Name: SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-03T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 24 s
Description: Scopri la caratterizzazione proteomica degli esosomi da cellule infettate da HIV-1 utilizzando il metodo SILAC. Questa tecnica quantitativa permette di analizzare le modifiche della composizione esosomale in condizioni di stress.

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Questo lavoro è stato supportato da un supplemento ARRA alla durata della vita / Tufts / Brown CFAR, P30AI042853-13S1, NIH P20GM103421, P01AA019072, R01HD072693, e K24HD080539 a BR. Questo lavoro è stato supportato anche da Fondo Durata pilota di ricerca (# 701- 5857), Rhode Island Medical Research Foundation Grant (# 20.133.969), e NIH COBRE URI / RIH Pilot Research Grant (P20GM104317) per ML. Ringraziamo James Myall e Vy Dang per un aiuto con la preparazione del manoscritto e la figura.

1. Colture cellulari e HIV-1 NOTA: Prima di iniziare gli esperimenti, si consiglia di verificare la vitalità delle cellule attraverso Trypan Blue colorazione 11 e la loro proliferazione attraverso un saggio di MTT 12. E &#39;inoltre fondamentale utilizzare media SILAC appena preparata. Varie linee cellulari possono essere usati, purché siano in fase attiva proliferativa, e sono suscettibili di HIV-1, o la condizione di test di scelta. In questo protocollo, usare la linea cellulare H9 come l&#39;esempio. <ol><li> Seed 2 x 10 6 cellule H9 in ciascun pallone di coltura cellulare. Grow un gruppo in 10 ml etichettati terreno RPMI 1640 contenente 10% siero bovino fetale dializzato (FBS), 100 mg / L 13 C 6 L-lisina e 100 mg / L 13 C 6 15 N 4 L-arginina. Grow l&#39;altro gruppo in 10 ml senza etichetta terreno RPMI 1640 con 10% FBS dializzato, 100 mg / L di L-lisina e 100 mg / L di L-arginina. </li><li>Far crescere le cellule per sei raddoppi a quel punto le proteine ​​delle cellule nel mezzo etichettato sono praticamente completamente etichettati (&gt; 99%) con aminoacidi pesanti. Aggiungere mezzi freschi o cambiare supporto regolarmente (ogni 1-3 giorni a seconda del tipo di cellula. Per cellule H9, cambiare media ogni 3 giorni). Alla fine di etichettatura, aumentare il volume di coltura (per es ~ 30 ml) per accogliere la crescita di nuove cellule. NOTA: Determinare cella esatto tempo di raddoppio all&#39;inizio dell&#39;esperimento tramite colorazione Trypan blu e conteggio delle cellule. </li><li> Infettare le cellule marcate con HIV-1 NL4-3 utilizzando standard di HIV-1 infezione protocollo 13 per 48 ore. Incubare le cellule con quantità appropriate di virus con una molteplicità di infezione (MOI) circa 0,3. Controllare HIV-1 da p24 quantificazione dei sovranatanti di coltura utilizzando un kit di p24 HIV-1 ELISA. Eseguire un test di immunofluorescenza 14 per confermare l&#39;infezione con successo delle cellule. Keep crescere le cellule non etichettati in media senza etichetta, senza HIV-1. </li><li> Raccogliere i supernatanti di entrambi i gruppi alla fine di infezione (passo 2.1). </li></ol> 2. Isolamento Exosome NOTA: Attraverso una serie di passaggi ultracentrifugazione, frazioni exosomal da sovranatanti sono arricchiti 15. Eseguire le seguenti operazioni a 4 ° C, con un rotore Ultracentrifuge che può raggiungere una velocità di almeno 100.000 x g. <ol><li> Raccogliere i surnatanti delle colture in 50 ml provette coniche, evitando le cellule. li centrifugare per 10 minuti a 300 xg per rimuovere le cellule rimanenti. </li><li> Raccogliere il surnatante in nuovi 50 ml provette coniche e centrifugare per 10 minuti a 2.000 xg per rimuovere le cellule morte. Trasferimento risultante supernatanti a tubi rotori compatibile commerciali che sono in grado di resistere ultracentrifugazione. </li><li> Assicurati di bilanciare i tubi ultracentrifuga. Centrifugare le provette per 30 min a 10.000 xg per rimuoveredetriti cellulari. </li><li> Raccogliere i surnatanti in tubi ultracentrifuga e centrifugare per 70 min a 100.000 x g. Eliminare il surnatante. </li><li> Risospendere il pellet ricco di exosome in 5 ml di PBS fresco. Trasferire le soluzioni a tubi ultracentrifuga freschi e centrifugare ancora per 70 min a 100.000 x g. </li><li> surnatanti scartare. Per memorizzare i exosomes a lungo termine, risospendere il pellet in 50 ml di PBS e conservare a -80 ° C. In alternativa, procedere direttamente alla estrazione di proteine ​​come illustrato di seguito. </li></ol> 3. Proteine ​​estrazione e preparazione <ol><li> Sciogliere isolati pellet exosomal a 100-200 ml RIPA lisi e l&#39;estrazione del buffer con cocktail inibitori della proteasi aggiunto. Il buffer è composta da 25 mM Tris-cloridrato, cloruro di sodio 150 mM, 1% NP-40, 1% sodio desossicolato, e 0,1% SDS (sodio dodecil solfato), a pH 7,6. I cocktail di inibitori della proteasi dovrebbero contenere una varietà di inibitori delle proteasi, come ad esempio l&#39;aprotinina, Bestatin, leupeptin, pepstatina A e EDTA (acido etilendiamminotetraacetico), che può inibire una gamma completa di proteasi. </li><li> Centrifugare le soluzioni disciolti per 10 minuti a 13.000 xg (4 ° C), e trasferire il surnatante eliminato per nuovi tubi da 1,5 ml microcentrifuga. </li><li> Quantificare concentrazione di proteine di ogni campione di esosomi con acido bicinconinico (BCA) o saggio Bradford 16. </li><li> Miscelare una quantità uguale di proteine ​​(2 mg) da campioni etichettati e senza etichetta ed eseguire la miscela uguale su un gel SDS-PAGE 4-20% a 120 mA / 200 V per 30 min. </li><li> Gel Stain con Coomassie blu seguito da decolorazione 17. </li><li> Utilizzando una lama di rasoio, tagliare la corsia campione dal gel. Poi tagliare la corsia di gel in 10-15 pezzi uguali. Mettere ogni pezzo in un 1,5 ml provetta fresco per un totale di 10-15 tubi. </li><li> Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3 nel 50% acetonitrile, vortice, e scartare surnatanti. Ripetere due volte. Asciuttocubi in un concentratore a vuoto 18, 19. </li><li> Reidratare cubi con 10 mM ditiotreitolo (DTT), vortex e centrifugare brevemente. Incubare a 56 ° C per 1 ora. surnatante degli scarti. </li><li> Immergere cubi di gel a 55 mm Iodoacetamide, vortice, ed effetti. Incubare a temperatura ambiente al buio per 45 min. surnatante degli