Costruire modelli ad elementi finiti per Indagare Zebrafish Jaw Biomeccanica

L'obiettivo generale di questa tecnica di modellazione è quello di simulare l'ambiente meccanico sperimentato dallo sviluppo delle mascelle di zebrafish. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo muscolo-scheletrico, come ad esempio: come cambiano i modelli di carico meccanico nel tempo? E in che modo questi carichi stimolano il comportamento cellulare.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che ci permette di analizzare i modelli di espressione genica e i cambiamenti nel comportamento cellulare nel contesto dell'ambiente meccanico. Questo metodo può fornire informazioni sullo sviluppo scheletrico. Può anche essere applicato a qualsiasi altra struttura biologica che subisce un carico meccanico, come gli elementi scheletrici nei vertebrati superiori o il sistema cardiovascolare.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo possono avere difficoltà, perché la terminologia e il software presuppongono un background in ingegneria. Per visualizzare la forma degli elementi scheletrici, quantificare i muscoli e identificare l'esatta posizione degli attacchi muscolari, immunocolorare il pesce all'età appropriata per la miosina scheletrica e il collagene di tipo II. Per prima cosa, fissare una larva di pesce in paraformaldeide al 4% e PBS per un'ora.

Quindi, lavare via il fissativo con due lavaggi PBT. Successivamente, disidratare la larva in metanolo al 50% e PBT per cinque minuti, seguito da metanolo al 100% per cinque minuti. Le larve possono quindi essere conservate al 100% di metanolo fino al momento del bisogno.

Quando necessario, reidratare la larva in metanolo al 50% e PBT per cinque minuti. Quindi, lavalo in PBT per cinque minuti. Ora, permeabilizzare la larva con lo 0,25% di tripsina e PBT su ghiaccio per cinque o sei minuti.

Quindi, lavalo in PBT per cinque minuti e ripeti il lavaggio PBT altre tre volte. Prima di applicare gli anticorpi, bloccare la larva per due o tre ore in siero al 5% e PBT. Quindi, incubare la larva nella diluizione raccomandata di collagene di coniglio anti-tipo II e anticorpi anti-miosina di topo con il 5% di siero e PBT.

Eseguire questa incubazione per un'ora a temperatura ambiente o durante la notte a quattro gradi Celsius. Dopo aver applicato gli anticorpi primari, lavare la larva in PBT per un totale di sei volte per 15 minuti per lavaggio. Dopo i lavaggi con PBT, applicare un siero al 5% e un blocco di PBT per una o due ore.

Ora, applicare gli anticorpi secondari, mantenendo d'ora in poi il preparato al buio il più possibile. Utilizzare anticorpi secondari anti-topo e anti-coniglio marcati in fluorescenza nel siero al 5% e PBT. Dopo aver applicato gli anticorpi secondari, lavare la larva in PBT sei volte per 10 minuti per lavaggio.

Qualsiasi larva colorata come descritto, o che esprime tag fluorescenti, può ora essere ripresa utilizzando un microscopio confocale come segue. Scatta una pila di immagini confocali della regione di interesse utilizzando l'obiettivo 10x con zoom digitale di circa 2,5x. Eccita il canale verde e rosso utilizzando un laser a 488 nanometri e un laser a 561 nanometri.

Quindi, scatta immagini da 512 pixel quadrati utilizzando un intervallo del piano z di 1,3 micron con tre medie lineari. Circa 100 sezioni z riempiranno la pila. Esporta i dati come stack di immagini TIFF.

Aprire la pila di immagini TIFF e visualizzare tutti i canali nel software appropriato. Fare clic con il pulsante destro del mouse sul canale della cartilagine, selezionare l'ortoscopia e creare. Quindi, fare clic con il pulsante destro del mouse sul canale della cartilagine e selezionare Elaborazione immagine, levigatura e riduzione del rumore, selezionare il filtro immagine e attivare o disattivare la levigatura gaussiana.

