Realizzazione di un UV-Vis e Raman Spectroscopy Immunoassay Platform

L'obiettivo generale di questo protocollo è dimostrare lo sviluppo di un immunoassay personalizzabile basato su nanoparticelle d'oro, in grado di essere analizzato mediante spettroscopia UV-Visibile e Raman. L'utilizzo di due metodi ottici fornisce una validazione interna dell'assay e aumenta la sua flessibilità. Questo metodo risponde a domande fondamentali relative allo sviluppo di un immunoassay basato su nanoparticelle d'oro.

Spiega inoltre come la funzionalizzazione della nanoparticella utilizzata in questo saggio influenzi l'assorbimento ottico e la diffusione della luce. Questo protocollo è unico perché incorpora materiali reperibili nei laboratori di ricerca tipici per realizzare una piattaforma per saggio immunoistochimico personalizzabile in base alle esigenze di ricerca individuali. Il saggio immunoistochimico si basa sulla spettroscopia UV-Vis e sulla spettroscopia Raman.

L'utilizzo della spettroscopia Raman è preferibile rispetto ai metodi fluorescenti o colorimetrici, poiché presenta bande più strette che permettono la rilevazione simultanea di più biomarcatori. Per iniziare, idratare l'agente di crosslinking bifunzionale o il PEG-NHS disolfuro di piridile in 100 mL di bicarbonato di sodio. L'estremità orto-piridilica si legherà alla superficie della nanoparticella d'oro, mentre l'estremità NHS reagirà con l'ammina primaria sulla superficie della proteina una volta attivata.

Assicurarsi di preparare la soluzione di cross-linking entro circa 20 minuti dall'uso. Successivamente, aggiungere il cross-linker bifunzionale alla soluzione di anticorpo in un rapporto di coniugazione 2:1. Accertarsi che la soluzione di anticorpo sia priva di proteine da vettore che potrebbero interagire con la reazione.

In un altro tubo da microcentrifuga, aggiungere il cross-linker bifunzionale alla soluzione dell'antigene nello stesso rapporto che verrà utilizzato per il controllo. Il rapporto 2 a 1 presuppone un'efficienza di coniugazione del 50%. L'obiettivo è etichettare ciascun anticorpo con una singola catena di peg.

In questo passaggio, è preferibile un'etichettatura eccessiva rispetto a una scarsa. Infine, incubare la soluzione di anticorpo pegilato a quattro gradi Celsius per otto ore. Conservare aliquote da 25 microlitri della soluzione in provette a basso legame a meno 20 gradi Celsius per limitare i cicli di congelamento e scongelamento.

Utilizzare ogni aliquote secondo necessità. Per preparare le sonde Raman, preparare innanzitutto due lotti da 1,5 mL di nanoparticelle d'oro sul reporter Raman, con concentrazioni determinate come descritto nel protocollo testuale allegato. Questo passaggio viene effettuato combinando le soluzioni del reporter Raman e delle nanoparticelle d'oro e lasciando che si leghino per trenta minuti a temperatura ambiente.

Quindi, aggiungere la soluzione di anticorpo pegilato a una delle soluzioni di nanoparticelle d'oro legate al reporter per ottenere un rapporto di 200 a 1 tra anticorpi e particelle. Questa soluzione sarà utilizzata per i campioni di prova. In un altro tubo da microcentrifuga, aggiungere un antigene pegilato all'altra soluzione di nanoparticelle d'oro legate al reporter in un rapporto di 200 a 1 tra antigene e particelle, da utilizzare come controllo.

Incubare entrambe le soluzioni per trenta minuti a temperatura ambiente. Successivamente, bloccare i siti rimanenti sulla superficie della nanoparticella. Per ottenere questo, sciogliere innanzitutto il tiolo di metossipolietilene glicole solido fino a una concentrazione di 200 micromolare utilizzando acqua HPLC.

Agitare la soluzione con un vortex fino a quando il tiolo non si è completamente sciolto. Successivamente, aggiungere la soluzione di tiolo alle soluzioni di anticorpi peg legati alle nano particelle in un rapporto di 40.000 a 1 e incubare la soluzione a temperatura ambiente per dieci minuti per assicurare che i siti rimanenti sulla nano particella d'oro siano bloccati. Successivamente, recuperare le sonde Raman funzionalizzate centrifugando le particelle in provette da centrifuga a basso legame in modo che il sopranatante risulti limpido.