scarti. </li><li> Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3, vortice, rotazione, e scartare il surnatante. </li><li> Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3 nel 50% acetonitrile, vortice, ed effetti. Ripetere 3.9 e 3.10. </li><li> Asciugare i cubi in un concentratore a vuoto. Aggiungere 25 ml di sequenziamento grado tripsina modificata in 25 mM NH 4 HCO 3, incubare a 4 ° C per 30 minuti, e scartare la soluzione in eccesso. Immergere cubi in 25 mM NH 4 HCO 3 senza tripsina, e incubare una notte a 37 ° C. </li><li> Brevemente girare cubetti verso il basso e trasferire il peptide risultante in piùct in una nuova provetta. Aggiungere 30 ml di acido formico al 5% in 50% acetonitrile ai cubi, vortex per 30 min, e rotazioni. Unire il surnatante con l&#39;estratto. Essiccare gli estratti peptide con un concentratore a vuoto a meno di 5 microlitri. </li><li> Invia campioni di impianto di base spettrometria di massa per l&#39;analisi LC-MS / MS. L&#39;analisi dei dati di MS, che può essere generato da un software open source, in genere include un numero di registrazione per ogni proteina identificata, etichettati rapporti / senza etichetta e il numero di peptidi unici identificati. </li></ol> 4. Western Blotting di verifica NOTA: Western blotting si raccomanda di verificare i risultati di spettrometria di massa. <ol><li> Seguire i protocolli Western Blotting standard e garantire che le quantità uguali di proteine ​​di ogni gruppo vengono caricati. Usare gli anticorpi contro le proteine di interesse (ad esempio A5 annexin, lattato deidrogenasi a catena B) individuati dalla SM. rilevamento Western blotting, insieme a densitometria analisi des, in grado di ribadire che l&#39;identificazione delle proteine ​​MS e quantificazione siano corretti. </li></ol> 5. Analisi dei dati proteomica NOTA: la valutazione della qualità dei dati, pre-trattamento dei dati, il calcolo e la determinazione di importanti candidati proteine ​​sono fatte separatamente per ciascuno Stato membro si replicano. Una volta che le analisi di cui sopra sono stati completati, i dati analizzati da repliche vengono confrontati e combinati 6, 20, 21. <ol><li> Valutare la qualità dei dati MS. <ol><li> In primo luogo, log2 trasformare la SILAC-MS etichettato / rapporti senza etichetta di proteine ​​quantificate in un foglio di calcolo. </li><li> Nella rappresentazione grafica scientifica e software statistico, i rapporti di gruppo in 40-100 bidoni rapporto e tracciare il numero di rapporti per scomparto per generare un istogramma. Un normale distribuzione di istogramma indica una buona qualità dei dati MS 6. Fare questo passo per tutta la MS replica. </li></ol></li><li>Per aumentare la fiducia e l&#39;accuratezza dei rapporti peptide MS, prendere in considerazione la rimozione di proteine ​​che hanno meno di due peptidi quantificati. </li><li> Per determinare i candidati di proteine in modo significativo l&#39;alto e verso il basso-regolato, utilizzare le seguenti operazioni per il calcolo soglie significative 22. <ol><li> Nella rappresentazione grafica scientifica e software statistico, generare una regressione non lineare o una curva-fit per i dati di distribuzione di frequenza. Questo passo produce valori che possono essere utilizzati per calcolare i valori di cutoff. Calcolare i valori di cut-off come mediana ± 1,96 σ per il 95% limiti di confidenza o 2,56 σ per il 99% limiti di confidenza. NOTA: I dettagli specifici del calcolo dei tagli può essere trovato alla Emmott et al. 22. </li><li> Selezionare i candidati proteina la cui rapporti sono o superiore a 1,96 (o 2,56) deviazioni standard sopra la mediana (significativamente sovra-espresso) o inferiore a 1,96 (o 2,56) deviazioni standard al di sotto della mediana (significativamente sotto-espressi). </li></ol></li><li> Confrontare le repliche dei candidati rilevanti sopra individuati per garantire la coerenza. Assicurarsi che soddisfano i seguenti criteri di passare questa fase di selezione finale: i candidati devono individuare in modo coerente in tutte le repliche; e repliche di un candidato devono essere coerenti nella loro direzione, del regolamento (preferibilmente almeno 2 su 3 repliche di un candidato dovrebbe essere o up-regolati o down-regolato). </li><li> Finalizzare i dati per i candidati che soddisfano i criteri di cui sopra unendo i dati replicati loro. </li></ol> 6. Bioinformatica verifica e caratterizzazione NOTA: esistenti informazioni genomiche e bioinformatica offre una ricchezza di informazioni per quasi ogni proteina. Data mining e analisi bioinformatica di tali informazioni possono aiutare ad acquisire una grande quantità di comprensione della proprietà e funzioni dei candidati significativi. questa process è di solito necessario per una corretta progettazione di esperimenti su valle. <ol><li> Usando i loro numeri GenBank adesione o gli ID UniProt, la ricerca di candidati contro database exosome correnti (Exocarta 23, Evpedia 24) per verificare che le proteine candidati sono stati precedentemente trovati in exosome. Questo passaggio aggiunge un livello di fiducia che i candidati sono infatti in esosomi. <ol><li> http://www.exocarta.org/ accesso, fai clic su &quot;Query&quot; e in ingresso sia il gene o una proteina nome / numero di adesione. Una pagina di riepilogo apparirà e le prove in exosome verrà mostrato, a condizione che se non vi è alcuna. </li></ol></li><li> Cerca i candidati contro l&#39;HIV-1 e la proteina umana Interazione Database 25. In alternativa, la ricerca di basi di dati specifici che possono fornire informazioni circa l&#39;interazione delle proteine ​​candidati e la condizione di test. <ol><li> Accedere al database a www.ncbi.nlm.nih.gov/RefSeq/HIVInterazioni. Sulla voce &#39;proteina nome di dominio&#39;, inserire i nomi dei candidati o dei numeri di adesione, e fare clic su Cerca. I risultati della ricerca possono fornire una conoscenza delle interazioni tra HIV-1 ei candidati della proteina, e suggerire che dei candidati potrebbe essere veramente HIV-1 associata. </li></ol></li><li> Importa GenBank numero o UniProt gli ID dei candidati in software di analisi GO (come FunRich, strumento di analisi di arricchimento funzionale 26) ed eseguire il software. <ol><li> Scaricare il software a