Nella vista del progetto, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine filtrata e selezionare la segmentazione dell'immagine, quindi modificare la nuova etichetta. Crea una nuova etichetta per ogni materiale, come la cartilagine e l'articolazione. Quindi, seleziona la regione della cartilagine dell'immagine utilizzando lo strumento bacchetta magica con l'interruttore Tutte le sezioni attivato e usa lo strumento pennello per rimuovere il rumore dai contorni.

Quindi, seleziona la regione del giunto con lo strumento pennello, assegnala al componente del giunto e ripeti l'azione in tutto il giunto. Per smussare più sezioni contemporaneamente, seleziona Segmentazione dal menu in alto e seleziona Smussa etichette. Quindi, per produrre un rendering 3D della superficie del componente, fare clic con il pulsante destro del mouse sull'immagine e selezionare Genera superficie.

Ora, fai clic sulla superficie renderizzata e salva i dati come file HMASCII per la meshing software. 3D la generazione della mesh è un passaggio fondamentale nella generazione di un buon modello. È necessario scendere a compromessi tra una mesh che rappresenti la vera forma della struttura che si sta cercando di modellare, senza includere così tanti dettagli da introdurre elementi problematici, come quelli con un angolo troppo piccolo o troppo grande.

Per generare la mesh, importare il modello 3D in un pacchetto software capace. Per generare una mesh bidimensionale della cartilagine e delle superfici articolari, utilizzare lo strumento contorno termoretraibile nel menu 2D. Scegli una dimensione dell'elemento compresa tra 1,5 e 2,5.

È possibile realizzare una gamma di mesh di superficie di diverse dimensioni per eseguire l'ottimizzazione della mesh 3D. Al fine di garantire che la mesh sia continua tra l'articolazione e le superfici della cartilagine, tutti gli elementi sul confine devono condividere nodi comuni. Per ottenere ciò, rimuovere la superficie interna del giunto, lasciando un tubo cavo.

Utilizzare il tasto funzione F2 per accedere alla scorciatoia per il menu Elimina elementi. Seleziona gli elementi da eliminare. Regolare i nodi di delimitazione in modo che corrispondano alla superficie della cartilagine.

Utilizzare una combinazione di tasti funzione F2, F3 e F6 rispettivamente per eliminare, spostare i nodi e creare nuovi elementi. Infine, duplicare la superficie della cartilagine in corrispondenza dell'articolazione utilizzando il menu Organizza componenti del collettore. Utilizzare il tasto funzione F2 per eliminare tutti gli elementi non giunti.

Successivamente, esegui i controlli di qualità accedendo al pannello Controlla elementi. Verificare la presenza di elementi, inserimenti e penetrazioni duplicati nella mesh. Se trovati, modificali utilizzando la scheda Strumenti.

Verificate la presenza di angoli diedro utilizzando la scheda di utilità disponibile nell'opzione dell'albero del modello. Per generare una mesh 3D dalle mesh di superficie 2D di elementi di diverse dimensioni, utilizzare lo strumento Tetramesh. Confronta mesh di diverse dimensioni e seleziona il modello EF con la dimensione mesh più bassa che converge dopo ulteriori simulazioni e non compromette la definizione delle funzionalità.

Quindi, utilizzando lo strumento Distanza, trasforma la mesh in modo che il modello della mascella sia in scala. Assicurarsi che i componenti della cartilagine e dell'articolazione siano collegati nel modello esportando un modello unito o utilizzando le fascette. Successivamente, applica carichi, vincoli e proprietà del materiale al modello EF per simulare la funzione della mascella.

Usando le pile confocali etichettate come guida, definisci i muscoli. Innanzitutto, assegna i nodi che corrispondono ai punti di attacco muscolare. Quindi, crea vettori tra i nodi che rappresentano l'origine e l'inserzione di ciascun muscolo.

