Name: Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-13T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Scopri la sintesi di magnetoferritina cationizzata per la magnetizzazione ultra-veloce di cellule staminali. Questo metodo consente l'etichettatura magnetica efficiente con basse concentrazioni di nanoparticelle per applicazioni in MRI e separazione cellulare.

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Questo lavoro è stato finanziato attraverso il Bristol Centre for Functional Nanomaterials, sponsorizzato dall'Engineering and Physical Sciences Research Council (codice di sovvenzione EPSRC EP/G036780/1).

cellule staminali mesenchimali umane (hMSC) sono state raccolte dal prossimale del femore midollo osseo di pazienti artrosici sottoposti a chirurgia di sostituzione totale dell&#39;anca, in pieno accordo con le linee guida Bristol Southmead Hospital Comitato Etico della Ricerca (riferimento # 078/01) e dopo il consenso del paziente è stato ottenuto. 1. Magnetoferritin Sintesi e purificazione <ol><li> Revisione generale <ol><li> Eseguire sintesi magnetoferritin in un recipiente di reazione a doppia camicia sigillabile a 65 ° C sotto atmosfera di azoto per limitare l&#39;ossidazione dei precursori metallici. Iniettare soluzioni saline metallo e perossido di idrogeno attraverso porte di accesso nel coperchio nel recipiente di reazione con una pompa a siringa. </li><li> Dopo la sintesi magnetoferritin, purificare la proteina da cromatografia a scambio anionico (vedi sezione 1.4) per rimuovere le nanoparticelle non racchiusi nella cavità di proteine, seguiti da cromatografia di esclusione molecolare (vedi sezione 1.5) per isolare monomeri di proteine. dela concentrazione di proteine ​​Termine utilizzando un saggio Bradford (vedere paragrafo 1.6). </li></ol></li><li> I preparativi prima di sintesi <ol><li> Deoxygenate 500 ml di acqua deionizzata posizionando un tubo collegato ad una bombola di gas di azoto nell&#39;acqua, sigillando il contenitore con pellicola trasparente e gorgogliare attraverso azoto gassoso per circa 60 min. </li><li> Scaldare a bagnomaria collegato al recipiente doppia reazione camicia a 65 ° C. Aggiungere 75 ml di 50 mM 4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic (HEPES) tampone (pH 8.6) nel recipiente di reazione, sigillare il vaso e deoxygenate facendo gorgogliare azoto attraverso la soluzione tampone per circa 20 min. Allo stesso tempo, agitare la soluzione tampone con un agitatore magnetico. </li><li> Dopo deoxygenating la soluzione tampone HEPES, rimuovere il tubo alimentazione del gas di azoto dal buffer e tenerlo sospeso nel recipiente per mantenere un&#39;atmosfera di azoto. Aggiungere apo-ferritina per ottenere una concentrazione finale di 3 mg / ml. Continuare l&#39;agitazione magnetica, ma riducono la velocità di agitazione, se si verifica la formazione di schiuma. </li><li> Preparare una soluzione 25 mM magazzino di solfato di cobalto eptaidrato sciogliendo 0,19 g in 50 ml di acqua deionizzata deoxygenated. </li><li> Preparare una soluzione 25 mM di ferro ammonio soluzione di solfato esaidrato sciogliendo 0,98 g in 100 ml di acqua deionizzata deossigenato. </li><li> Rimuovere 2,5 ml della soluzione di solfato di ferro esaidrato ammonio e sostituirlo con 2,5 ml di solfato di cobalto eptaidrato. </li><li> Preparare una soluzione 8,33 mM di perossido di idrogeno in acqua deionizzata deossigenata aggiungendo prima 965 ml di una soluzione di perossido di idrogeno (30% w / w) in 9 ml di acqua deionizzata deossigenato, e poi aggiungendo 1 ml di questa sub-stock da 99 ml di acqua deionizzata deoxygenated. </li></ol></li><li> sintesi Magnetoferritin <ol><li> Iniettare 10.1 ml sia il precursore di ferro-cobalto e il perossido di idrogeno simultaneamente nella soluzione apo-ferritina (magneticamente stirred) ad una portata di 0,15 ml / min utilizzando due pompa a siringa (volume totale iniettato: 20,2 ml). </li><li> Durante il periodo di iniezione, deoxygenate altri 500 ml di acqua deionizzata. NOTA: Il contenuto del recipiente di reazione adottare gradualmente un colore marrone scuro al procedere della reazione. </li><li> Poco prima del completamento della prima iniezione, preparare altri 100 ml di ferro-cobalto precursore e soluzione di perossido di idrogeno utilizzando acqua deionizzata appena deossigenato. </li><li> Ripetere la fase di iniezione descritto in 1.3.1 utilizzando soluzioni preparate al momento di ferro-cobalto e perossido di idrogeno. </li><li> Durante il periodo di iniezione, deoxygenate altri 500 ml di acqua deionizzata, e procedere come descritto in 1.3.3 e 1.3.4. </li><li> Dopo la terza iniezione, lasciare la soluzione a maturare per 15 minuti sotto agitazione. </li><li> Aggiungere 1,5 ml di una soluzione di citrato di sodio 1 M al recipiente di reazione per chelare ioni metallici liberi in soluzione. </li><li> Rimuovere la soluzione dalla reazionenave in 50 ml provette da centrifuga, centrifuga per 30 minuti a 4.350 xg e passare il surnatante attraverso un filtro siringa da 0,22 micron. In questa fase, il surnatante filtrato può essere conservato a 4 ° C fino purificazione. </li></ol></li><li> Ion cromatografia a scambio <ol><li> Caricare il campione su una colonna (2,5 cm di diametro, lunghezza 20 cm) contenente una matrice cationico utilizzando una pompa peristaltica ad una portata di 10 ml / min. </li><li> Lavare la colonna con circa 100 ml di tampone di corsa (tampone 50 mM Tris (idrossimetil) amminometano (Tris), pH 8,0) mediante una pompa di gradiente a una portata di 10 ml / min. </li><li> Per eluire la proteina, lavare la colonna a 10 ml / min con concentrazioni crescenti di cloruro di sodio (NaCl) in tampone Tris: 150, 500 e 1000 mM finale concentrazione di NaCl, 150 ml di ciascuna concentrazione. </li><li> Poiché la proteina eluisce ad una concentrazione di NaCl di 500 mM, raccoglierlo in 50 ml frazioni utilizzando un raccoglitore di frazioni automatizzato. NOTA: Per unaprotocollo dettagliato della cromatografia a scambio ionico consultare i protocolli precedentemente pubblicati. 26 </li></ol></li><li> Esclusione dimensioni cromatografia <ol><li> Concentrato 150 ml di magnetoferritin ad un volume di circa 2 ml utilizzando un gruppo di filtraggio 15 ml centrifuga seguita da una unità di volume 4 ml. Fare riferimento alle istruzioni del produttore delle unità di filtro centrifugo (vedi elenco dei materiali) per un protocollo dettagliato di questa procedura. </li><li> Caricare il campione concentrato su una colonna di gel filtrazione utilizzando un ciclo di iniezione. </li><li> Lavare la colonna con tampone di corsa (50 tampone mM Tris, pH 8,0, contenente 150 mM NaCl) a una portata di 1,3 ml / min. </li><li> Raccogliere 6 ml frazioni utilizzando un raccoglitore di frazioni automatizzato. monomeri di proteine ​​eluiscano scorso. A questo punto, magnetoferritin purificato può essere conservato a 4 ° C fino cationizzazione. NOTA: Per un protocollo dettagliato di dimensioni esclusione cromatografia usando una colonna di gel filtrazione consultare previoamente pubblicato protocolli. 27 </li></ol></li><li> Determinare la concentrazione di proteine <ol><li> Preparare standard ferritina di 0,06, 0,125, 0,25, 0,5 e 1 mg / ml in tampone 50 mM Tris utilizzando commercialmente disponibile cavallo milza ferritina. NOTA: La concentrazione proteica di ferritina commercialmente disponibile è riportata sul flacone. In caso contrario, contattare il fornitore per queste informazioni. </li><li> Diluire i campioni magnetoferritin di concentrazione sconosciuta in 50 mM Tris tampone finché il colore della soluzione corrisponde a circa il colore dello standard 0,5 mg / ml. Prendere nota del fattore di diluizione. </li><li> Aggiungere 10 ml di ogni campione standard e magnetoferritin in triplice copia in pozzetti di una piastra da 96 pozzetti. </li><li> Aggiungere 200 ml di reagente di ready-made Bradford a ciascun bene (fare riferimento alla lista dei materiali per Bradford dettagli dosaggio reagenti). </li><li> Incubare a temperatura ambiente per 8 minuti. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a λ = 595 nm utilizzandoun lettore di micropiastre. </li><li> Tracciare la assorbanza media degli standard ferritina in funzione della concentrazione di proteine ​​e utilizzare la pendenza e l&#39;intercetta della regressione lineare per calcolare la concentrazione del campione magnetoferritin. NOTA: Prendere in considerazione il fattore di diluizione che è stato utilizzato per regolare il campione magnetoferritin alla curva standard. </li></ol></li></ol> 2. Magnetoferritin cationizzazione <ol><li> Revisione generale NOTA: Per magnetoferritin cationizzazione, N, N&#39;-dimetil-1,3-propandiammina (DMPA) è stata accoppiata con residui di acido aspartico e glutammico sulla superficie MF usando N - (3-dimetilamminopropil) - N &#39;cloridrato -ethylcarbodiimide (EDC). <ol><li> Effettuare la reazione a temperatura ambiente sotto agitazione. Il protocollo indicato di seguito è per la cationizzazione di 10 mg di magnetoferritin in un volume totale di 5 ml (concentrazione proteica 2 mg / ml). Tuttavia, scalare verso l&#39;alto o verso il bassomantenendo la proteina: DMPA: rapporti EDC coerente, così come i volumi della soluzione tampone e magnetoferritin. </li><li> Prima della reazione cationizzazione, dializzare i campioni magnetoferritin in 50 mM tampone fosfato (pH 7) contenente 50 mM NaCl. Questo è importante rimuovere tampone di eluizione Tris ed evitare reazioni indesiderate tra l&#39;ammina Tris e residui EDC-attivati ​​di acidi carbossilici. Determinare la concentrazione di proteine ​​dopo la dialisi e regolarlo a 4 mg / ml prima cationizzazione. </li></ol></li><li> protocollo cationizzazione <ol><li> Pesare 374 mg di DMPA e sciogliere in 2,5 ml di 200 mM 2- (N -morpholino) di acido etansolfonico (MES) buffer. </li><li> Regolare il pH della soluzione a circa 7 usando concentrato (6 M) di acido cloridrico (HCl). ATTENZIONE: Eseguire questo passaggio in una cappa aspirante, come aggiunta dell&#39;acido di DMPA rilascia fumi tossici! </li><li> Aggiungere 2,5 ml di soluzione magnetoferritin a 4 mg / ml (concen finalestrazione di MES è 100 mM, concentrazione finale di magnetoferritin è 2 mg / ml, la quantità totale di proteine ​​è 10 mg). </li><li> Aggiungere un agitatore magnetico e mescolare per 2 ore a equilibrare. </li><li> regolare con cura la soluzione a pH 5,0 con 1 M HCl. </li><li> Aggiungere 141 mg di EDC in polvere alla soluzione DMPA / magnetoferritin. </li><li> Continuare a mescolare per 3,5 ore. </li><li> Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron per rimuovere eventuali precipitati. </li><li> Aggiungere la soluzione al tubo di dialisi con un 12-14 kDa di peso molecolare cut-off e dializzare contro 4 L di tampone fosfato 50 mM (pH 7) contenente 50 mM NaCl per 2 giorni a 4 ° C, sostituendo il tampone di dialisi almeno tre volte in quel periodo. NOTA: A questo punto, magnetoferritin cationizzato può essere conservato a 4 ° C fino all&#39;utilizzo. </li></ol></li></ol> 3. mesenchimali umane Stem Cell Etichettatura con cationizzato Magnetoferritin <ol><li> Revisione generale <ol><li&gt; eseguire tutte coltura cellulare utilizzando la classe II cappe a flusso laminare e incubatori umidificato a 37 ° C e 5% di anidride carbonica nell&#39;atmosfera. </li><li> La cultura come cellule monostrato con 175 centimetri 2 fiaschi e 20 ml di terreno di coltura, che è stato rifornito ogni 3 - 4 giorni. Il terreno di coltura costituito da Modified mezzo di Eagle Dulbecco (DMEM) contenente 1,000 mg / L di glucosio, 10% (v / v) di siero fetale bovino, 1% (v / v) di penicillina / streptomicina, 1% (v / v) L -alanyl-L-glutammina soluzione e 5 ng / ml appena completato fattore di crescita dei fibroblasti umani. </li></ol></li><li> Etichettatura magnetica di hMSC con magnetoferritin cationizzato <ol><li> Seed 150.000 hMSCs in 25 cm 2 palloni e lasciare ad aderire notte a 37 ° C. </li><li> Filtro sterilizzare magnetoferritin cationizzato attraverso un filtro di 0,22 micron siringa e determinare la concentrazione di proteine. </li><li> Mantenere condizioni sterili, preparare una soluzione di magnetoferri cationizzata 0,5 micronlatta in tampone fosfato (PBS). Mantenere innevate in una cappa di coltura sterile fino al momento dell&#39;uso. </li><li> Lavare le cellule placcato con 2 ml di PBS a temperatura ambiente. </li><li> Aggiungere 1 ml di soluzione magnetoferritin cationizzato sterilizzata alle cellule piastrate e incubare per il periodo di tempo desiderato (1 min a 1 ora). </li><li> Lavare le cellule con PBS, e le cellule poi raccolto aggiungendo 0,5 ml di tripsina / acido etilendiamminotetraacetico (EDTA) e incubando a 37 ° C per 5 min. </li><li> Aggiungere 1 ml di mezzo di coltura per inattivare la tripsina / EDTA, trasferire la soluzione in un tubo da 15 ml centrifuga e centrifugare per 5 min a 524 x g. </li><li> Eliminare il supernatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 ml di tampone di separazione magnetica, costituito da 0,5% (w / v) di siero fetale bovino e 2 mM EDTA in PBS. </li></ol></li><li> Separazione cellulare magnetica <ol><li> Fissare il magnete al più supporto, e aggiungere una colonna di separazione magnetica al magnete. Collocare un filtro pre-separazione su The colonna. </li><li> Collocare 0,5 ml di tampone di separazione magnetica nel filtro pre-separazione e farlo funzionare sia attraverso il filtro e la colonna di lavare e bagnarle. </li><li> Collocare un tubo da centrifuga da 15 ml sotto la colonna. </li><li> Aggiungere 0,5 ml della sospensione cellulare nel serbatoio filtro della colonna di separazione magnetica. </li><li> Quando il serbatoio è vuoto, aggiungere 0,5 ml di tampone di separazione magnetica. </li><li> Quando il serbatoio è vuoto, aggiungere ulteriori 0,5 ml di tampone di separazione magnetica. </li><li> Ripetere ancora una volta (volume totale di tampone di separazione magnetica utilizzata per il lavaggio deve essere 1,5 ml). Questa fase di lavaggio eluisce tutte le cellule non magnetizzati dal (frazione di cellule non magnetizzato) colonna. </li><li> Rimuovere la colonna dal magnete e metterlo in un 15 ml provetta da centrifuga fresca. Rimuovere il filtro dal serbatoio colonna. </li><li> Aggiungere 1 ml di tampone di separazione magnetica al serbatoio e immediatamente spingere attraverso la colonna usando lo stantuffo fornito dalla fabbricazioner. Questo eluisce le cellule magnetizzate dalla colonna nel tubo da centrifuga (frazione cellulare magnetizzata). </li><li> Centrifugare entrambi i tubi per 5 min a 524 x g. </li><li> Eliminare il surnatante e risospendere il pellet di cellule in 0,3 ml di PBS. </li><li> Contare il numero di cellule numeri in ogni frazione con un emocitometro. </li><li> Determinare la frazione di cellule magnetizzati, M (%), utilizzando la seguente equazione: <img alt="Equazione" src="/files/ftp_upload/54785/54785eq1.jpg" /> dove n (M) è il numero di cellule nella frazione magnetizzato e n (M + NM) è la somma del numero di cellule nelle frazioni magnetizzati e non magnetizzate. </li></ol></li><li> Preparazione hMSCs etichettati con magnetoferritin cationizzata per la quantificazione di ferro usando la spettroscopia di emissione ottica al plasma accoppiato induttivamente (ICP-OES) NOTA: Il protocollo può avere bisogno di essere adattato per altri strumenti ICP-OES. Si consiglia di consultarsi con il retecnico sponsabile. <ol><li> Centrifugare un numero noto di cellule per 5 min a 524 x g. </li><li> Rimuovere il surnatante PBS e aggiungere 0,25 ml di 50% (v / v) di acido nitrico. </li><li> Vortex miscelare la sospensione cellulare acidificato. </li><li> Incubare a temperatura ambiente per una notte. </li><li> Aggiungere 4,75 ml di acqua distillata per ogni miscela campione e vortex. </li><li> Analizzare con ICP-OES. 28 </li><li> Normalizzare il contenuto di ferro misurato il numero di cellule per determinare un valore per contenuto di ferro cellulare. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Gupta, A. K., Gupta, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthesis+and+surface+engineering+of+iron+oxide+nanoparticles+for+biomedical+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Synthesis and surface engineering of iron oxide nanoparticles for biomedical applications.</a> Biomaterials. 26 (18), 3995-4021 (2005).</li>