http://www.funrich.org/. Dopo l&#39;installazione, aprire il software, in analisi di arricchimento, fare clic su &quot;Aggiungi Data Set&quot;, e caricare l&#39;elenco delle proteine ​​/ geni. Avanti, selezionare il tipo di grafico per visualizzare l&#39;analisi GO. NOTA: GO risultati delle analisi saranno visualizzati sotto forma di grafici a torta. Questo passo ci aiuta a ottenere una visione globale associato con i candidati nei settori della Processo biologico (BP), Cellular componente (CC), e funzione molecolare (MF). </li></ol></li><li> L&#39;accesso a DAVID http://david.ncifcrf.gov/ 27, fare clic su &quot;strumento di annotazione funzionale&quot; sul suo sito web. Inserire la lista dei candidati, selezionare l&#39;opzione &quot;Identifier&quot; del gene, come la &quot;UniProt ID&quot;, selezionare &quot;Lista Gene&quot; e di ricerca. I termini arricchiti GO, p-value, e altri parametri possono essere trovate cliccando la pagina &quot;Riepilogo risultati annotazione&quot; sotto la categoria &quot;Gene_Ontology&quot;. </li><li> Per studiare potenziali interazioni dei candidati, con altre proteine, usare apertamente accessibile database di STRING 28 per chiarire potenziali interazioni proteina-proteina e le possibili vie biochimiche. NOTA: GO analisi e annotazione funzionale (Sezione 6,3-6,4) può essere eseguita utilizzando il software più recente STRING. <ol><li> Accedere al database a http://string-db.org/. Inserire l&#39;ID di proteine ​​o la sequenza nelle s designatiscatola earch e selezionare le specie corretti per l&#39;analisi. Fai clic su &quot;Cerca&quot;. I risultati forniranno informazioni su entrambe le associazioni dirette (fisico) e indiretti (funzionale). I primi dieci partite noti per il candidato exosomal verranno visualizzati e devono essere considerati per la selezione significativa candidato. NOTA: Una grande quantità di informazioni associate con i candidati possono essere analizzati utilizzando la procedura descritta sopra. I candidati più significativi possono essere scelti per ulteriori analisi molecolari e biochimiche valle. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (8), 968-977 (2016).</li>
<li>Schorey, J. S., Bhatnagar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosome+function%3A+from+tumor+immunology+to+pathogen+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Traffic%22%5BJournal%5D)">Exosome function: from tumor immunology to pathogen biology.</a> Traffic. 9 (6), 871-881 (2008).</li>
<li>Thery, C., Ostrowski, M., Segura, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+vesicles+as+conveyors+of+immune+responses%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Immunol%22%5BJournal%5D)">Membrane vesicles as conveyors of immune responses.</a> Nat Rev Immunol. 9 (8), 581-593 (2009).</li>
<li>Booth, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exosomes+and+HIV+Gag+bud+from+endosome-like+domains+of+the+T+cell+plasma+membrane%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Exosomes and HIV Gag bud from endosome-like domains of the T cell plasma membrane.</a> J Cell Biol. 172 (6), 923-935 (2006).</li>
<li>Van Engelenburg, S. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distribution+of+ESCRT+machinery+at+HIV+assembly+sites+reveals+virus+scaffolding+of+ESCRT+subunits%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Distribution of ESCRT machinery at HIV assembly sites reveals virus scaffolding of ESCRT subunits.</a> Science. 343 (6171), 653-656 (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+proteomic+analysis+of+exosomes+from+HIV-1-infected+lymphocytic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative proteomic analysis of exosomes from HIV-1-infected lymphocytic cells.</a> Proteomics. 12 (13), 2203-2211 (2012).</li>
<li>Ong, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture%2C+SILAC%2C+as+a+simple+and+accurate+approach+to+expression+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture, SILAC, as a simple and accurate approach to expression proteomics.</a> Mol Cell Proteomics. 1 (5), 376-386 (2002).</li>
<li>Ross, P. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multiplexed+protein+quantitation+in+Saccharomyces+cerevisiae+using+amine-reactive+isobaric+tagging+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Multiplexed protein quantitation in Saccharomyces cerevisiae using amine-reactive isobaric tagging reagents.</a> Mol Cell Proteomics. 3 (12), 1154-1169 (2004).</li>
<li>Anderson, L., Hunter, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometric+multiple+reaction+monitoring+assays+for+major+plasma+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Proteomics%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometric multiple reaction monitoring assays for major plasma proteins.</a> Mol Cell Proteomics. 5 (4), 573-588 (2006).</li>
<li>Ong, S. E., Mann, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+isotope+labeling+by+amino+acids+in+cell+culture+for+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stable isotope labeling by amino acids in cell culture for quantitative proteomics.</a> Methods Mol Biol. 359, 37-52 (2007).</li>
<li>Strober, W. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aStrober%2C+W+%22Current+Protocols+in+Immunology%22">Current Protocols in Immunology</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Verma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evaluation+of+the+MTT+lymphocyte+proliferation+assay+for+the+diagnosis+of+neurocysticercosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microbiol+Meth%22%5BJournal%5D)">Evaluation of the MTT lymphocyte proliferation assay for the diagnosis of neurocysticercosis.</a> J Microbiol Meth. 81 (2), 175-178 (2010).</li>
<li>Cepko, C., Pear, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retrovirus+infection+of+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Retrovirus infection of cells in vitro and in vivo.</a> Curr Protoc Mol Biol. , Chapter 9 Unit9.14 (2001).</li>
<li>Lennette, E. T., Karpatkin, S., Levy, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indirect+immunofluorescence+assay+for+antibodies+to+human+immunodeficiency+virus%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Indirect immunofluorescence assay for antibodies to human immunodeficiency virus.</a> J Clin Microbiol. 25 (2), 199-202 (1987).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3 22(2006).</li>
