SILAC Based proteomica Caratterizzazione di Esosomi da HIV-1 le cellule infette

L'obiettivo generale di questa procedura è caratterizzare il proteoma esosomiale da cellule infette da HIV-1. Questo metodo può aiutare a rispondere alla domanda chiave nel campo della biologia degli esosomi, come l'effetto degli stress esterni sulla composizione del proteoma dell'esosoma. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può essere appresa anche con un background limitato in proteomica e biologia degli esosomi.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sull'infezione da HIV, può essere applicato anche ad altri studi sulla malattia come le infezioni batteriche. In questo esperimento viene utilizzata la linea cellulare H9, sebbene possano essere utilizzate varie linee cellulari purché siano in fase di proliferazione attiva e siano suscettibili alla condizione di test scelta. Seminare due volte 10 fino al sesto stadio nove cellule in ciascuno dei due matracci di coltura cellulare.

Coltiva una popolazione in 10 millilitri di terreno etichettato contenente il 10% di FBS stilizzato, 100 milligrammi per litro di L-lisina marcata con C13 e 100 milligrammi per litro di L-arginina marcata con C13 e N15. Far crescere l'altra popolazione in 10 millilitri di terreno non marcato con il 10% di FBS stilizzato, L-lisina e L-arginina. Far crescere le cellule per sei raddoppi, a quel punto le proteine delle cellule nel terreno marcato sono marcate per oltre il 99% con amminoacidi pesanti.

Aggiungere nuovi supporti o cambiare i supporti a intervalli di tempo regolari a seconda del tipo di celle. Al termine della marcatura, aumentare il volume di coltura a 30 millilitri per accogliere la crescita di più cellule. Infettare le cellule marcate con il ceppo NL4-3 di HIV-1 utilizzando un protocollo standard di infezione da HIV-1.

Aggiungere una quantità appropriata di virus alle cellule e incubare per 48 ore mentre le cellule non marcate continuano a crescere in terreno non marcato senza infezione da HIV-1. Al termine dell'infezione da HIV-1, i surnatanti di entrambe le popolazioni cellulari vengono raccolti per l'isolamento degli esosomi. Raccogliere i surnatanti delle colture in provette coniche da 50 millilitri evitando le cellule.

Centrifugare per 10 minuti a 300 volte g e quattro gradi Celsius per rimuovere le cellule rimanenti. Raccogliere i surnatanti in nuove provette coniche da 50 millilitri e centrifugare per 10 minuti a 2.000 volte g per rimuovere le cellule morte. Trasferire i surnatanti risultanti in provette commerciali compatibili con rotori in grado di resistere all'ultracentrifugazione.

Assicurarsi di bilanciare le provette dell'ultracentrifuga. Centrifugare le provette per 30 minuti a 10.000 volte g per rimuovere i detriti cellulari. Raccogli i surnatanti in nuove provette per ultracentrifuga.

Centrifugare per 70 minuti a 100.000 volte g. Scartare il surnatante. Risospendere ogni pellet ricco di esosomi in cinque millilitri di PBS fresco e trasferire la soluzione in una provetta per ultracentrifuga nuova.

Centrifugare nuovamente per 70 minuti a 100.000 volte g. Dopo il giro finale, scartare il surnatante. I pellet cellulari sono ora pronti per l'estrazione delle proteine.

Per iniziare questa procedura, sciogliere ogni pellet esosomiale isolato in 100-200 microlitri di fer-pa-lai-ses e tampone di estrazione con l'aggiunta di inibitori della proteasi che possono inibire una gamma completa di proteasi. Centrifugare le soluzioni disciolte per 10 minuti a 13.000 volte g e quattro gradi Celsius. Trasferire i surnatanti chiariti in nuove provette per microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Dopo aver quantificato la concentrazione proteica di ciascun campione mediante saggi standard, mescolare quantità uguali di proteine dai campioni marcati e non etichettati. Applicare la miscela uguale su un gel SDS-PAGE dal 4 al 20% per 30 minuti. Colorare il gel con il blu Coomassie seguito da decolorare.

Usando una lama di rasoio, tagliare la corsia del campione dal gel, quindi tagliare la corsia del gel in 10-15 pezzi uguali. Metti ogni pezzo in una provetta da microcentrifuga fresca da 1,5 millilitri per un totale di 10-15 provette e continua con la procedura di estrazione delle proteine come descritto nel protocollo di testo. Le procedure per l'analisi dei dati proteomici non saranno dimostrate ma sono riassunte in questo diagramma di flusso.

