Name: Transient Medio occlusione dellarteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-21T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 56 s
Description: Impara l'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei ratti neonati P10 per studiare l'ictus neonatale. Questo modello chirurgico riproducibile consente di esplorare i meccanismi di lesione ischemica e le strategie terapeutiche nel cervello in sviluppo.

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Il finanziamento è stato fornito dalle sovvenzioni NIH K08 NS064094 e UCSF REAC. Gli autori ringraziano Nikita Derguin, Zinalda Vexler e Joel Faustino per la loro assistenza nello sviluppo di questa tecnica.

Tutta la ricerca animale è stato approvato dalla University of California, San Francisco il Comitato Animal Research ed è stata effettuata in conformità con la Guida per la cura e l&#39;uso di animali da laboratorio (Dipartimento di Salute e Servizi Umani, Pubblicazione No. 85-23, 1985 ). Gli animali sono stati attentamente monitorati dai veterinari del Comitato Istituzionale UCSF cura degli animali ed uso (IACUC), accreditato dal AAALAC. Una femmina Sprague-Dawley con un 8 giorni di età lettiera (10 nidiate) è stato ottenuto. La madre e suoi cuccioli sono stati dati cibo e acqua ad libitum e alloggiati in una struttura di cura degli animali temperatura e luce controllata con l&#39;arricchimento al giorno, secondo il protocollo IACUC, fino a quando i cuccioli sono stati 10 giorni di vita. Tutti gli strumenti chirurgici utilizzati in questa procedura sono stati sterilizzati in autoclave per garantire la sterilità. La sterilità delle punte strumento viene mantenuto per tutto l&#39;intervento chirurgico. 1. occlusione dell&#39;arteria cerebrale media <ol><li> Pesare il cucciolo e assicue che è il peso corretto (19-21 g). Anestetizzare il cucciolo in 3% isoflurano in 100% O 2 e assicurarsi che non v&#39;è alcuna risposta ad una presa piede. Mantenere la temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C con l&#39;uso di una piastra elettrica sotto la fase chirurgica. </li><li> Fissare l&#39;animale in posizione supina con nastro attraverso le zone di spalla. Utilizzando tamponi di cotone sterile, tamponare la zona cervicale anteriore con soluzione di povidone-iodio seguito da un tampone di 70% di etanolo in acqua bidistillata, alternando ogni soluzione per quattro tamponi totali. </li><li> Localmente infiltrarsi bupivacaina 0,25% nel sito di incisione previsto. Utilizzando uno stereoscopio, fare una linea mediana 5 a 7 mm anteriormente incisione cervicale per esporre l&#39;arteria carotide comune (CCA). Mettere 2-4 divaricatori per mantenere la cavità aperta e l&#39;arteria esposto. </li><li> Individuare l&#39;arteria carotide interna (ICA), arteria occipitale (OA), e l&#39;arteria carotide esterna (ECA). Lo sposo le arterie per avere una visione chiara. essere autoeful non disturbare il nervo vago. NOTA: per cuccioli sham, l&#39;inicision viene lasciata aperta e le arterie sono esposti, dopo di che l&#39;incisione viene suturata chiuso. Il tempo totale anestesia è equivalente a quello della chirurgia occlusione. </li><li> Tagliare 1,5 cm di 6-0 seta filo intrecciato di sutura. Unbraid sutura, estraendo filamenti singoli. Assicurarsi che i singoli filamenti sono pulite e non sfilacciato. NOTA: Se necessario, smoothe le estremità sfilacciate immergendo il singolo filo in acqua sterile e governare il filamento con punte forcep. </li><li> Tenendo il filo di sutura con una pinza 45 gradi, spostare la pinza in un movimento ampio arco di passare sotto l&#39;ICA in modo che le punte forcep emergono tra ACI e OA. NOTA: Se la dissezione è fatto bene, questo passaggio sarà relativamente facile. Se l&#39;ICA e OA si toccano, fare attenzione a non rompere le arterie quando si utilizza la pinza per isolare l&#39;ICA. In caso di emorragia, applicare pressione dell&#39;arteria con la pinza finol&#39;emorragia si ferma. Assorbire il sangue con un tampone sterile. </li><li> Afferrare l&#39;estremità del filo di sutura che viene trattenuto dalle pinze e tirarlo in modo che alla fine è di facile accesso. Rilasciare il filo dalla pinza e sostenere le pinze da sotto l&#39;ICA, invertendo il moto al passo 1.5 (Figura 1A). </li><li> Legare una legatura temporaneo intorno ICA alla base, più vicino a dove si separa dal CCA. NOTA: È importante legare il nodo in modo che l&#39;estremità del filo che verrà tirato per rimuovere il nodo è sufficientemente lungo (maggiore di 1 mm, inferiore a 3 mm) di afferrare facilmente con una pinza, mentre assicurando che v&#39;è un quantità appropriata di filamento di sutura sull&#39;altro lato del nodo di svincolo. </li><li> rientrare con cura l&#39;ICA lateralmente e utilizzare una clip per fissare il filo di pelle in eccesso vicino