<li>Olson, B. J. S. C., Markwell, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aOlson%2C+BJSC+%22Current+Protocols+in+Protein+Science%22">Current Protocols in Protein Science</a>. , John Wiley & Sons, Inc. (2001).</li>
<li>Gauci, V. J., Padula, M. P., Coorssen, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coomassie+blue+staining+for+high+sensitivity+gel-based+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteom%22%5BJournal%5D)">Coomassie blue staining for high sensitivity gel-based proteomics.</a> J Proteom. 90, 96-106 (2013).</li>
<li>Soldi, M., Bonaldi, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ChroP+approach+combines+ChIP+and+mass+spectrometry+to+dissect+locus-specific+proteomic+landscapes+of+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">The ChroP approach combines ChIP and mass spectrometry to dissect locus-specific proteomic landscapes of chromatin.</a> J Vis Exp. (86), (2014).</li>
<li>Trompelt, K., Steinbeck, J., Terashima, M., Hippler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+approach+for+the+comparative+analysis+of+multiprotein+complexes+based+on+15N+metabolic+labeling+and+quantitative+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A new approach for the comparative analysis of multiprotein complexes based on 15N metabolic labeling and quantitative mass spectrometry.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
<li>Li, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-loop+binding+protein+is+a+multifaceted+cellular+regulator+of+HIV-1+replication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Stem-loop binding protein is a multifaceted cellular regulator of HIV-1 replication.</a> J Clin Invest. 126 (8), 3117-3129 (2016).</li>
<li>Li, M., Ramratnam, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+Characterization+of+Exosomes+from+HIV-1-Infected+Cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1-Infected Cells.</a> Methods Mol Biol. 1354, 311-326 (2016).</li>
<li>Emmott, E., Goodfellow, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+protein+interaction+partners+in+mammalian+cells+using+SILAC-immunoprecipitation+quantitative+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Identification of protein interaction partners in mammalian cells using SILAC-immunoprecipitation quantitative proteomics.</a> J Vis Exp. (89), (2014).</li>
<li>Keerthikumar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ExoCarta%3A+A+Web-Based+Compendium+of+Exosomal+Cargo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">ExoCarta: A Web-Based Compendium of Exosomal Cargo.</a> J Mol Biol. 428 (4), 688-692 (2016).</li>
<li>Kim, D. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EVpedia%3A+a+community+web+portal+for+extracellular+vesicles+research%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">EVpedia: a community web portal for extracellular vesicles research.</a> Bioinformatics. 31 (6), 933-939 (2015).</li>
<li>Fu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+immunodeficiency+virus+type+1%2C+human+protein+interaction+database+at+NCBI%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Human immunodeficiency virus type 1, human protein interaction database at NCBI.</a> Nucleic Acids Res. 37, Database issue 417-422 (2009).</li>
<li>Pathan, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FunRich%3A+An+open+access+standalone+functional+enrichment+and+interaction+network+analysis+tool%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">FunRich: An open access standalone functional enrichment and interaction network analysis tool.</a> Proteomics. 15 (15), 2597-2601 (2015).</li>
<li>Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+bioinformatics+resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources.</a> Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).</li>
<li>Szklarczyk, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+STRING+database+in+2011%3A+functional+interaction+networks+of+proteins%2C+globally+integrated+and+scored%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The STRING database in 2011: functional interaction networks of proteins, globally integrated and scored.</a> Nucleic Acids Res. 39, Database issue 561-568 (2011).</li>
<li>Thery, C., Amigorena, S., Raposo, G., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+characterization+of+exosomes+from+cell+culture+supernatants+and+biological+fluids%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation and characterization of exosomes from cell culture supernatants and biological fluids.</a> Curr Protoc Cell Biol. , Chapter 3 Unit 3.22 (2006).</li>
<li>Lobb, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optimized+exosome+isolation+protocol+for+cell+culture+supernatant+and+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">Optimized exosome isolation protocol for cell culture supernatant and human plasma.</a> J Extracell Vesicles. 4, 27031(2015).</li>
<li>Webber, J., Clayton, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+pure+are+your+vesicles%5BTitle%5D)+AND+%22J+Extracell+Vesicles%22%5BJournal%5D)">How pure are your vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li>
<li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1%3A+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol+Methods%22%5BJournal%5D)">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338 (1-2), 21-30 (2008).</li>
<li>Chertova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proteomic+and+biochemical+analysis+of+purified+human+immunodeficiency+virus+type+1+produced+from+infected+monocyte-derived+macrophages%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Proteomic and biochemical analysis of purified human immunodeficiency virus type 1 produced from infected monocyte-derived macrophages.</a> J Virol. 80 (18), 9039-9052 (2006).</li>
<li>Nikolov, M., Schmidt, C., Urlaub, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+spectrometry-based+proteomics%3A+an+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass spectrometry-based proteomics: an overview.</a> Methods Mol Biol. 893, 85-100 (2012).</li>
</ol>