Rimuovere il soprannatante mediante pipetta, avendo cura di non disturbare le nanoparticelle. Successivamente, risospendere le nanoparticelle in 1 mL di PBS. Stimare la concentrazione delle nanoparticelle d'oro effettuando una misura nello spettro UV-visibile su circa 3 microlitri della soluzione e confrontare i risultati con quelli ottenuti da una concentrazione nota di nanoparticelle d'oro, poiché questa relazione è lineare.

Se le nanoparticelle non sono sufficientemente bloccate, si aggregheranno a causa delle forze di adesione interparticellare, indicando che i reagenti sono stati aggiunti a concentrazioni errate. Normalmente, la soluzione ha un colore rosso intenso, ma l'aggregazione conferisce una tinta grigia. Regolare i volumi in modo che le soluzioni finali contengano almeno 1 × 10¹¹ particelle per millilitro e conservare le soluzioni a quattro gradi Celsius fino al loro utilizzo per la funzionalizzazione della piastra per saggio amino.

Utilizzare queste soluzioni entro una settimana. Preparare innanzitutto una quantità sufficiente dell'antigene diluito per riempire i pozzetti in polistirene. Quindi, vortexare la soluzione e aggiungerla immediatamente nei pozzetti della piastra.

Lasciare che l'antigene si leghi alle piastre per un'ora a temperatura ambiente. Rimuovere quindi la soluzione di antigene in eccesso svuotando la soluzione e battendo la piastra contro un tavolo coperto con carta assorbente. Aggiungere TBST nei pozzetti per lavare la superficie, quindi rimuovere il lavaggio svuotando nuovamente la soluzione e battendo la piastra contro un tavolo coperto con carta assorbente.

Successivamente, bloccare i siti di legame rimanenti sulla piastra per prevenire legami non specifici aggiungendo 70 microlitri di soluzione bloccante di HSA in ogni pozzetto della piastra e incubando la piastra a temperatura ambiente per trenta minuti. Quindi, rimuovere la soluzione bloccante e risciacquare la piastra tre volte con TBST come precedentemente dimostrato. Dopo aver rimosso l'ultimo risciacquo, coprire la piastra e conservarla al buio a quattro gradi Celsius fino all'uso successivo.

Aggiungere 140 microlitri delle nanoparticelle sonda precedentemente preparate nella prima colonna di una piastra a 96 pozzetti. Posizionare le nanoparticelle di prova nelle prime cinque righe, quindi le nanoparticelle di controllo nelle ultime tre righe. Aggiungere 70 microlitri di PBS in tutte le altre colonne.

Diluire ogni colonna utilizzando una diluizione seriale 1 a 2. Iniziare prelevando 70 microlitri dalla prima colonna e mescolandoli con la seconda. Successivamente, prelevare 70 microlitri dalla seconda colonna e aggiungerli alla terza e così via.

Lasciare la piastra in incubazione per almeno un'ora. Successivamente, rimuovere le sonde a base di nanoparticelle non legate e lavare la piastra con TBST cinque volte come precedentemente dimostrato. Dopo l'ultimo lavaggio, aggiungere 70 microlitri di PBS in ogni pozzetto e coprire la piastra con un sigillo per piastre.

Verificare che i campioni di controllo siano limpidi. Se si è verificato un legame non specifico, i campioni di controllo avranno un colore simile a quello dei campioni in prova. Per ogni pozzetto, utilizzare uno spettrofotometro UV-Vis a lettura di piastre per misurare gli spettri UV-Vis nell'intervallo compreso tra 400 e 700 nanometri.

Utilizzando un microscopio Raman invertito, focalizzare l'obiettivo sulla superficie della pozzetta contenente le sonde di nanoparticelle d'oro. Ottenere uno spettro Raman della pozzetta. Acquisire uno spettro compreso tra 1800 cm⁻¹ e 400 cm⁻¹ e ripetere l'operazione per ogni pozzetta.

Infine, seguire i passaggi nell'ultima sezione del protocollo di testo allegato per determinare la sensibilità della configurazione. Le particelle d'oro di 60 nanometri sono state preparate come descritto in questo video. Successivamente, sono state analizzate mediante spettroscopia UV-Visibile e spettroscopia Raman.

Le aree dei picchi in cui sono state determinate le concentrazioni di ogni nanostruttura d'oro sono state analizzate mediante un software open source per l'analisi spettrale e sono state utilizzate per generare una curva di calibrazione logaritmica come quella mostrata qui. Sulla base di questi dati, il limite inferiore di rilevamento è risultato pari a 3,5 picomolare per il rilevamento UV-Visibile e a 1,7 picomolare quando è stata utilizzata la spettroscopia Raman. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come personalizzare saggi immunoenzimatici basati su sonde a nanostrutture mediante spettroscopia UV-Vis e spettroscopia Raman.