alla regione ascellare sul lato opposto l&#39;incisione. Assicurarsi che questo filone retrattile è abbastanza tesa a fermare il flusso di sangue prima di procedere alla fase successiva, allaridurre al minimo il rischio di sanguinamento incontrollato. Si osservi che l&#39;arteria è piatto e pallido. NOTA: Non esagerare con retrazione, in quanto può causare una rottura parziale o totale del ICA. La retrazione può essere regolata prima rendendo l&#39;arteriotomia tirando il filo sul lato opposto alla clip. </li><li> Utilizzare 45 ° pinze per afferrare un altro filo di sutura unbraided e loop sotto e intorno al ICA, come al punto 1.5. Posizionare questo filone lateralmente alla retrazione filamento (Figura 1B). NOTA: questo passaggio può essere fatto anche prima del ritiro. Se sicuri della qualità di retrazione, questo nodo può essere molto vagamente legato prima del passaggio successivo. </li><li> Tagliare una metà arteriotomy 0,2 mm fra legature legati e non legati, che sbaglia più vicino alla legatura legato. NOTA: Il sangue rimanente nel arteria legato-off può svuotare attraverso l&#39;arteriotomia ma non deve superare i 5 microlitri. Se il sanguinamento persiste, estrarre delicatamente il filo di retrazione ad aumentare retrazione, con cura per unvuoto danneggiare l&#39;arteria dalla tensione eccessiva. </li><li> Utilizzando un righello metrico, misurare la sutura occlusione e tagliare la sutura con una tolleranza supplementare di 2-3 mm per la rimozione del occlusore durante la riperfusione. Tenere l&#39;occlusore con una pinza di 45 gradi e utilizzare pinze diritte per creare una curva alla lunghezza appropriata per raggiungere la MCA, segnando un punto di sosta per l&#39;avanzamento. NOTA: A 10 mm Lunghezza occlusione dalla punta fine silicone per la curva è utilizzata per P10 Sprague Dawley o Long Evans cuccioli di ratto in questo intervallo di peso. </li><li> Utilizzando 45 ° pinze, alimentare il nylon occlusione sutura siliconata nel arteriotomia e far avanzare la sutura alla curva che segna la distanza predeterminata al MCA (Figura 1C). Assicurarsi che il progresso si sente liscia; interrompere immediatamente l&#39;avanzamento se si avverte resistenza. Durante l&#39;avanzamento, mirare la sutura in una direzione che è parallela al CC / ECA, verso la testa. NOTA: se la sutura è dorsalmente avanzata, versocolonna vertebrale dell&#39;animale, si può incorrere in arteria pterigopalatino (PTA). In caso di resistenza dopo 3-5 mm di avanzamento, la sutura ha colpito la giunzione PTA. Back L&#39;occlusore fuori dell&#39;arteria fino a quando la testa di silicone è vicino al arteriotomia prima di regolare il senso di avanzamento. Non è necessario rimuovere completamente l&#39;occlusore dalla arteriotomia. </li><li> Fissare l&#39;occlusore legando una legatura temporanea, utilizzando il filo dal punto 1.10 (Figura 1D). </li><li> Rimuovere la clip divaricatore. Tagliare i fili di entrambe le legature temporanei in modo che il filamento del nodo che viene tirato per rimuovere il nodo è facile da afferrare con una pinza diritte ed è più lungo del filo che viene tirato per stringere il nodo. NOTA: I fili devono essere abbastanza breve in modo che non si aggrovigliano nella cavità dopo la chiusura. </li><li> Rimuovere i divaricatori e chiudere la cavità con 6-0 seta intrecciato per creare tre o quattro punti staccati. </li><li> Rimuovere il cucciolo daanestesia e posizionarlo su una piastra elettrica in aria ambiente. Monitorare il cucciolo fino a che non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e garantire che essa ha pienamente recuperato prima di tornare alla diga. Assicurarsi che il cucciolo mantiene una temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Durante occlusione, risonanza magnetica pesata in diffusione (DW-MRI) sotto anestesia con isoflurano può essere utilizzato per verificare l&#39;induzione appropriata di lesioni. La Figura 2 mostra danno ischemico in corso rilevato da DW-MRI durante tMCAO 9. NOTA: diffusione ponderato rotazione di imaging echo planare viene eseguita 10-15 minuti prima della riperfusione. L&#39;intero cervello è ripreso con seriali sezioni coronali 2 mm di spessore utilizzando le seguenti impostazioni della sequenza di impulsi: TR / TE = 5,000 / 60 ms, 4 medie, campo visivo = 35 mm, matrice di dati = 128x128, diffusione durata gradiente = 20 ms, separazione = 29.7 ms, ampiezza = 70mt / m, e b-factor = 1.045 s / mm 2.Gli animali che presentano una mancanza di coinvolgimento corticale o di danno ischemico atipici, come ad esempio nel tronco encefalico, sono esclusi. </li></ol> 2. riperfusione NOTA: occlusione viene eseguita per 3 ore a causare una quantità moderata-grave di lesioni che coinvolge il corpo striato e la corteccia. <ol><li> A circa 2 ore e 50 minuti dopo l&#39;occlusione