Gli autori hanno dichiarato di non avere alcun conflitto di interessi.

Nelle procedure descritte in questo documento, abbiamo dimostrato l&#39;applicazione della tecnica SILAC per studiare l&#39;effetto di HIV-1 sul proteoma exosomal host. Inizialmente, le cellule infette non infettate e HIV-1 sono differenziale marcati con isotopi. I exosomes differenziale etichettati vengono quindi purificati prima di eseguire l&#39;estrazione di proteine. Avanti, cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem è impiegato per analizzare il proteoma exosomal. Infine, i dati risultanti spettrometria d...

Molte malattie umane, tra cui le infezioni virali, sono spesso associate a processi cellulari distintivi che si svolgono dentro e intorno alle cellule colpite. Le proteine, spesso in qualità di effettori cellulari finale, mediare questi processi. L&#39;analisi delle proteine, spesso in grado di fornire informazioni preziose per l&#39;ambiente locale di cellule colpite e ci aiutano a comprendere il meccanismo alla base della patogenesi della malattia. Tra le varie tecniche di analisi delle proteine, la proteomica tiene particolarmente grande promessa. Come un potente strumento, su larga scala, proteomica possono fornire una comprensione sistemica di processi cellulari, in particolare nella zona della funzione e l&#39;interazione di proteine. Analizzando proteine ​​specifiche è resa più semplice grazie allo sviluppo di tecniche di marcatura, che consentono investigatori per monitorare l&#39;espressione di componenti cellulari, in particolare proteine, nel sito di indagine. Anche se molte analisi proteomica sono stati effettuati a livello cellularescala proteoma, caratterizzazioni proteomica su compartimenti subcellulari hanno dimostrato di essere particolarmente informativo 1. Questo è esemplificato bene negli studi di HIV-1. Esosomi, 30-100 vescicole di membrana nm secreti da una vasta gamma di tipi di cellule 2, 3, sono componenti critici di comunicazione intercellulare e di trasporto molecolare. Essi sono stati scoperti in precedenza a svolgere ruoli importanti nella HIV-1 in erba processo di 4, 5. Grazie alla combinazione di analisi proteomica con dissezione funzionale, abbiamo scoperto che esosomi rilasciati da HIV-1 le cellule infettate sono composti da un unico e quantitativamente diversi firma proteine e molecole regolatrici del porto che hanno un impatto proprietà cellulari su cellule vicine ricettive, tra cui l&#39;apoptosi cellulare e la proliferazione 6. I metodi sono descritti in questo protocollo,vale a dire SILAC (etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura) 7 sulla caratterizzazione proteomica di esosomi da HIV-1 le cellule infette. Approcci simili possono essere applicati per comprendere meglio altri compartimenti subcellulari durante patogenesi regolando stress sperimentale al compartimento o frazione di specifico interesse e di apportare modifiche necessarie alle procedure descritte. Dato il recente sviluppo di metodi di proteomica quantitativa, ci sono molti tra cui scegliere quando si seleziona il metodo più efficiente per un particolare esperimento. Tra questi ci sono il iTRAQ chimico-based (tag isobariche per la quantificazione relativa e assoluta) 8 e il libero etichetta MRM (monitoraggio reazione multipla) 9 tecniche. Entrambi i metodi sono strumenti potenti e sono buone scelte per le impostazioni specifiche. Per un laboratorio tipico lavorando principalmente con linee cellulari, tuttavia, questi due metodi hanno relatively costi più elevati e sono più tempo rispetto al metodo basato SILAC. SILAC è una tecnica di marcatura metabolica based che integra forme isotopiche non radioattivi di aminoacidi dal terreno di coltura in proteine ​​cellulari. In genere, gli esperimenti SILAC cominciano con due popolazioni di cellule, per esempio, infetti e non infetti. Ciascuno è differenzialmente etichettati nel suo ambiente isotopico specifico fino al raggiungimento della etichettatura. I exosomes etichettati di queste cellule vengono poi sottoposti ad estrazione delle proteine. Una volta estratti, le proteine exosomal marcate vengono analizzati utilizzando cromatografia liquida tandem massa spettroscopia 10. Infine, i risultati di spettrometria di massa e proteine ​​significativamente marcate sono sottoposti a statistica e bioinformatica analisi e verifica rigorosa biochimico. I nostri rapporti investigativi precedenti suggeriscono che le procedure SILAC / exosome sono più appropriati per linee cellulari di cellule primarie, come linee cellulari sono di solito in unstato proliferante attivo per l&#39;etichettatura isotopica efficiente,

