Un metodo per estrarre pigmenti da Squid Pealeii Doryteuthis

L'obiettivo generale di questa procedura è descrivere come estrarre i pigmenti situati all'interno dei granuli nanostrutturati di calamari appena sezionati, cromatofori Doryteuthis pealeii. I cefalopodi sono animali marini complessi che subiscono cambiamenti rapidi e adattativi del loro colore dermico. e cambiamenti adattativi al loro colore dermico.

Tuttavia, c'è ancora molto che non si sa su come funzionano questi sistemi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che si rivolge specificamente ai granuli nanostrutturati nell'organo cromatoforo. Ciò consentirà ai ricercatori di chiarire il meccanismo del cambiamento di colore che ha origine su scala nanometrica.

Oltre a comprendere la biologia dei cefalopodi, può informare la progettazione di sistemi sintetici costruiti per imitare la gamma dinamica del colore adattivo visualizzato nei cefalopodi utilizzando nanoparticelle pigmentate preconfezionate. In generale, le persone che non conoscono questo metodo hanno difficoltà perché la raccolta di tessuto cromatoforo puro è difficile a causa della sua vicinanza con il tessuto circostante. Il nostro metodo è ottimizzato per ridurre questi contaminanti.

Per iniziare la dissezione, versare prima circa 250 millilitri di acqua di mare filtrata in una vaschetta di dissezione. Posizionare un esemplare nella padella e utilizzando forbici dritte a punta fine in acciaio inossidabile, tagliare dalla base del mantello ventrale lungo il lato posteriore dell'animale, terminando nella regione delle pinne. Rimuovere tutti gli organi interni sollevandoli delicatamente con una pinza da dissezione e recidendo il tessuto connettivo con le forbici.

Gettare gli organi in un sacchetto per campioni. Utilizzando i perni a T di dissezione, fissare la pinna del mantello con il lato rivolto verso l'alto nel tampone di dissezione. Con una pinza, rimuovere con cura lo strato cutaneo epidermico opaco, mantenendo intatto lo strato cutaneo contenente cromatoforo.

Gettare lo strato epidermico in un sacchetto per campioni. Quindi, rimuovere lo strato del cromatoforo. Tagliare il tessuto cromatoforo in piccole sezioni di un centimetro per un centimetro.

Posizionare le sezioni in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri, riempiendo ciascuna provetta a metà con tessuto sezionato. Infine, aggiungere 500 microlitri di acqua di mare filtrata ai tubi. Per isolare i granuli di pigmento, centrifugare prima le sezioni di tessuto cromatoforo per cinque minuti a 14.000 x g.

Scartare lo strato superiore di acqua di mare. Aggiungere 500 microlitri di soluzione di papaina collagenasi ai campioni e agitare per uno o due minuti alla massima impostazione. Quindi, sonicare i campioni per cinque minuti a 40 kHz per dissociare le cellule dal tessuto circostante.

Centrifugare per altri cinque minuti a 14.000 x g e poi scartare il surnatante. Ripetere la centrifugazione altre due volte, scartando ogni volta il surnatante. Quindi, aggiungere la risospensione in collagenasi.

Utilizzare una pinza per rimuovere manualmente eventuali sezioni di tessuto di grandi dimensioni rimanenti che non sono state digerite prima di procedere. La purezza della soluzione granulare iniziale influenza l'estrazione del pigmento. È quindi importante assicurarsi che i materiali del cromatoforo di partenza siano completamente digeriti.

Troviamo che le sezioni di tessuto di circa un centimetro sono ottimali per raccogliere la popolazione più pura di granuli. Preparare il tampone di omogeneizzazione prendendo una provetta con tappo a vite da 150 millilitri e aggiungendo la quantità appropriata di HEPES, cloruro di magnesio, aspartato di potassio e ditiotreitolo. Aggiungere una mini compressa commerciale di inibitore della proteasi.

Utilizzando un cilindro graduato, misurare 100ml di acqua deionizzata e aggiungerla al tubo contenente i sali di omogeneizzazione. Agitare il tubo per mescolare fino a quando la soluzione diventa limpida. Centrifugare i campioni di tessuto e quindi scartare il surnatante.

Aggiungere 500 microlitri di tampone di omogeneizzazione a ciascuna provetta e agitare per 2 minuti per miscelare accuratamente. Sonicare i campioni per 30 minuti a 40kHz. E poi centrifugarli di nuovo.

Dopo aver scartato il surnatante, ripetere l'aggiunta di omogeneizzazione, la sonicazione e la centrifugazione due o tre volte per garantire la completa digestione del tessuto extracellulare. Infine, il tubo dovrebbe contenere un surnatante giallo chiaro e un pellet di colore rosso costituito dai granuli di pigmento isolati. Scartare il surnatante.