<li>Decuzzi, P., Ferrari, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+specific+and+non-specific+interactions+in+receptor-mediated+endocytosis+of+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">The role of specific and non-specific interactions in receptor-mediated endocytosis of nanoparticles.</a> Biomaterials. 28 (18), 2915-2922 (2007).</li>
<li>Cunningham, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Positive+contrast+magnetic+resonance+imaging+of+cells+labeled+with+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Positive contrast magnetic resonance imaging of cells labeled with magnetic nanoparticles.</a> Magn. Reson. Med. 53 (5), 999-1005 (2005).</li>
<li>Song, H. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Surface+modulation+of+magnetic+nanocrystals+in+the+development+of+highly+efficient+magnetic+resonance+probes+for+intracellular+labeling%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Surface modulation of magnetic nanocrystals in the development of highly efficient magnetic resonance probes for intracellular labeling.</a> J. Am. Chem. Soc. 127 (28), 9992-9993 (2005).</li>
<li>Daldrup-Link, H. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+hematopoietic+progenitor+cells+with+MR+contrast+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">Targeting of hematopoietic progenitor cells with MR contrast agents.</a> Radiology. 228 (3), 760-767 (2003).</li>
<li>Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., Doak, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Potential+toxicity+of+superparamagnetic+iron+oxide+nanoparticles+%28SPION%29%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Rev%22%5BJournal%5D)">Potential toxicity of superparamagnetic iron oxide nanoparticles (SPION).</a> Nano Rev. 1, (2010).</li>
<li>Dodd, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Detection+of+single+mammalian+cells+by+high-resolution+magnetic+resonance+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys.+J%22%5BJournal%5D)">Detection of single mammalian cells by high-resolution magnetic resonance imaging.</a> Biophys. J. 76 (1), 103-109 (1999).</li>
<li>Ahrens, E. T., Feili-Hariri, M., Xu, H., Genove, G., Morel, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Receptor-mediated+endocytosis+of+iron-oxide+particles+provides+efficient+labeling+of+dendritic+cells+for+in+vivo+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">Receptor-mediated endocytosis of iron-oxide particles provides efficient labeling of dendritic cells for in vivo MR imaging.</a> Magn. Reson. Med. 49 (6), 1006-1013 (2003).</li>
<li>Arbab, A. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+magnetic+cell+labeling+with+protamine+sulfate+complexed+to+ferumoxides+for+cellular+MRI%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Efficient magnetic cell labeling with protamine sulfate complexed to ferumoxides for cellular MRI.</a> Blood. 104 (4), 1217-1223 (2004).</li>
<li>Bulte, J. W. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetodendrimers+allow+endosomal+magnetic+labeling+and+in+vivo+tracking+of+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Magnetodendrimers allow endosomal magnetic labeling and in vivo tracking of stem cells.</a> Nat. Biotechnol. 19 (12), 1141-1147 (2001).</li>
<li>Josephson, L., Tung, C. H., Moore, A., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+intracellular+magnetic+labeling+with+novel+superparamagnetic-tat+peptide+conjugates%5BTitle%5D)+AND+%22Bioconjugate+Chem%22%5BJournal%5D)">High-efficiency intracellular magnetic labeling with novel superparamagnetic-tat peptide conjugates.</a> Bioconjugate Chem. 10 (2), 186-191 (1999).</li>
<li>Lewin, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tat+peptide-derivatized+magnetic+nanoparticles+allow+in+vivo+tracking+and+recovery+of+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Tat peptide-derivatized magnetic nanoparticles allow in vivo tracking and recovery of progenitor cells.</a> Nat. Biotechnol. 18 (4), 410-414 (2000).</li>
<li>Hunter, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+hurdles+in+polyfectin+design+and+mechanistic+background+to+polycation+induced+cytotoxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Drug+Delivery+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular hurdles in polyfectin design and mechanistic background to polycation induced cytotoxicity.</a> Adv. Drug Delivery Rev. 58 (14), 1523-1531 (2006).</li>
<li>Montet-Abou, K., Montet, X., Weissleder, R., Josephson, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+internalization+of+magnetic+nanoparticles+using+transfection+agents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Imaging%22%5BJournal%5D)">Cell internalization of magnetic nanoparticles using transfection agents.</a> Mol. Imaging. 6 (1), 1-9 (2007).</li>
<li>Correia Carreira,, S,, et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+stem+cell+labelling+using+cationised+magnetoferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin.</a> Nanoscale. 8 (14), 7474-7483 (2016).</li>
<li>Meldrum, F. C., Heywood, B. R., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetoferritin%3A+in+vitro+synthesis+of+a+novel+magnetic+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Magnetoferritin: in vitro synthesis of a novel magnetic protein.</a> Science. 257 (5069), 522-523 (1992).</li>
<li>Klem, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synthetic+control+over+magnetic+moment+and+exchange+bias+in+all-oxide+materials+encapsulated+within+a+spherical+protein+cage%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Synthetic control over magnetic moment and exchange bias in all-oxide materials encapsulated within a spherical protein cage.</a> J. Am. Chem. Soc. 129 (1), 197-201 (2007).</li>
<li>Okuda, M., Eloi, J. C., Sarua, A., Jones, S. E. W., Schwarzacher, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+barrier+distribution+for+dispersed+mixed+oxide+magnetic+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Appl.+Phys%22%5BJournal%5D)">Energy barrier distribution for dispersed mixed oxide magnetic nanoparticles.</a> J. Appl. Phys. 111 (7), (2012).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+human+ferritin+iron+oxide+nano-composite+magnetic+resonance+contrast+agent%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">A human ferritin iron oxide nano-composite magnetic resonance contrast agent.</a> Magn. Reson. Med. 60 (5), 1073-1081 (2008).</li>
<li>Danon, D., Skutelsk E, M. arikovsY., Goldstei, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Cationized+Ferritin+as+a+Label+of+Negative+Charges+on+Cell+Surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Ultrastruc.+Res%22%5BJournal%5D)">Use of Cationized Ferritin as a Label of Negative Charges on Cell Surfaces.</a> J. Ultrastruc. Res. 38 (5-6), 500-510 (1972).</li>
<li>Valero, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+Nanoparticles-Templated+Assembly+of+Protein+Subunits%3A+A+New+Platform+for+Carbohydrate-Based+MRI+Nanoprobes%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Magnetic Nanoparticles-Templated Assembly of Protein Subunits: A New Platform for Carbohydrate-Based MRI Nanoprobes.</a> J. Am. Chem. Soc. 133 (13), 4889-4895 (2011).</li>
<li>Zborowski, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunomagnetic+isolation+of+magnetoferritin-labeled+cells+in+a+modified+ferrograph%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Immunomagnetic isolation of magnetoferritin-labeled cells in a modified ferrograph.</a> Cytometry. 24 (3), 251-259 (1996).</li>