<table><tbody><tr><td>Linea cellulare H9</td><td>ATCC</td><td>HTB-176</td><td></td></tr> Kit di analisi MTT <tr><td>Thermo</td><td>Fisher Thermo Fisher</td><td>15250061</td><td></td></tr><tr><td>Thermo</td><td>Fisher</td><td>V13154</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino dializzato (FBS)</td><td></td><td></td>Kit di quantificazione delle proteine SILAC 26400044 <td></td>Thermo</tr><tr><td>Fisher ... RPMI 1640</td><td>Thermo Fisher</td><td>89982</td><td>Versione DMEM (89983)</td></tr><tr><td>L-Arginina-HCl, 13C6, 15N4 per SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88434</td><td></td></tr><tr><td>L-Lisina-2HCl, 13C6 per SILAC</td><td>Thermo Fisher</td><td>88431</td><td></td></tr><tr><td>HIV-1 NL4-3</td><td>Programma di reagenti NIH AIDS</td> Kit ELISA per l'antigene <td>2480</td><td></td></tr><tr><td>Alliance HIV-1 p24</td><td>PerkinElmer</td><td>NEK050001KT</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuga refrigerata a supervelocità</td><td>Eppendorf</td><td>22628045</td><td></td></tr><tr><td>Ultracentrifuga refrigerata</td><td>Beckman Coulter</td><td>363118</td><td>Dovrebbe essere in grado di raggiungere 100.000 x g</td></tr><tr><td>50 mL Provette da centrifuga coniche</td><td>Thermo Fisher</td><td>14-432-22</td><td></td></tr><tr><td>Provette per ultracentrifuga</td><td>Beckman Coulter</td><td>326823</td><td></td></tr><tr><td>SW 32 Ti Rotore</td><td>Beckman Coulter</td><td>369694</td><td></td></tr><tr><td>tampone RIPA</td><td>Thermo Fisher</td><td>89900</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>Thermo Fisher</td><td> 78430</td><td></td></tr><tr><td>ThermoMixer&nbsp;</td>Kit per <td></td> il dosaggio delle proteine <td>BCA Eppendorf</td> 5384000020 <td></td></tr><tr><td></td><td>Thermo Fisher</td><td>23250</td><td></td></tr><tr><td>Spettrofotometro</td><td>Biorad</td><td>1702525</td><td></td></tr><tr><td>SDS PAGE Apparecchio per gel</td><td>Thermo Fisher</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>Novex 4-20% Tris-Glycine Mini Gel Novex</td><td></td><td>XV04200PK20</td><td></td></tr><tr><td>Reagente per colorazione in gel</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G1041</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina modificata per grado di sequenziamento</td><td>Promega</td><td>V5111</td><td></td></tr><tr><td>SpeedVac Concentratore</td><td>Thermo Fisher</td><td>SPD131DDA</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo contro l'annessina umana A5</td><td>Abcam</td><td>ab14196</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo contro la catena B della lattato deidrogenasi umana</td><td>Abcam</td><td>ab53292</td><td></td></tr><tr><td>Software grafico e statistico</td><td></td><td>SigmaPlot&nbsp;</td><td>o GraphPad Prism</td></tr><tr><td>Suite di software per proteomica quantitativa</td><td>Max Planck Institute of Biochemistry</td><td>Maxquant</td><td></td></tr><tr><td>Software e banche dati</td><td>Fornitori</td><td></td> vari <td>Fare riferimento al testo principale per i dettagli</td></tr></tbody></table>