Dopo che tutti i muscoli sono stati definiti, creare un raccoglitore di carico storico e applicare un Cload a ciascun muscolo. Specificare la magnitudine in newton e assegnare il vettore associato. Quindi, assegnare le proprietà del materiale isotropo elastico appropriato, come determinato dalla letteratura.

Quindi, create un raccoglitore di carico limite e applicate alcuni vincoli iniziali al modello. Scegliete i nodi da vincolare e selezionate un fattore di gradi di libertà simile all'intervallo di movimento naturale per il muscolo definito da tali nodi. A questo punto, creare una fase di carico per ogni tipo di movimento da simulare.

Nel menu di analisi, selezionare tutti i carichi e i vincoli rilevanti per simulare il movimento specificato. Quindi, seleziona statico dal menu a discesa. Quando si è pronti, esportare il modello in un formato di file appropriato, inclusi la mesh, i carichi, i vincoli e le proprietà del materiale.

In questo caso, viene scelto il formato INP. Quindi, caricare il modello nel software di analisi FE. In questo caso, creare ed eseguire un lavoro per il modello e analizzare l'output per sollecitazione, deformazione, spostamento e così via.

Seleziona da tre a sei larve di pesce zebra transgenico e anestetizza leggermente le larve con lo 0,02% di MS-222 fino a quando non smettono di rispondere al tatto, ma i loro cuori continuano a battere. Quindi, montare le larve lateralmente su vetrini coprioggetti in agarosio tiepido all'1% a basso punto di fusione nella soluzione di Danieau. Quindi, rimuovere con cura l'agarosio intorno alla testa e alla mascella con una pinza.

Quindi, usando una pipetta Pasteur, sciacquare la soluzione fresca di Danieleau sulla testa della larva per rimuovere l'anestetico. Fallo fino a quando non riprende il normale movimento della bocca. Ora, usa il software di acquisizione video per girare video fluorescenti ad alta velocità dei movimenti della bocca.

Filmare alla massima frequenza di fotogrammi per tutto il tempo necessario a registrare più cicli di apertura delle ganasce. Successivamente, analizza lo spostamento massimo della mascella. Scegli le montature che mostrano la mascella più aperta e misura la distanza tra la punta anteriore della cartilagine di Meckel e la mascella superiore.

Il punto della mascella superiore corrisponde alla punta della placca etmoide. L'immunocolorazione per muscoli e cartilagine, o l'imaging di reporter transgenici, consente di visualizzare la struttura 3D della mascella, insieme alla muscolatura associata. Grazie all'imaging ad alta risoluzione, è stato possibile costruire un modello che cattura la forma tridimensionale della mascella.

Il modello incorpora carichi il cui posizionamento e la cui entità sono stati derivati dalle immagini confocali del muscolo e della cartilagine. Da questo modello sono state testate una serie di diverse proprietà dei materiali. Utilizzando lo spostamento in vivo visto attraverso l'acquisizione di video ad alta velocità, è stato selezionato un modello che replica al meglio tale gamma di movimento.

Utilizzando le proprietà dei materiali, i carichi e i dati più accurati sulla forma della mesh, il modello FE è stato utilizzato per esplorare la migliore stima dell'ambiente meccanico sperimentato durante questo lasso di tempo. Ad esempio, sono state misurate le entità dello stress. Il modello può essere ingrandito per vedere i dettagli fini del modello e quindi guardato in sezioni digitali per osservare i dettagli in tutte le dimensioni.

Dopo aver visto questo video, avrai una buona comprensione di come utilizzare l'imaging confocale per costruire un modello 3D fisiologicamente accurato di una struttura biologica sottoposta a carico meccanico. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che si tratta di un modello lineare ed elastico e che la cartilagine non si comporta interamente come un materiale lineare. Altre proprietà del materiale, come la permeabilità, possono essere incorporate, ma possono richiedere ulteriori modifiche alla rete.