<li>Ikezoe, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Giant+Two-Dimensional+Crystal+of+Protein+Molecules+from+a+Three-Phase+Contact+Line%5BTitle%5D)+AND+%22Langmuir%22%5BJournal%5D)">Growth of Giant Two-Dimensional Crystal of Protein Molecules from a Three-Phase Contact Line.</a> Langmuir. 24 (22), 12836-12841 (2008).</li>
<li>Uchida, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+of+cancer+cells+with+ferrimagnetic+ferritin+cage+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Am.+Chem.+Soc%22%5BJournal%5D)">Targeting of cancer cells with ferrimagnetic ferritin cage nanoparticles.</a> J. Am. Chem. Soc. 128 (51), 16626-16633 (2006).</li>
<li>Yamashita, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selective+nanoscale+positioning+of+ferritin+and+nanoparticles+by+means+of+target-specific+peptides%5BTitle%5D)+AND+%22Small%22%5BJournal%5D)">Selective nanoscale positioning of ferritin and nanoparticles by means of target-specific peptides.</a> Small. 2 (10), 1148-1152 (2006).</li>
<li>Williams, A., Frasca, V., et al. UNIT 8.2 Ion-Exchange Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWilliams%2C+A+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hagel, L., et al. UNIT 8.3 Gel-Filtration Chromatography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHagel%2C+L+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. Coligan, J. E., et al. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Hou, X., Jones, B. T. Inductively coupled plasma-optical emission spectrometry. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHou%2C+X+%22In+Encyclopedia+of+Analytical+Chemistry.+Meyers%2C+R.A.+ed%22">In Encyclopedia of Analytical Chemistry. Meyers, R.A. ed</a>. , John Wiley & Sons, Ltd. 1(2000).</li>
<li>Correia Carreira, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-fast+stem+cell+labelling+using+cationised+magnetoferritin%5BTitle%5D)+AND+%22Nanoscale%22%5BJournal%5D)">Ultra-fast stem cell labelling using cationised magnetoferritin.</a> Nanoscale. , (2016).</li>
<li>Simon, G. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T1+and+T2+relaxivity+of+intracellular+and+extracellular+USPIO+at+1.5+T+and+3T+clinical+MR+scanning%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Radiol%22%5BJournal%5D)">T1 and T2 relaxivity of intracellular and extracellular USPIO at 1.5 T and 3T clinical MR scanning.</a> Eur. J. Radiol. 16 (3), 738-745 (2006).</li>
<li>Jubb, A. M., Allen, H. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Vibrational+Spectroscopic+Characterization+of+Hematite%2C+Maghemite%2C+and+Magnetite+Thin+Films+Produced+by+Vapor+Deposition%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl.+Mater.+Interfaces%22%5BJournal%5D)">Vibrational Spectroscopic Characterization of Hematite, Maghemite, and Magnetite Thin Films Produced by Vapor Deposition.</a> ACS Appl. Mater. Interfaces. 2 (10), 2804-2812 (2010).</li>
<li>Wang, Z. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-pressure+x-ray+diffraction+and+Raman+spectroscopic+studies+of+the+tetragonal+spinel+CoFe2O4%5BTitle%5D)+AND+%22Phys.+Rev.+B%22%5BJournal%5D)">High-pressure x-ray diffraction and Raman spectroscopic studies of the tetragonal spinel CoFe2O4.</a> Phys. Rev. B. 68 (9), (2003).</li>
<li>Wong, K. K., Douglas, T., Gider, S., Awschalom, D. D., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+synthesis+and+characterization+of+magnetic+proteins+%28magnetoferritin%29%5BTitle%5D)+AND+%22Chem.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic synthesis and characterization of magnetic proteins (magnetoferritin).</a> Chem. Mater. 10 (1), 279-285 (1998).</li>
<li>Okuda, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fe3O4+nanoparticles%3A+protein-mediated+crystalline+magnetic+superstructures%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Fe3O4 nanoparticles: protein-mediated crystalline magnetic superstructures.</a> Nanotechnology. 23 (41), 415601(2012).</li>
<li>Perriman, A. W., Cölfen, H., Hughes, R. W., Barrie, C. L., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Solvent-Free+Protein+Liquids+and+Liquid+Crystals%5BTitle%5D)+AND+%22Angew.+Chem.+Int.+Ed%22%5BJournal%5D)">Solvent-Free Protein Liquids and Liquid Crystals.</a> Angew. Chem. Int. Ed. 48 (34), 6242-6246 (2009).</li>
<li>Billotey, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T-cell+homing+to+the+pancreas+in+autoimmune+mouse+models+of+diabetes%3A+in+vivo+MR+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Radiology%22%5BJournal%5D)">T-cell homing to the pancreas in autoimmune mouse models of diabetes: in vivo MR imaging.</a> Radiology. 236 (2), 579-587 (2005).</li>
<li>Smirnov, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+cellular+imaging+of+lymphocyte+trafficking+by+MRI%3A+a+tumor+model+approach+to+cell-based+anticancer+therapy%5BTitle%5D)+AND+%22Magn.+Reson.+Med%22%5BJournal%5D)">In vivo cellular imaging of lymphocyte trafficking by MRI: a tumor model approach to cell-based anticancer therapy.</a> Magn. Reson. Med. 56 (3), 498-508 (2006).</li>
<li>Wilhelm, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Magnetic+control+of+vascular+network+formation+with+magnetically+labeled+endothelial+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Magnetic control of vascular network formation with magnetically labeled endothelial progenitor cells.</a> Biomaterials. 28 (26), 3797-3806 (2007).</li>
<li>MacLean, I., Sanders, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cationized+ferritin+and+phosvitin+uptake+by+coated+vesicles+of+the+early+chick+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Anat.+Embryol%22%5BJournal%5D)">Cationized ferritin and phosvitin uptake by coated vesicles of the early chick embryo.</a> Anat. Embryol. 166 (3), 385-397 (1983).</li>
<li>Van Deurs, B., Nilausen, K., Faergeman, O., Meinertz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coated+pits+and+pinocytosis+of+cationized+ferritin+in+human+skin+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Eur.+J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Coated pits and pinocytosis of cationized ferritin in human skin fibroblasts.</a> Eur. J. Cell Biol. 27 (2), 270-278 (1982).</li>
<li>Xing, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+and+cellular+uptake+of+platinum+anticancer+drugs+encapsulated+in+apoferritin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inorg+Biochem%22%5BJournal%5D)">Characterization and cellular uptake of platinum anticancer drugs encapsulated in apoferritin.</a> J Inorg Biochem. 103 (7), 1039-1044 (2009).</li>
<li>Wong, K. K., Mann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biomimetic+synthesis+of+cadmium+sulfide-ferritin+nanocomposites%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Mater%22%5BJournal%5D)">Biomimetic synthesis of cadmium sulfide-ferritin nanocomposites.</a> Adv. Mater. 8 (11), 928-932 (1996).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

TEM di campioni magnetoferritin colorati con aurothioglucose rivelato la mineralizzazione successo di nanoparticelle all&#39;interno della gabbia di proteine. Electron diffrazione e analisi Raman del nucleo nanoparticella indicavano la presenza di una ferrite di cobalto, indicando drogaggio successo del nucleo nanoparticelle con cobalto. Ciò dimostra che le nanoparticelle ossidi misti possono essere correttamente mineralizzata entro la cavità apo-ferritina. Inoltre, abbiamo precedentemente dimostrato che il cobalto doping può essere variato modificando la quantità di cobalto precursore aggiunto alla miscela di reazione, che consente la sintonizzazione delle proprietà magnetiche. 