silac based proteomica caratterizzazione di esosomi da hiv-1 le cellule infette

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

La proteomica è l'analisi su larga scala delle proteine. Le tecniche proteomiche, come la cromatografia liquida in tandem, possono caratterizzare migliaia di proteine alla volta. Queste potenti tecniche ci permettono di avere una comprensione sistemica dei cambiamenti cellulari, soprattutto quando le cellule sono sottoposte a vari stimoli, come infezioni, stress e condizioni di test specifiche. Anche con i recenti sviluppi, l'analisi del proteoma esosomiale richiede molto tempo e spesso coinvolge metodologie complesse. Inoltre, l'ampio set di dati risultante necessita spesso di un'analisi solida e semplificata per consentire ai ricercatori di eseguire ulteriori studi a valle. Qui, descriviamo un protocollo basato su SILAC per caratterizzare il proteoma esosomiale quando le cellule sono infettate da HIV-1. Il metodo si basa sulla semplice marcatura isotopica, sull'isolamento di esosomi da cellule marcate in modo differenziale e sull'analisi della spettrometria di massa. Segue l'estrazione dettagliata dei dati e l'analisi bioinformatica dei risultati proteomici. I set di dati e i candidati risultanti sono di facile comprensione e spesso offrono una grande quantità di informazioni utili per l'analisi a valle. Questo protocollo è applicabile ad altri compartimenti subcellulari e a un'ampia gamma di condizioni di test.

La figura 1A è un diagramma di flusso che illustra la procedura di etichettatura SILAC 21. Al fine di purificare gli esosomi, i campioni devono essere centrifugati tramite centrifuga. Figura 1B mostra le fasi di purificazione exosome di ultracentrifugazione di serie 21. Una volta purificate, le esosomi sono oggetto di analisi sperimentale proteomica come indicato nella procedura. <p class="jove_content"...

Qui, descriviamo un metodo di proteomica quantitativa utilizzando la tecnica di etichettatura degli isotopi stabili da aminoacidi nelle cellule in coltura (SILAC) per analizzare gli effetti di HIV-1 su proteomi exosomal host. Questo protocollo può essere facilmente adattato alle cellule in diverse condizioni di stress o infezione.

SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare il proteoma esosomiale da cellule infette da HIV-1. Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo della biologia degli esosomi, come l'effetto degli stress esterni sulla composizione del proteoma dell'esosoma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere appresa anche con un background limitato in proteomica e biologia degli esosomi.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'infezione da HIV, può essere applicato anche ad altri studi sulla malattia come le infezioni batteriche. In questo esperimento viene utilizzata la linea cellulare H9, sebbene possano essere utilizzate varie linee cellulari purché siano in fase di proliferazione attiva e siano suscettibili alla condizione di test scelta. Seminare due volte 10 fino al sesto stadio nove cellule in ciascuno dei due matracci di coltura cellulare.Coltiva una popolazione in 10 millilitri di terreno etichettato contenente il 10% di FBS stilizzato, 100 milligrammi per litro di L-lisina marcata con C13 e 100 milligrammi per litro di L-arginina marcata con C13 e N15. Far crescere l'altra popolazione in 10 millilitri di terreno non mar

silac-based-proteomic-characterization-exosomes-from-hiv-1-infected

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Immunologia e Infezioni

In questo documento vengono utilizzati dei metodi per la purificazione isolamento, e la rilevazione di esosomi, nonché le tecniche per l'analisi del loro contenuto molecolare. Questi metodi sono adattabili per l'isolamento exosome da supporti sia la cultura di cellule e fluidi biologici, e può al di là di analisi del contenuto molecolare essere utile anche per studi funzionali.