Innanzitutto, preparare il metanolo acido per l'estrazione in un campione di vetro con tappo a vite aggiungendo 5 ml di metanolo e 25 ml di acido cloridrico concentrato. Agitare delicatamente la soluzione per mescolare. Metti da parte una provetta per campioni, questo sarà il trattamento dei granuli reagiti alla fine.

Rimuovere il tampone di omogeneizzazione da una seconda provetta contenente granuli. Aggiungere 500 mcL della soluzione acida di metanolo alle provette rimanenti e agitare per tre o quattro minuti. Sonicare i campioni per 10 minuti a 40kHz e poi centrifugare per cinque minuti a 14000 x g.

Utilizzando una micropipetta, raccogliere il surnatante in un flaconcino di vetro da un dram con tappo a vite. Questo è il pigmento e dovrebbe apparire di colore rosso scuro. Ripetere le fasi di aggiunta, sonicazione e centrifugazione del metanolo acido quattro o cinque volte raccogliendo il surnatante fino a quando non viene estratto più colore.

Il pellet incolore rimanente è il pigmento estratto dai granuli. Per preparare i campioni di granuli per l'imaging, centrifugare prima sia l'aliquota del granulo non reagito che i granuli estratti dal pigmento per cinque minuti a 14000 x g, scartare il surnatante, quindi risospendere ogni pellet in 1 ml di etanolo al 95%. Utilizzando una pipetta di trasferimento, posizionare 2-3 gocce di ciascuna sospensione di granuli su un tronchetto SEM di alluminio separato.

Mettere i campioni nell'essiccatore ad asciugare per una notte sotto vuoto. Rivestire i mozziconi con un rivestimento in oro platino per 3 minuti per ottenere un rivestimento a 15 nanometri. Visualizzare i campioni utilizzando un microscopio elettronico a scansione.

Successivamente, utilizzare uno spettrofotometro per raccogliere i profili di assorbanza per i granuli non reagiti, i granuli estratti e il pigmento estratto. Effettuare una misurazione in bianco per i campioni di granuli aggiungendo 1 ml di acqua deionizzata a una cuvetta pulita. Gettare il grezzo in un contenitore per rifiuti.

Quindi, aggiungere alla cuvetta la sospensione contenente i granuli di pigmento non reagiti. Raccogliere gli spettri di assorbimento UV-vis per il campione di granuli. Effettuare una seconda misurazione in bianco per il pigmento estratto utilizzando 1 ml di metanolo acido e una cuvetta pulita.

Infine, prendere lo spettro assorbente UV-vis per il pigmento e quindi determinare la lunghezza d'onda massima di ciascun campione. La microscopia elettronica a scansione ha rivelato che il processo di estrazione del pigmento riduce il diametro medio dei granuli. Prima dell'estrazione, i granuli hanno un diametro medio di 527,3 nm.

Dopo la procedura di metanolo acido, questa dimensione diminuisce significativamente a circa 202,6 nm. Una riduzione che si pensa sia dovuta all'estrazione del pigmento. Con l'aggiunta del metanolo acido, anche il colore associato ai granuli non reagiti si riduce visibilmente.

La conferma di questa ipotesi è stata ottenuta utilizzando la spettrofotometria. Questo grafico mostra un ampio profilo di assorbanza per i granuli pre-estratti e un profilo altrettanto ampio ma di intensità inferiore per i granuli post-estratti. Al contrario, il pigmento estratto solubile mostra un lambda max a circa 500 nm e una spalla distinta a circa 380 nm.

Collettivamente, questi dati suggeriscono il successo dell'estrazione del colore visibile dai granuli. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa quattro ore dall'inizio alla fine. Durante il tentativo di questa procedura è importante ricordare di rimuovere completamente il tessuto che contiene le piastrine proteiche riflettenti che possono interferire con l'estrazione e l'analisi.

Il tessuto epidermico può anche interferire con le fasi di omogeneizzazione e l'estrazione del pigmento. Seguendo questa procedura, è possibile utilizzare altri metodi come la cromatografia su strato sottile e la spettrometria di massa per purificare ulteriormente i pigmenti e caratterizzarne la composizione. Questi passaggi possono aiutare a chiarire i contributi molecolari alla colorazione nei cefalopodi.

Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave per biologi marini, chimici e ingegneri, tra cui:Qual è la composizione dei pigmenti utilizzati durante il cambio di colore? E in che modo contribuiscono alla funzione e alla struttura dei granuli nanostrutturati all'interno degli organi cromatofori dermici? Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di come estrarre il pigmento dai calamari appena sezionati, i cromatofori doryteuthis pealeii.