Sviluppo e identificazione di una sottopopolazione romanzo di Human neutrofili di derivazione fagociti Giant In Vitro

Gli obiettivi generali di questo metodo sono la generazione e l'identificazione di fagociti giganti in vitro derivati da neutrofili umani circolanti per lo studio del loro ruolo nelle risposte immunitarie infiammatorie e antinfiammatorie. Questo metodo può essere utilizzato per ottenere e identificare una nuova sottopopolazione di fagociti giganti che si sviluppano da neutrofili umani per mantenere condizioni di coltura a lungo termine. Questa tecnica può essere utilizzata per indagare ulteriormente il significato e le funzioni dei fagociti giganti, nonché per rispondere a domande chiave sulla loro attivazione e plasticità.

A dimostrare la procedura saranno Eva Leder, la nostra assistente di ricerca, e Oksana Rogovoy, post-doc, entrambe del mio laboratorio. Utilizzare un set sterile per vene del cuoio capelluto per ottenere almeno 40 millilitri di sangue venoso da un giovane volontario sano. Quindi mescolare delicatamente il sangue in una cappa a flusso laminare di biosicurezza.

Diluire da 10 a 12 millilitri di aliquote di sangue intero fino a un volume finale di 24 millilitri con PBS preriscaldato privo di ioni contenente il 2% di FCS inattivato dal calore. Quindi aggiungere il 12% di millilitri di polisaccarosio 1119 sul fondo di una provetta da centrifuga conica sterile in polipropilene da 50 millilitri per aliquota del campione di sangue, seguita dall'attenta stratificazione di 12 millilitri di polisaccarosio 1077 sopra la soluzione a gradiente di polisaccarosio 1119. Pipettare con cura 24 millilitri di sangue diluito su singole provette delle soluzioni a gradiente di densità e separare le cellule mediante centrifugazione.

Si devono osservare due strati opachi risultanti. Scartare il fluido fino a 0,5 centimetri sopra lo strato di celle mononucleate in ciascuna provetta. Quindi trasferire le cellule mononucleate da ciascun campione in un'unica nuova provetta.

Successivamente, scartare il fluido rimanente fino a 0,5 centimetri sopra la cella polimorfonucleata o lo strato PMN e trasferire i PMN da ciascun campione in una nuova provetta diversa. Lavare i PMN in un volume finale di 30 millilitri di PBS contenente il 2% di FCS inattivato dal calore seguito da lisi dei globuli rossi con tre millilitri di cloruro di sodio ipotonico allo 0,2% sterile ghiacciato e ghiacciato. Dopo 30 secondi sul ghiaccio, ripristinare l'isotonicità con tre millilitri di cloruro di sodio all'1,6% sterile ghiacciato.

Quindi aggiungere sei millilitri di 37 gradi Celsius RPMI 1640 Medium integrato con FCS inattivato al calore e raccogliere le celle mediante centrifugazione. Risospendere il pellet in quattro millilitri di RPMI 1640 integrato con il 10% di FCS inattivato a caldo. Dopo il conteggio, regolare la concentrazione da 1,25 a 1,5 volte da 10 al sesto PMN per millilitro di terreno di coltura e concentrare un millilitro di cellule per pozzetto in pozzetti individuali di una piastra da 24 pozzetti.

Quindi posizionare la piastra in un incubatore umidificato al 5% di anidride carbonica a 37 gradi Celsius, alimentando le colture sostituendo delicatamente metà del terreno con RPMI 1640 Medium fresco integrato con FCS inattivato al calore al 10% ogni tre giorni. I neutrofili si differenzieranno in fagociti giganti entro sette giorni dalla coltura. Il settimo giorno di coltura, rimuovi con cura metà del terreno da ogni pozzo.

Quindi pipettare con forza il terreno rimanente per rimuovere i fagociti giganti leggermente aderiti. Trasferire le cellule staccate da due a quattro pozzetti di ciascun gruppo di trattamento in singole provette coniche da 15 millimetri e raccogliere le cellule per centrifugazione, risospendendo i pellet in 100-120 microlitri di terreno per provetta. Quindi equipaggiare due o tre supporti per gruppo di trattamento con vetrini da microscopio, schede filtranti e imbuti.