Isolamento e caratterizzazione di RNA contenenti esosomi

Questo articolo descrive un metodo per visualizzare la formazione di una sinapsi HIV-1 busta-indotta virologici vetro bistrati planari supportate da fluorescenza riflessione interna totale (TIRF) microscopia. Il metodo può anche essere combinato con immunofluorescenza per rilevare l'attivazione e ridistribuzione di molecole di segnalazione che si verificano durante HIV-1 busta indotta la formazione di sinapsi virologica.

Imaging di HIV-1 Envelope indotta Synapse virologica e segnalazione sui doppi strati lipidici sintetici

Tecniche di sezionare i meccanismi alla base della secrezione del virus HIV-1 Nef in exosomes sono descritti. Peptidi brevi specifici derivati ​​dalla Nef e trasfezione di proteine ​​sono stati sfruttati per determinare la struttura, la funzione, e partner di legame di di Nef secrezione Modification Regione. Queste procedure hanno rilevanza generale in molti studi meccanicistici.

Identificazione Peptide-based di Motivi funzionali e dei loro partner di legame

Esperimenti di immunoprecipitazione SILAC rappresentano un potente mezzo per scoprire nuova proteina: interazioni proteina. Consentendo l'accurata quantificazione relativa abbondanza di proteine ​​sia nel controllo e campioni di prova, veri interazione può essere facilmente distinto da contaminanti sperimentali e interazioni bassa affinità conservata attraverso l'uso di condizioni di buffer meno stringenti.

Identificazione delle proteine ​​partner di interazione in cellule di mammifero Uso SILAC-immunoprecipitazione quantitativi Proteomica

Vengono descritte le tecniche che descrivono una procedura a gradiente per separare gli esosomi dalle particelle del virus dell'immunodeficienza umana (HIV). Questa procedura è stata utilizzata per isolare gli esosomi dalle particelle di HIV nel plasma umano da individui infetti da HIV. Gli esosomi isolati sono stati analizzati per il contenuto di citochine/chemochine.

Isolamento di esosomi dal plasma di HIV-1 individui positivi

gocce lipidiche sono organelli importanti per la replicazione di diversi agenti patogeni, tra cui il virus dell'epatite C (HCV). Si descrive un metodo per isolare le goccioline lipidiche per la spettrometria di massa quantitativa delle proteine ​​associate; può essere utilizzato in una varietà di condizioni, come l'infezione da virus, stress ambientale, o di trattamento farmacologico.

Isolamento Droplet per l&#39;analisi quantitativa dei lipidi Spettrometria di Massa

Descritto è una metodologia per quantificare l'espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l'identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l'approccio allo studio SIV-infettati CD4+ T cellule isolate da macachi rhesus.

Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Questo protocollo isola le vesciche extracellulari (EV) lontano dai virioni con elevata efficienza e resa incorporando precipitazioni EV, ultracentrifugazione del gradiente di densità e cattura di particelle per consentire un flusso di lavoro semplificato e una riduzione dell'avvio volume, con conseguente preparazione riproducibile per l'uso in tutte le ricerche EV.

Purificazione dei preparati vescicoli extracellulari ad alto rendimento lontano dal virus

Qui, presentiamo un protocollo in cui le singole cellule vengono monitorate per eventi acuti e infezioni produttive da HIV-1 su un dispositivo nanofluidico. I dati di imaging definiscono le interazioni del recettore virus-host e la dinamica del percorso di segnalazione. Questo è il primo metodo per la coltura e l'imaging longitudinali a singola cellula ad alta produttività nanofluidica per studiare la cinetica segnalante e le interazioni molecolari.

Caratterizzazione a una cellula dell'afflusso di calcio e dell'infezione da HIV-1 utilizzando una piattaforma optofluidica multiparametro

La microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta (dSTORM) viene utilizzata per bypassare il limite di diffrazione tipico della microscopia ottica e per visualizzare gli esosomi su scala nanometrica. Può essere impiegato sia in due che in tre dimensioni per caratterizzare gli esosomi.

Microscopia a ricostruzione ottica stocastica diretta di vescicole extracellulari in tre dimensioni

Qui, descriviamo alcuni metodi consolidati per determinare lo stress del reticolo endoplasmatico (ER) e l'attivazione della risposta proteica dispiegata (UPR), con particolare enfasi sull'infezione da HIV-1. Questo articolo descrive anche una serie di protocolli per studiare l'effetto dello stress ER/UPR sulla replicazione dell'HIV-1 e sull'infettività del virione.

Misurazione dello stress del reticolo endoplasmatico e della risposta proteica dispiegata nelle cellule T infette da HIV-1 e analisi del suo ruolo nella replicazione dell'HIV-1

Scopri la caratterizzazione proteomica degli esosomi da cellule infettate da HIV-1 utilizzando il metodo SILAC. Questa tecnica quantitativa permette di analizzare le modifiche della composizione esosomale in condizioni di stress.

SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

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