alle cellule. Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della manipolazione cellulare magnetica per esplorare la marcatura magnetica in cellule che mostrano uno scarso assorbimento di nanoparticelle o che sono molto sensibili all'esposizione prolungata alle nanoparticelle o a concentrazioni elevate di nanoparticelle.