Visualizzare il Tissue interrenale Steroidogenic e la sua Vascolare Microenvironment in Zebrafish

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di rilevare cellule steroidogeniche interrenali differenziate nel pesce zebra in via di sviluppo attraverso un semplice saggio di attività enzimatica a montatura intera. Questa procedura di colorazione può aiutare a rispondere a domande chiave riguardanti i meccanismi molecolari e cellulari della formazione e della malformazione delle ghiandole interrenali. Il vantaggio principale di questo test di colorazione è che è rapido, semplice e affidabile, il che lo rende uno strumento potente per gli screening genetici o chimici nel pesce zebra.

Questa procedura può essere eseguita su linee reporter fluorescenti transgeniche, marcando il rene e i vasi sanguigni in modo da poter analizzare più tessuti nello stesso embrione. In combinazione con il sezionamento del vibratomo, l'immunoistochimica e la microscopia confocale, è possibile visualizzare anche il microambiente vascolare del tessuto interrenale. Dopo aver preparato le soluzioni madre per la colorazione con attività di tre beta-Hsd secondo il protocollo di testo, posizionare gli embrioni di zebrafish in via di sviluppo in 0,03% PTU in acqua d'uovo per inibire la formazione di pigmenti.

Fissare embrioni dechorionati, o larve, in 2% o 4% di PFA in PBS con 0,1% di Tween 20, o PFAT. Con PBST, lavare gli embrioni quattro volte per 10 minuti ciascuna, assicurandosi che i campioni non si secchino tra un lavaggio e l'altro. Prima delle reazioni di colorazione, preparare nuovamente le parti A e B in provette separate, quindi agitare e centrifugare le soluzioni.

È essenziale preparare le parti A e B in tubi separati. L'aggiunta di tutti i componenti direttamente in un unico tubo causerà immediatamente forti precipitazioni. Aggiungere l'intero tubo della parte A all'intero tubo della parte B. Mescolare bene e distribuire immediatamente un millilitro in ogni tubo di microfuga contenente gli embrioni fissati e lavati.

Usa un foglio di alluminio per avvolgere i tubi e posizionali a temperatura ambiente su un rotatore o una piattaforma oscillante agitando delicatamente. Determinare empiricamente il tempo di reazione utilizzando un microscopio per monitorare i segnali cromogenici. Nel tempo si svilupperanno lievi precipitazioni che non interferiranno con il processo di reazione.

Arrestare la reazione utilizzando PBST per lavare gli embrioni quattro volte per 10 minuti ciascuno, quindi post-fissare gli embrioni colorati con il 4% di PFAT a temperatura ambiente per 60 minuti. Per la microscopia a montaggio intero, utilizzare il 50% di glicerolo in PBS per eliminare gli embrioni. Quindi, dopo averli orientati con il lato dorsale rivolto verso l'alto, osservare i campioni utilizzando un microscopio verticale in piena illuminazione.

De-yolk l'embrione e usalo per preparare una montatura piatta. Quindi, acquisire un'immagine ad alta risoluzione della morfologia del tessuto interrenale. Per analizzare il microambiente vascolare del tessuto steroidogenico, post-fissare gli embrioni colorati con PFA al 2%.

Integralo con l'1% di Triton X-100 a quattro gradi Celsius per un'ora e usa PBST-X per lavare gli embrioni a temperatura ambiente quattro volte per 10 minuti ciascuno. Per incorporare gli embrioni, preparare l'agarosio a basso punto di fusione al 4% sciogliendo l'agarosio in PBS a 95 gradi Celsius. Quindi, aliquotare in provette da microcentrifuga e conservare a una temperatura compresa tra quattro e otto gradi Celsius.

Sciogliere un'aliquota di agarosio a basso punto di fusione al 4% a 70 gradi Celsius per 10 minuti, quindi mantenere l'aliquota a 47 gradi Celsius. Utilizzando un tappo staccato da una provetta da microcentrifuga da 1,5% millilitro come stampo, incorporare un embrione nell'agarosio fuso e lasciarlo raffreddare fino a renderlo solido. Per eseguire il sezionamento del vibratomo, far aderire un pezzo di nastro adesivo di carta alla piattaforma asciutta del vibratomo.

Quindi, usa una lama di rasoio per rimuovere il blocco di agarosio indurito dallo stampo. Applicare la supercolla sul nastro di carta sulla piattaforma e fissare il blocco di agarosio sul nastro di carta con il lato anteriore del campione rivolto verso l'alto. Quindi, taglia il blocco di agarosio a forma di prisma trapezoidale con circa quattro-otto millimetri su ciascun lato rispettivamente delle sfaccettature superiore e inferiore.

Utilizzare un contagocce riempito con PBS freddo con Trident X-100 allo 0,5% per risciacquare il blocco di agarosio. Quindi, utilizzare un vibratomo secondo le istruzioni del produttore per preparare sezioni da 100 micrometri. Con un ago calibro 26, rimuovere le sezioni tagliate dal vibratomo e trasferirle su una piastra spot contenente 500 microlitri di PBST-X freddo allo 0,5% per pozzetto.

Raccogliere le tre sezioni di tessuto positive all'attività beta-Hsd controllandole al microscopio da dissezione e utilizzare la punta di una pipetta per trasferire le sezioni in una piastra a 96 pozzetti contenente 0,5% di PBST-X freddo. Macchiare e visualizzare ulteriormente le sezioni secondo il protocollo di testo. Per determinare in che modo il tessuto interrenale steroidogenico si sviluppa in modo co-performante con il glomerulo renale pronefrico e la sua vascolarizzazione nascente, il test di attività enzimatica a tre beta-Hsd è stato eseguito su un embrione di zebrafish transgenico doppio, che esprime sia la fluorescenza specifica del rene che quella endoteliale.

Come mostrato qui, tre tessuti steroidogenici beta-Hsd positivi si trovano a destra della linea mediana e si avvicinano immediatamente al glomerulo renale pronefrico. Alcune cellule steroidogeniche iniziano anche a migrare attraverso la linea mediana. Queste sezioni di vibratomo provenienti da embrioni transgenici che esprimono GFP endoteliale sottoposti al test delle tre beta-Hsd sono state analizzate mediante immunoistochimica per rilevare la fibronectina e il suo effettore a valle, la chinasi di adesione focale fosforilata.

La deposizione di fibronectina nell'aorta peridorsale è essenziale per sostenere la crescita dei vasi interrenali. Per l'embrione o la larva di pesce, la colorazione istochimica dell'intera montatura può essere eseguita entro un giorno se eseguita correttamente. Sebbene questo metodo di colorazione sia semplice e rapido, è importante ricordare che rileva un solo enzima della via steroidogenica.

Se si mira ad un'analisi dello sviluppo del tessuto interrenale, oltre a questo saggio, dovrà essere eseguita l'abitazione in situ per rilevare l'espressione di altri geni critici coinvolti nella steroidogenesi.