18 Sintesi Magnetoferritin può essere eseguita in una varietà di navi, purché siano ermeticamente sigillato e hanno porte di accesso attraverso il quale possono essere introdotte reagenti (ad esempio, a tre colli rotonda pallone a fondo). La temperatura di reazione deve essere mantenuta a 65 ° C mediante l&#39;immissione nel recipientea / a bagno d&#39;olio d&#39;acqua o usando un recipiente a doppia camicia. Qui, abbiamo utilizzato una configurazione a doppia camicia cella elettrochimica per eseguire la sintesi. Per garantire riuscita sintesi, mantenendo il pH corretto ed evitando la contaminazione di ossigeno delle soluzioni acquose è cruciale. soluzioni saline metallo dovrebbe sempre essere preparati appena prima dell&#39;uso piuttosto che in anticipo. Inoltre, le soluzioni apoferritin commerciali possono variare in termini di qualità e di influenzare il risultato di sintesi (ad es., Le dimensioni di nanoparticelle nucleo mineralizzata). Può aiutare a dializzare soluzione apoferritin in 50 mM tampone HEPES (pH 8,6) prima della sintesi di rimuovere qualsiasi agente riducente residuo usata dal fabbricante. E &#39;utile per prendere nota del numero di lotto della soluzione apo-ferritina utilizzato per la sintesi, in modo che possa essere espressamente richiesto dal produttore dovrebbe aggiuntivo bisogno materiale da acquistare. Inoltre, la concentrazione di proteine ​​commercialmente disponibile apo-ferritina deve essere riportata sul flacone, che puòessere utilizzato per calcolare il volume di soluzione di apo-ferritina necessaria per sintesi. Se questo non è il caso, contattare il fornitore per queste informazioni. Il vantaggio di graduale aggiunta di sali metallici e perossido di idrogeno - come presentato qui e in relazioni precedenti - è che la mineralizzazione del nucleo nanoparticella può essere controllata in modo che i diversi fattori di carico (cioè, le dimensioni di nanoparticelle) possono essere raggiunti. 33 Inoltre, è possibile purificare ulteriormente magnetoferritin usando una colonna di separazione magnetica, ad esempio, una colonna impaccata con polvere di acciaio inox fissata all&#39;interno un elettromagnete. 34 Così, nuclei di nanoparticelle altamente monodisperse può essere isolato dal campione magnetoferritin massa. Tuttavia, per l&#39;etichettatura delle cellule magnetiche come presentato qui questo non è richiesto. Una limitazione della sintesi magnetoferritin è relativamente bassa resa di sintesi di circa il 10%, e il costo relativamente elevato del commerciale apo-feSoluzioni rritin. Tuttavia, apo-ferritina può anche essere preparato da milza cavallo economicamente disponibile ferritina seguendo protocolli di de-mineralizzazione stabiliti. 16 Cationizzazione di magnetoferritin è stata ottenuta aggiungendo un rapporto molare di 250 molecole di DMPA e 50 molecole di EDC per residuo di carica negativa (calcoli basati sulla sequenza aminoacidica del cavallo milza ferritina). Questo eccesso di reagente più di proteine ​​ha portato efficienze elevate cationizzazione, paragonabile anche riportato in precedenza i risultati del cationizzazione di ferritina. 35 Per l&#39;analisi MALDI-TOF, apoferritin e apoferritin cationizzato sono stati utilizzati a causa della massa molecolare eccessiva del nucleo magnetoferritin. Per produrre efficienze elevate cationizzazione, pH ottimale è fondamentale. reticolazione EDC-mediata è più efficace in condizioni leggermente acide, e abbiamo scoperto che il pH 5 ha dato risultati ottimali cationizzazione per magnetoferritin. Tuttavia, per altre proteine ​​cpH ationization può avere bisogno di essere ottimizzato. Cationizzazione in corrispondenza o vicino al punto isoelettrico della proteina deve essere evitato, poiché questo può provocare gravi precipitazione. magnetizzazione delle cellule staminali con magnetoferritin cationizzata era altamente efficiente e potrebbe essere raggiunto utilizzando i tempi di incubazione e sotto i 30 minuti. Anche una incubazione di un minuto determinato un contenuto di ferro cellulare di 3,6 pg, che è compreso nell&#39;intervallo riportato necessaria per influenzare T2 e T2 * contrasto per MRI. 36,37 È anche notevole che questa etichettatura efficace si ottiene con basse concentrazioni di ferro extracellulari. Ad esempio, gli studi precedenti utilizzando nanoparticelle anionici riportano livelli di ferro di 10 pg per cella, dopo un periodo di 30 minuti di incubazione con 5 mM di ferro. 38 In confronto, l&#39;incubazione con una soluzione magnetoferritin cationizzata contenente 0,5 mM di proteine corrisponde a incubazione con circa 0,2 mM ferro e produce anche circa il 10 pg di ferro per cell dopo 30 minuti. Non siamo stati in grado di identificare in modo chiaro tutte le vescicole di endocitosi mediante TEM. Tuttavia, studi precedenti utilizzando ferritina cationizzata scoperto che internalizzazione si è verificata entro i primi dieci minuti di esposizione. 39,40 ferritina cationizzata potrebbe essere localizzata in vescicole rivestite, indicando endocitosi clatrina o caveolina-dipendente. Gli stessi studi hanno anche riferito che dopo 30 minuti di incubazione, ferritina cationizzato era ancora presente sulla superficie cellulare, così come nei corpi multivesicular, simile lisosomi. Ulteriori applicazioni potrebbero includere cationizzazione di gabbie apo-ferritina carichi di altre nanoparticelle e / o molecole funzionali, come i farmaci anti-cancro 41 o 42 punti quantici. Cationizzazione di questi costrutti ferritina potrebbe tradursi in una consegna più rapida e più efficiente del loro carico per le cellule.

vincolanti superficie o internalizzazione di superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIONs) ha permesso di magnetizzazione di una varietà di tipi di cellule per applicazioni quali l&#39;imaging e la manipolazione a distanza. 1 Tuttavia, ottenendo sufficiente magnetizzazione cellulare può essere una sfida, soprattutto quando l&#39;interazione tra il SPION e la superficie cellulare è debole. 2 Negli ultimi concentrazioni, l&#39;esposizione prolungata o ad alta spion sono stati impiegati come strategie per superare questa sfida. 3,4 Tuttavia, queste strategie sono problematici perché aumentano la tossicità 5,6 e hanno un successo molto limitato in tipi di cellule con i tassi bassi di interiorizzazione, come i linfociti. 7 Per migliorare l&#39;assorbimento cellulare di SPIONs, approcci di funzionalizzazione diverse superfici sono state esplorate. Per esempio, gli anticorpi sono stati utilizzati per promuovere endocitosi mediata da recettori, 8 mentre assorbimento non specifico può essere ottenuto utilizzando una trasfezionesignori 9,10 o specie cellule penetrante, come l&#39;HIV tat-peptide. 11,12 Tuttavia, anticorpi e peptidi funzionalizzazione approcci sono limitati dai reagenti costosi e preparazione di sintesi complessi, mentre gli agenti di trasfezione possono indurre nanoparticelle precipitazioni e influenzare negativamente la funzione delle cellule. 13,14 Recentemente abbiamo riportato la sintesi di magnetoferritin cationizzata chimicamente, un romanzo SPION che era molto efficace in cellule staminali mesenchimali umane di magnetizzazione (hMSCs) con tempi di incubazione più brevi di un minuto. 15 Magnetoferritin è sintetizzato dalla ricostituzione di una SPION all&#39;interno della cavità de-mineralizzato della proteina ferritina deposito del ferro. 16 Questo SPION base di proteine combina molte proprietà che lo rendono particolarmente adatto per la magnetizzazione delle cellule, come il controllo sulle proprietà magnetiche del nucleo magnetico, 17-19 e la biocompatibilità e la solubilità acquosa conferiti dalla shell proteine. Ulteriorepiù, funzionalizzazione superficiale è facilmente ottenibile a causa aminoacidi indirizzabili che possono essere chimicamente 20-22 o geneticamente modificati. 23-25 Abbiamo dimostrato che cationizzazione chimica degli acidi residui di aminoacidi del guscio proteina genera una nanoparticella stabile che prontamente ha interagito con i domini anionici sulla superficie cellulare che porta alla magnetizzazione cellulare rapida e persistente. Questa procedura elimina la necessità di funzionalizzazione laboriosa e protocolli di incubazione lunghi, e grazie al meccanismo marcatura non specifica questa strategia magnetizzazione rapida dovrebbe trovare applicazione diffusa in altri tipi di cellule. Qui, vi presentiamo una profonda relazione del metodo di etichettatura delle cellule ultra-veloce, inclusi i protocolli dettagliati della sintesi, la purificazione e la superficie funzionalizzazione di magnetoferritin cationizzata.