Quindi, aggiungere l'intero volume di cellule di ciascuna provetta nell'imbuto Cytospin appropriato. Quindi caricare i supporti su un Cytospin e far girare le cellule sui vetrini. Asciugare i vetrini centrifugati per 10 minuti.

Quindi utilizzare un pennarello stabile all'acqua per disegnare una barriera idrofobica attorno alle cellule e fissare i campioni con il 4% di paraformaldeide sotto una cappa chimica a temperatura ambiente. Dopo 10 minuti, sciacquare brevemente i vetrini tre volte con circa 100 microlitri di PBS per lavaggio. Quindi permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,5% in PBS per 10 minuti a temperatura ambiente, seguiti da cinque lavaggi PBS come appena dimostrato.

Bloccare il legame aspecifico con il 10% di siero di capra normale in RPMI 1640 Medium per il periodo di tempo appropriato, seguito da un singolo lavaggio PBS. Ora, aggiungi una piccola quantità di acqua alla scatola per mantenere l'umidità e poi etichetta le cellule con circa 100 microlitri dell'anticorpo primario appropriato di interesse durante la notte a quattro gradi Celsius in una camera buia umidificata. Successivamente, eseguire un singolo lavaggio PBS e quindi aggiungere l'anticorpo secondario coniugato a fluorescenza appropriato.

Dopo 40 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce, lavare i campioni per rimuovere l'anticorpo in eccesso e montare i vetrini con una goccia di terreno di montaggio per campione e un vetrino coprioggetti. Analizza i vetrini mediante microscopia a fluorescenza a scansione laser confocale entro 30-120 minuti con un obiettivo a olio di emersione 40X. Quindi calcola l'area cellulare, l'intensità della fluorescenza e la co-localizzazione utilizzando il software appropriato.

In queste immagini si può osservare lo sviluppo dei neutrofili in fagociti giganti entro sette giorni dalla coltura. L'autofagocitosi è evidente già 90 minuti dopo la coltura dei neutrofili, con colorazioni fluorescenti della membrana con un diametro cellulare notevolmente ingrandito, evidenti dal quarto al settimo giorno. Tuttavia, se le colture di neutrofili sono integrate con GM-CSF e IL-4, le cellule dimostrano un diametro complessivamente più piccolo e proiezioni citoplasmatiche simili a cellule dendritiche.

La microscopia time lapse dei fagociti giganti nei giorni da tre a quattro e nei giorni da quattro a cinque rivela cellule assenti o leggermente aderenti con una capacità di movimento limitata che ingeriscono attivamente i resti e i detriti di neutrofili circostanti. In questa coltura di neutrofili monocitivi misti, la migrazione di un macrofago che striscia attivamente può essere paragonata al movimento quasi stazionario di un fagocita gigante marcato in fluorescenza nello stesso pozzetto di coltura. L'origine neutrofila dei fagociti giganti può essere verificata dalla loro espressione positiva di marcatori di assenza di neutrofili e dalla loro mancanza di espressione di marcatori di cellule monocitiche e dendritiche.

I fagociti giganti generano anche specie basali reattive dell'ossigeno e rispondono alla stimolazione di zimosani e PMA mediante burst ossidativo. Tuttavia, a differenza dei monociti o dei neutrofili, rispondono anche con esplosioni ossidative alla stimolazione ossidata delle lipoproteine a bassa densità. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei o sette giorni.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di sostituire delicatamente metà del terreno quando si alimentano le colture di neutrofili. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altre tecniche di colorazione per rispondere a domande sulle funzioni aggiuntive di queste intriganti cellule sia in vitro che in vivo. Questa tecnica potrebbe aprire la strada ai ricercatori nel campo della biologia dei neutrofili per esplorare l'attivazione e la plasticità dei neutrofili e per identificare queste cellule in vivo in condizioni fisiologiche e fisiopatologiche nell'uomo.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come ottenere e identificare i fagociti giganti in coltura. Non dimenticare che lavorare con il sangue umano può essere potenzialmente infettivo e che precauzioni come indossare guanti e scartare tutti i liquidi e utilizzare attrezzature monouso negli appositi contenitori a rischio biologico sono un must quando si esegue questa procedura.