Le proteine estratte vengono prima analizzate mediante cromatografia liquida, spettroscopia di massa tandem e viene valutata la qualità dei dati. Successivamente, i dati vengono pretrattati rimuovendo le proteine che hanno meno di due peptidi quantificati. Vengono quindi identificate proteine significativamente sovraregolate e sottoregolate.

Infine, le repliche dei candidati significativi vengono confrontate per ottenere la coerenza e i dati di tutte le repliche vengono uniti. Per iniziare la caratterizzazione delle proteine identificate, utilizzare i loro numeri di accesso GenBank o gli ID UniProt per cercare negli attuali database di esosomi. ExoCarta verrà utilizzato in questa dimostrazione.

Fare clic su Query e immettere il nome del gene o della proteina o il numero di accesso. Qualsiasi prova negli esosomi verifica che le proteine candidate siano state precedentemente trovate negli esosomi e aggiunge un livello di fiducia che i candidati siano effettivamente negli esosomi. Quindi, cerca i candidati nel database dell'HIV-1 e dell'interazione proteica umana.

Nella voce del nome di dominio della proteina, inserisci i nomi o i numeri di accesso del candidato e fai clic su Cerca. I risultati della ricerca possono fornire informazioni sulle interazioni tra l'HIV-1 e le proteine candidate e suggerire quale dei candidati potrebbe essere veramente associato all'HIV-1. Il terzo passo consiste nell'ottenere una visione globale dei candidati utilizzando un'ontologia genetica o un software di analisi GO come fun-brich.

In Analisi dell'arricchimento, fai clic su Aggiungi set di dati e carica i numeri di accesso GenBank o gli ID UniProt dei candidati, quindi seleziona il tipo di grafico per visualizzare l'analisi GO. I risultati dell'analisi GO sono visualizzati sotto forma di grafici a torta che forniscono informazioni sulle proteine candidate nelle aree del processo biologico, della componente cellulare e della funzione molecolare. Il passo successivo consiste nell'identificare i termini GO statisticamente sovrarappresentati tramite l'analisi DAVID.

Fare clic sullo strumento di annotazione funzionale, immettere l'elenco dei candidati e selezionare l'identificatore del gene, ad esempio l'ID UniProt.Selezionare l'elenco dei geni e cercare. Al termine della ricerca, fare clic sulla pagina dei risultati del riepilogo delle annotazioni nella categoria dell'ontologia genica per visualizzare i termini GO arricchiti, i valori p e altri parametri. Infine, studia le potenziali interazioni proteina-proteina e le possibili vie biochimiche utilizzando il database STRING liberamente accessibile.

Inserisci l'ID della proteina o la sequenza nella casella di ricerca designata e seleziona la specie corretta per l'analisi. Fai clic su Cerca. I risultati forniranno informazioni sulle associazioni dirette e indirette.

Le prime 10 corrispondenze note per il candidato esosomiale visualizzate nei risultati dovrebbero essere prese in considerazione per una selezione significativa dei candidati. Vengono mostrati i risultati rappresentativi di un'analisi DAVID di un insieme di 14 proteine. L'arricchimento del processo biologico ha indicato che i processi correlati alla morte cellulare sono significativamente arricchiti.

L'arricchimento della componente cellulare mostra molte proteine con un'origine intracellulare e l'arricchimento della funzione molecolare ha identificato un ruolo nel legame proteico per la maggior parte dei candidati. La catena B della L-lattato deidrogenasi o LDHB è stata selezionata come il candidato più significativo e l'analisi STRING ha identificato i primi 10 partner interagenti di LDHB. La maggior parte dei partner LDHB era anche funzionalmente e localizzativamente correlata agli esosomi nell'HIV-1.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in una settimana se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di eseguire ogni passaggio alla giusta temperatura e condizione. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'isolamento di affinità per confermare le previsioni dell'analisi bioinformatica.

Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada a ricerche in campo esosomiale per esplorare i cambiamenti nel proteoma esosomiale associati alle infezioni da HIV-1 in biologia. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come isolare l'esosoma dalla coltura cellulare, analizzare i loro proteomi e indagare la loro associazione con l'HIV. Non dimenticare che lavorare con l'HIV o altri agenti infettivi può essere estremamente pericoloso e precauzioni come indossare dispositivi di protezione individuale devono essere sempre prese durante l'esecuzione di questa procedura.