<table><tbody><tr><td>Acido 4-(2-idrossietil)-1-piperazineetansolfonato (HEPES)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BPE310-1</td><td>polvere; preparare una soluzione madre da 1 M a pH 8,6 e diluire a 50&nbsp; mM prima dell'uso. Controlla attentamente il pH prima della sintesi!</td></tr><tr><td>apoferritina dalla milza equina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A3641</td><td>abbiamo usato LOTTO # 081M7011V</td></tr><tr><td>solfato di cobalto eptaidrato&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C6768</td><td>preparare soluzioni fresche dal sale prima della sintesi</td></tr><tr><td>solfato di ferro di ammonio esaidrato.</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F1543</td><td>preparare soluzioni fresche dal sale prima della sintesi</td></tr><tr><td>soluzione di perossido di idrogeno (30%)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>216763</td><td>preparare soluzioni fresche dal sale prima della sintesi</td></tr><tr><td>citrato di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S1804</td><td>polvere; una soluzione 1 M può essere preparata e mantenuta a temperatura ambiente per diversi mesi</td></tr><tr><td>Unità filtrante Millex GP, 0,22&nbsp; micron</td><td>Merck Millipore</td><td>SLGP033RS</td><td>filtro per siringa</td></tr><tr><td>base Trizma</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503</td><td>polvere; preparare una soluzione madre 1 M a pH 8,0 e diluire a 50&nbsp; mM prima dell'uso</td></tr><tr><td>cloruro di sodio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>31434</td><td>poweder; aggiungere ai tamponi secondo necessità</td></tr><tr><td>Unità filtranti centrifughe Centriprep</td><td>Merck Millipore</td><td>4310</td><td>Ultracel YM-50 membrana, volume 12 ml; utilizzare per la concentrazione iniziale fino a quando la soluzione di magnetoferritina non è stata concentrata da circa 150 ml a 20&nbsp; ml</td></tr><tr><td>di filtro centrifugo Amicon Ultra-4 fino alla</td> membrana <td>Merck Millipore</td><td>UFC801024</td><td>Ultracel-10, 4&nbsp; volume in ml; Utilizzare per concentrare la soluzione di magnetoferritina da circa 20 ml a&nbsp; 2 ml</td></tr><tr><td>di ANX Sepharose 4 Fast Flow</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1287-04</td><td>abbiamo confezionato noi stessi questa colonna</td></tr><tr><td>HiPrep 26/60 Sephacryl S-300 HR</td><td>GE Healthcare</td><td>17-1196-01</td><td>questa colonna è stata acquistata già imballata</td></tr><tr><td>&Auml; Sistema di purificazione KTA</td><td>GE Healthcare</td><td>28406264</td><td></td></tr><tr><td>pompa per campioni P-960</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6727-00</td><td>caricare il campione a una portata di 10 ml/min</td></tr><tr><td>collettore automatico di frazioni Frac-950</td><td>GE Healthcare</td><td>18-6083-00</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per test Bradford</td><td>Sigma Aldrich</td><td>B6916</td><td>soluzione pronta all'uso</td></tr><tr><td>Ferritina, Tipo I: da milza di cavallo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F4503</td><td>preparare gli standard di ferritina da questa soluzione per determinare la concentrazione di magnetoferritina</td></tr><tr><td>N,N-dimetil-1,3-propandiammina (DMPA)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>308110</td><td>ATTENZIONE: quando si regola il pH di una soluzione DMPA, eseguire questo passaggio in una cappa aspirante</td></tr><tr><td>N-(3-dimetilamminopropil)-N'-etilcarbodiimmide cloridrato ( EDC)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E6383</td><td>conservare in congelatore ma portare a temperatura ambiente prima di aprire il flacone</td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)acido etansolfonico (MES)</td><td>AppliChem</td><td>A0689,0500</td><td>polvere; preparare una soluzione madre 200 M a pH 5</td></tr><tr><td>tubo per dialisi membrana in cellulosa</td><td>Sigma</td><td>Aldrich D9652</td><td>immergere 10 minuti in acqua deionizzata prima dell'uso</td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM), 1.000 mg/L di glucosio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D5546</td><td>caldo in 37 gradi; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>siero fetale bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td>aggiungere al magazzino Flacone DMEM, 10% (v/v) concentrazione finale</td></tr><tr><td>penicillina/streptomicina soluzione</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0781</td><td>aggiungere al magazzino Flacone DMEM, 1% (v/v) concentrazione finale</td></tr><tr><td>glutamax soluzione</td><td>Gibco</td><td>35050-087</td><td>aggiungere al magazzino Flacone DMEM, 1% (v/v) concentrazione finale</td></tr> fattore <tr><td>di crescita dei fibroblasti umani</td><td>PeproTech</td><td>100-18B</td><td>aggiungere al DMEM appena nel pallone di coltura cellulare ad ogni cambio di terreno; concentrazione finale 5 ng/ml</td></tr><tr><td>di soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D8537</td><td>soluzione sterile, per la soluzione di tripsina</td></tr><tr><td>/EDTA</td> di coltura cellulare <td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td>conservare in congelatore e scongelare in 37&nbsp; &deg; C bagnomaria prima dell'uso</td></tr><tr><td>acido etilendiamminotetraacetico (EDTA)</td> <td>Sigma Aldrich</td><td>E5134</td><td>polvere; fare una soluzione 2 mM in PBS&nbsp;</td></tr><tr><td>albumina sierica bovina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7030</td><td>aggiunge lo 0,5% (p/v) in 2&nbsp; soluzione mM EDTA in PBS; mescolare accuratamente con l'agitatore magnetico, evitare la formazione di schiuma; filtro sterilizzare attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron</td></tr><tr><td>MACS multi stand&nbsp;</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>per il fissaggio del magnete MACS</td></tr><tr><td>Colonne MACS MS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-201</td><td>monouso; destinate all'uso singolo, ma se non è richiesta la sterilità, possono essere riutilizzate: lavare con acqua deionizzata ed etanolo al 100% e porre in un forno di essiccazione; scartare se si osservano macchie arrugginite</td></tr><tr><td>Magnete separatore MiniMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-102</td><td>può essere acquistato come starter kit, insieme a colonne e supporti</td></tr><tr><td>Filtro di pre-separazione a colonna MACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-041-407</td><td>Filtro da 30 mm</td></tr><tr><td>Soluzione di acido nitrico, 64-66%</td><td>Sigma Aldrich</td><td>7006</td><td></td></tr><tr><td>Titrando 907, pompa a siringa</td><td>Metrohm</td><td>2.907.0020</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Apparecchiatura utilizzata per caratterizzare la magnetoferritina e la magnetoferritina cationizzataDispositivi molecolari </td></tr><tr><td>SpectraMax M5</td><td></td><td>Utilizzato per misurare l'assorbanza nel test di Bradford</td>JEM 1200 EX JEOL Utilizzato per l'imaging TEM della magnetoferritina Spettrometro Raman InVia Renishaw Utilizzato per la spettroscopia Raman Laser DPSS Torus Laser Quantum Utilizzato per la spettroscopia Raman Bruker <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> UltrafleXtreme</td><td>Applied Biosystems</td><td></td><td>Utilizzato per l'analisi MALDI-TOF dell'apoferritina e dell'apoferritina cationizzata</td></tr><tr><td>Strumenti ZetaSizer Nano-ZS</td><td>Malvern</td><td>Utilizzato per misurare il diametro idrodinamico e il potenziale zeta della magnetoferritina e della magnetoferritina cationizzata Sistema di</td>misurazione delle proprietà magnetiche Progettazione quantistica Utilizzato per misurare il momento di saturazione magnetica e la suscettibilità magnetica <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Magnetom Skyra</td><td>Siemens</td><td></td><td>Utilizzato per determinare la rilassabilità longitudinale e trasversale&nbsp;</td></tr><tr><td>Tecnai 12 BioTwin Spirit</td><td>FEI</td><td></td><td>Utilizzato per l'imaging TEM di hMSC marcato con magnetoferritina cationizzata</td></tr><tr><td>710 ICP-OES</td><td>Agilent</td><td></td><td>Utilizzato per determinare il contenuto di ferro nelle cellule</td></tr></tbody></table>

sintesi di cationizzata magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

Synthesis of Cationized Magnetoferritin for Ultra-fast Magnetization of Cells

Molte importanti applicazioni biomediche, come l&#39;imaging cellulare e la manipolazione a distanza, possono essere realizzati mediante l&#39;etichettatura di cellule con superparamagnetiche nanoparticelle di ossido di ferro (SPIONs). Il raggiungimento sufficiente assorbimento cellulare di SPIONs è una sfida che è stata tradizionalmente incontrato esponendo le cellule a concentrazioni elevate di SPIONs o prolungando i tempi di esposizione (fino a 72 ore). Tuttavia, queste strategie sono suscettibili di mediare tossicità. Qui, presentiamo la sintesi del SPION magnetoferritin base di proteine, nonché una facile protocollo funzionalizzazione superficiale che consente una rapida magnetizzazione cellulare utilizzando concentrazioni di esposizione basse. Il nucleo SPION di magnetoferritin costituito da ossido di ferro-cobalto drogati con un diametro medio delle particelle di 8.2 nm mineralizzata all&#39;interno della cavità del cavallo milza apo-ferritina. cationizzazione chimici di magnetoferritin prodotto un romanzo, SPION altamente membrana attivo che magnetizzato cellule staminali mesenchimali umane (hMSCs) con tempi di incubazione comebreve come le concentrazioni di un minuto e ferro come bassi come 0,2 mm.

TEM è stata utilizzata per confermare nanoparticella mineralizzazione all&#39;interno della cavità apoferritin e determinare le dimensioni del nucleo medio (Figure 1A e 1B). L&#39;analisi delle immagini di campioni non colorati magnetoferritin ha un diametro medio nucleo di 8,2 ± 0,7 nm e macchia aurothioglucose confermato la presenza di nanoparticelle all&#39;interno della gabbia proteine. Si noti che le immagini mostrano un campione magnetoferritin che è stato ulteriormente purificato usando separazione magnetica per isolare nuclei di nanoparticelle uniformi. campioni Magnetoferritin che non sono stati depurati magneticamente hanno una distribuzione dimensionale nucleo leggermente più ampio. 29 Analisi della struttura del nucleo magnetoferritin usando-regione selezionata diffrazione elettronica indicata la possibile presenza della struttura inversa spinello basato su magnetite (Fe 3 O 4) e / o maghemite (γ-Fe 2 O 3), così come la struttura spinello a causa di Co 3 </sub&gt; O 4. Inoltre, spettri Raman rivelato picchi attribuiti a Fe 3 O 4, piccole quantità di γ-Fe 2 O 3, e una ferrite di cobalto (Figura 1 C). analisi ICP-OES di magnetoferritin mostrato una media di 102 mg di ferro e 0,9 mg di cobalto per milligrammo di magnetoferritin. Lo schema è inclusa, illustrante la successiva fase cationizzazione (Figura 2). Il diametro idrodinamica del magnetoferritin e magnetoferritin cationizzata era 11,8 ± 1,1 nm e 12,5 ± 1,4 nm, rispettivamente, come determinato dalla dispersione della luce dinamica. L&#39;efficienza cationizzazione di covalente DMPA accoppiamento per magnetoferritin è stata valutata utilizzando potenziometria zeta e laser desorbimento di ionizzazione tempo di volo (MALDI-TOF) spettrometria di massa a matrice assistita. Il potenziale zeta cambiato da -10.5 mV per MF a + 8,3 mV per magnetoferritin cationizzata, confermando unacambiare in superficie potenziale da negativo a positivo (Tabella 1). Esperimenti di spettrometria di massa ha trovato un peso molecolare subunità di 20.1 kDa per nativo apo-ferritina e 21,1 kDa per cationizzata apo-ferritina (Figura 2 B). Questo aumento di massa corrisponde a circa 12 molecole DMPA accoppiati per subunità di proteine, e la cationizzazione di 288 residui sulla intera proteina 24-subunità. saturazione magnetica e la suscettibilità sono stati misurati utilizzando magnetometria SQUID, e trasversale e longitudinale relassività sono stati misurati utilizzando la risonanza magnetica. Proprietà magnetiche erano simili per magnetoferritin e magnetoferritin cationizzato, indicando che cationizzazione avuto un impatto trascurabile sulle proprietà magnetiche della SPION allegato (Tabella 1). Inoltre, queste proprietà sono simili ad altri nanoparticelle a base di ossido di ferro, 19,30 dimostrando che cationizzato magnetoferritin sarebbe altrettanto adatto come agenti di contrasto convenzionali spion a base di MRI a migliorare il contrasto delle immagini. Dopo esposizione di 30 minuti, la superficie cellulare densamente ricoperto da magnetoferritin cationizzato (Figura 3). Tuttavia, dopo una settimana, non nanoparticelle sono stati trovati sulla superficie cellulare (Figura 3 B). magnetoferritin cationizzata era notevolmente efficace a hMSCs magneticamente etichettatura. In particolare, esponendo le cellule a magnetoferritin cationizzato per un minuto portato alla magnetizzazione del 92% della popolazione cellulare e la consegna di 3,6 pg di ferro per cella. Aumentando il tempo di incubazione di 15 minuti comportato la magnetizzazione di tutta la popolazione di cellule (Figura 3 C). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54785/54785fig1.jpg" /> Figura 1: Caratterizzazione di magnetof<html> nuclei erritin drogati con 5% di cobalto. Immagini TEM di magnetoferritin colorati con aurothioglucose (A) e senza macchia (B). Inserto mostra diffrazione elettronica corrispondente con gli indici di magnetite. barra della scala: 20 nm. (C) Raman spettro per magnetoferritin. Le frecce indicano i principali modi di vibrazione per Raman ferrite di cobalto (T 2g), magnetite e maghemite (sia A 1g). 31,32 La lunghezza d&#39;onda del laser utilizzato era 532 nm. (Immagine adattato da Okuda et al. 18). Si noti che questo campione magnetoferritin era stato ulteriormente purificato mediante separazione magnetica, che ha isolato le particelle magnetoferritin uniformemente caricati. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> 785fig2.jpg &quot;/&gt; Figura 2: cationizzazione di magnetoferritin. A) accessibili solvente rappresentazioni Superficie mostrano la distribuzione di acido (rosso) e) residui aminoacidici di base (giallo sulla superficie della proteina. Magnetoferritin (1) viene modificato per magnetoferritin cationizzato (2) mediante reticolazione carbodiimide-mediata di DMPA per residui amminoacidici acidi sulla superficie della proteina (3). B) l&#39;analisi di spettrometria di massa di subunità apo-ferritina apo-ferritina e cationizzata. Mass-a-carica (m / z) spettro di apoferritin (APOF) e apoferritin cationizzata (cat-APOF) generato da MALDI-TOF. Un aumento di massa dal 20,1 al 21,1 kDa kDa si osserva dopo cationizzazione. (Immagine adattato da Correia Carreira et al. 15) <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 3: etichettatura magnetica e la separazione delle cellule di hMSCs incubate con magnetoferritin cationizzata. A) immagine TEM di hMSCs dopo 30 minuti di incubazione con magnetoferritin cationizzata. La freccia indica la presenza di nuclei magnetoferritin densamente sulla superficie cellulare. Barre di scala: 200 nm. B) immagine TEM di hMSC una settimana dopo l&#39;etichettatura. La superficie cellulare è chiaro di magnetoferritin cationizzata. C) indagare la rapidità di marcatura magnetica: 92% della popolazione cellulare sono stati magnetizzato dopo un&#39;esposizione di un minuto con 0,5 mM magnetoferritin cationizzati, e l&#39;intera popolazione di cellule è stato magnetizzato entro 15 minuti. Contenuto di ferro per cella è stata determinata utilizzando ICP-OES. media e deviazione standard dalla tre repliche biologiche sono mostrati. (Immagine adattato da Correia Carreira et al. 15) <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54785/54785fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td></td><td> MF </td><td> cat-MF </td></tr><tr><td> Diametro idrodinamico [nm] </td><td> 11.8 ± 1.1 </td><td> 12.5 ± 1.4 </td></tr><tr><td> Zeta potenziale [mV] </td><td> (-) 10.4 ± 0.2 </td><td> 8.3 ± 0.7 </td></tr><tr><td> Saturazione momento magnetico [AM 2 kg -1] </td><td> 54.9 ± 1.6 </td><td> 55.3 ± 1.4 </td></tr><tr><td> Messa suscettibilità [x 10 4 m 3 kg -1] </td><td> 1,75 ± 0,08 </td><td> 1.75 ± 0.07 </td></tr><tr><td>Relassività longitudinale [mm -1 sec -1] </td><td> 2.6 ± 0.1 </td><td> 2.3 ± 0.1 </td></tr><tr><td> Relassività trasversale [mm -1 sec -1] </td><td> 44.6 ± 1.0 </td><td> 52.8 ± 0.8 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: caratterizzazione fisico-chimiche della magnetoferritin (MF) e magnetoferritin cationizzata (cat-MF). (Tabella adattata da Correia Carreira et al. 15)

Viene presentato un protocollo per la sintesi e la cationizzazione della magnetoferritina drogata con cobalto, nonché un metodo per magnetizzare rapidamente le cellule staminali con magnetoferritina cationizzata.

Sintesi di cationizzata Magnetoferritin per la magnetizzazione ultra-veloce di celle

Many important biomedical applications, such as cell imaging and remote manipulation, can be achieved by labeling cells with superparamagnetic iron oxide ...

L'obiettivo generale di questo metodo è sintetizzare una nanoparticella magnetica all'interno di una gabbia proteica e successivamente funzionalizzare la proteina in modo da consentire un rapido attaccamento della nanoparticella magnetica alle cellule. Questo metodo può essere utilizzato per generare nanoparticelle magnetiche che permettono un'etichettatura magnetica rapida ed efficiente delle cellule, elemento importante per applicazioni come la risonanza magnetica (MRI) o la separazione magnetica delle cellule. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la magnetizzazione cellulare può essere ottenuta utilizzando basse concentrazioni di nanoparticelle e brevi tempi di incubazione, riducendo così potenziali effetti avversi dovuti all'esposizione alle nanoparticelle.Per iniziare, deossigenare 500 millilitri di acqua deionizzata inserendo un tubo collegato a una bombola di azoto nell'acqua e sigillando il contenitore con pellicola trasparente. Successivamente, far gorgogliare il gas azoto per circa 60 minuti. Riscaldare un bagno d'acqua collegato al reattore bitermico a 65 gradi Celsius.Quindi, aggiungere 75 millilitri di tampone HEPES 50 millimolare, pH 8,6 nel recipiente di reazione. Chiudere ermeticamente il recipiente e rimuovere l'ossigeno facendo gorgogliare gas azoto nella soluzione tampone per circa 20 minuti. Allo stesso tempo, agitare la soluzione tampone utilizzando un agitatore magnetico.Dopo aver desossigenato la soluzione tampone HEPES, rimuovere il tubo dell'azoto dal tampone, mantenendolo sospeso sopra la soluzione per conservare un'atmosfera di azoto. Aggiungere apoferritina per ottenere una concentrazione finale di 3 milligrammi per millilitro. Continuare l'agitazione magnetica, ma ridurre la velocità di agitazione se si verifica la formazione di schiuma.Per la sintesi della magnetoferritina, utilizzare due pompe per siringhe per iniettare contemporaneamente 10,1 millilitri del precursore ferro-cobalto e 10,1 millilitri del perossido di idrogeno nella soluzione di apoferritina a una velocità di flusso di 0,15 millilitri al minuto. Proseguire con i passaggi di sintesi descritti nel protocollo testuale. Successivamente, caricare il campione su una colonna contenente una matrice cationica utilizzando una pompa peristaltica a una velocità di flusso di 10 millilitri al minuto.Lavare la colonna con circa 100 millilitri di tampone di lavaggio utilizzando una pompa a gradiente a un flusso di 10 millilitri al minuto. Per eluire la proteina, lavare la colonna con 150 millilitri di concentrazioni crescenti di cloruro di sodio e tampone tris a 10 millilitri al minuto. Poiché la proteina eluisce a una concentrazione di cloruro di sodio di 500 millimolare, raccoglierla in frazioni da 50 millilitri mediante un raccoglitore frazionario automatico.Concentrare i 150 millilitri di magnetoferritina a un volume di circa due millilitri utilizzando un'unità filtrante centrifuga da 15 millilitri seguita da un'unità da quattro millilitri. Fare riferimento alle istruzioni del produttore delle unità filtranti centrifughe per un protocollo dettagliato di questa procedura. Successivamente, caricare il campione concentrato su una colonna di filtrazione su gel mediante un loop di iniezione.Lavare la colonna con il tampone di eluizione a una velocità di flusso di 1,3 millilitri al minuto. Raccogliere frazioni da sei millilitri utilizzando un raccoglitore frazionario automatico. I monomeri proteici eluiscono per ultimi.A questo punto, la magnetoferritina purificata può essere conservata a quattro gradi Celsius fino alla cationizzazione. Per 10 milligrammi di magnetoferritina, pesare 374 milligrammi di DMPA e sciogliere in 2,5 millilitri di buffer MES 200 millimolare. Regolare il pH della soluzione a circa sette utilizzando acido cloridrico concentrato.Gas tossici vengono rilasciati quando si regola il pH della soluzione di DMPA con acido cloridrico. Assicurarsi di manipolare questi materiali in una cappa aspirante. Aggiungere 2,5 millilitri di soluzione di magnetoferritina a quattro milligrammi per millilitro.Aggiungere un agitatore magnetico e agitare per due ore per raggiungere l'equilibrio. Dopo aver regolato la soluzione a pH 5,0, aggiungere 141 milligrammi di polvere di EDC alla soluzione di magnetoferritina DMPA. Continuare ad agitare per tre ore e mezza.Filtrare la soluzione attraverso un filtro a siringa da 0,22 micron per rimuovere eventuali precipitati e dializzare la proteina come descritto nel protocollo del testo. Coltivare le hMSC come descritto nel protocollo del testo. Lavare le cellule in piastra con due millilitri di PBS a temperatura ambiente.Quindi, aggiungere un millilitro della soluzione sterile di magnetoferritina cationizzata alle cellule piastrate prima di incubare per il periodo di tempo desiderato. Lavare le cellule con PBS, quindi raccoglierle aggiungendo 0,5 millilitri di tripsina-EDTA e incubando a 37 gradi Celsius per cinque minuti. Dopo aver aggiunto un millilitro di mezzo di coltura per inattivare la tripsina-EDTA, trasferire la soluzione in un tubo da centrifuga da 15 millilitri e centrifugare per cinque minuti a 524 ×g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet cellulare in 0,5 millilitri di buffer per separazione magnetica.Successivamente, fissare il magnete al supporto multiplo e inserire una colonna di separazione magnetica sul magnete. Posizionare un filtro di pre-separazione sulla colonna. Aggiungere quindi 0,5 millilitri di tampone di separazione magnetica sul filtro di pre-separazione e lasciarlo scorrere attraverso sia il filtro che la colonna per lavarli.Successivamente, posizionare un tubo da centrifuga da 15 millilitri sotto la colonna ed aggiungere 0,5 millilitri della sospensione cellulare nel serbatoio del filtro della colonna di separazione magnetica. Quando il serbatoio è vuoto, aggiungere 0,5 millilitri di tampone per la separazione magnetica. Quando il serbatoio si svuota nuovamente, aggiungere altri 0,5 millilitri di tampone per la separazione magnetica.Ripetere il lavaggio un’altra volta, per un volume totale di tampone per separazione magnetica pari a 1,5 millilitri. Questo passaggio di lavaggio eluisce tutte le cellule non magnetizzate dalla colonna. Rimuovere la colonna dal magnete e posizionarla in una nuova provetta da centrifuga da 15 millilitri.Quindi, rimuovere il filtro dal serbatoio della colonna. Aggiungere 1 millilitro del tampone di separazione magnetica nel serbatoio e spingerlo immediatamente attraverso la colonna utilizzando lo stantuffo fornito dal produttore. Questo eluisce le cellule magnetizzate dalla colonna nel tubo da centrifuga.Procedere alla quantificazione del ferro come descritto nel protocollo testuale. Le immagini di microscopia elettronica a trasmissione di campioni di magnetoferritina colorati negativamente hanno mostrato che le nanoparticelle si sono formate all'interno della gabbia proteica. Le misurazioni del potenziale zeta confermano che la magnetoferritina ha acquisito una carica superficiale positiva dopo la cationizzazione.Esponendo le cellule staminali mesenchimali umane alla magnetoferritina cationizzata per un minuto, si è ottenuta la magnetizzazione del 92% della popolazione cellulare e il rilascio di 3,6 picogrammi di ferro per cellula. Aumentando il tempo di incubazione a 15 minuti, si è ottenuta la magnetizzazione dell'intera popolazione cellulare. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere compreso come sintetizzare una nanoparticella magnetica all'interno della cavità dell'apoferritina aggiungendo in modo sequenziale precursori di sali metallici alla soluzione proteica.E quindi, come cationizzare chimicamente la proteina utilizzando l'accoppiamento con TMPA. Una volta acquisita padronanza, la sintesi, la purificazione e la cationizzazione della magnetoferritina possono essere completate in tre giorni, se eseguite correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è fondamentale evitare contaminazioni da ossigeno e mantenere costantemente la temperatura e il pH corretti durante la sintesi della magnetoferritina.A seguito di questa procedura, altri carichi come punti quantici o agenti terapeutici possono essere incapsulati all'interno della gabbia di apoferritina cationizzata per ottenere un rilascio più efficiente di questi materiali nelle cellule. Questa tecnica può aprire la strada ai ricercatori nel campo della manipolazione magnetica cellulare, permettendo di esplorare l'etichettatura magnetica in cellule che mostrano un basso assorbimento delle nanoparticelle o che sono particolarmente sensibili a un'esposizione prolungata o a concentrazioni elevate di nanoparticelle.

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