della MCA, anestetizzare il cucciolo in 3% isoflurano in 100% O 2. Mantenere la temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C con l&#39;uso di una piastra elettrica sotto la fase chirurgica. </li><li> Rimuovere le suture interrotte dal punto 1.16 e individuare la giunzione, che è caratterizzato da due legature e la coda della sutura occlusione. NOTA: animali sham-operati sono indotti e rimangono sotto anestesia per un periodo di tempo equivalente agli animali occlusi. L&#39;incisione viene nuovamente aperto e suturato chiuso. Per gli animali sham-operati, procedere al punto 2.11. </li><li> attentamente untieil nodo più laterale precedentemente legato a passo 1.14 tirando il filo più lungo. NOTA: Se v&#39;è resistenza sciogliere il nodo, fermata per assicurare che la corretta filamento del nodo viene tirato. Se la resistenza continua, aumentare l&#39;ingrandimento per una migliore visualizzazione. Siate cauti quando svincolo, in quanto è possibile danneggiare l&#39;arteria durante questa fase. </li><li> Rimuovere il filo di sutura dalla cavità. </li><li> Esattamente 3 h dopo MCA occlusione, lentamente la sutura occlusione fuori dell&#39;arteria. Non ci sarà alcuna resistenza. NOTA: Nella maggior parte dei casi, non ci sarà alcun sanguinamento. Se si verifica una piccola quantità di sanguinamento, applicare pressione dell&#39;arteria nel sito arteriotomia. </li><li> Utilizzare pinze per applicare pressione al arteriotomia, come il passo successivo ripristina il flusso sanguigno ICA per riperfusione. </li><li> sciogliere il nodo con attenzione mediale utilizzando lo stesso metodo come nel passaggio 2.3. </li><li> Rimuovere il filo di sutura dal corpo e applicare un agente emostatico al arteriotomia per arrestare il sanguinamento. </li&gt; <li> Assicurarsi che l&#39;emorragia si è fermata. NOTA: Il ritorno della forma originale del arteria e di colore rosso conferma che il flusso di sangue ICA è stata restaurata. </li><li> Rimuovere i divaricatori e chiudere la cavità con tre o quattro punti staccati di seta 6-0 intrecciata. </li><li> Rimuovere il cucciolo dall&#39;anestesia e posizionarlo su una piastra elettrica in aria ambiente. Monitorare fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale e garantire il pieno recupero prima di tornare alla diga. Assicurarsi che il cucciolo mantiene una temperatura superficiale del corpo tra 35,5 ° C e 37 ° C. </li><li> Ispezionare i cuccioli al giorno per 5 giorni. Recprd il loro peso e controllare i siti di incisione a stretto contatto per un&#39;adeguata guarigione. Rimuovere i punti di sutura dopo 7-14 giorni. Lesioni post-tMCAO può essere ripreso con la risonanza magnetica, se lo si desidera 9. NOTA: Gli animali possono perdere fino a 1 g di peso il primo giorno, ma in genere recuperare il peso senza l&#39;intervento e di essere all&#39;interno di un simile pesointervallo t a controlli da giorni 4-5. Raramente, un cucciolo può perdere il peso eccessivo o hanno difficoltà di alimentazione, che richiede sonda gastrica nutre per 2-3 giorni. </li><li> A P21, pregiudizio può essere attendibilmente valutato con test comportamentali sensorimotorie, come rotarod o allevamento cilindro. Test cognitivi può essere effettuata già a 4-6 settimane di età utilizzando valutazioni, come il riconoscimento di oggetti romanzo o il labirinto di acqua Morris 13. </li><li> Eutanasia i ratti mediante iniezione intraperitoneale di Euthasol (50 mg / kg) per il raccolto cervello 11, 12. </li><li> Analisi istologica per valutare il volume lesioni o risposta agli interventi possono essere eseguite con violetto cresolo o colorazione H &amp; E (Figura 3) 10. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Passaggi critici all&#39;interno del protocollo In primo luogo, è importante mantenere normotermia decorrere dall&#39;inizio di anestesia fino al completo recupero, in quanto non vi sono effetti di entrambi ipotermia 17 e 18 ipertermia sulla progressione del danno cerebrale sia in animali immaturi e maturi conoscere. In secondo luogo, garantendo nel contempo l&#39;animale e ritraendo l&#39;incisione, posizionamento ottimale per monitorare la respirazione e per assicurare che la trachea è libero di compressione è essenziale. Terzo, evitare schiacciamenti o allungamento del nervo vago, poiché ciò può causare variazioni della frequenza cardiaca con stimolazione vagale. In quarto luogo, poiché retrazione dell&#39;ACI è necessario per controllare il sanguinamento durante l&#39;arteriotomia, occorre prestare attenzione al grado di tensione durante la retrazione per evitare di danneggiare l&#39;arteria. Se l&#39;arteria non strappare dalla retrazione, o se v&#39;è una scarsa un&#39;incisione arteriotomia, l&#39;animale deve essere escluso dall&#39;analisi a causa del rischiodi emorragia e poveri riperfusione. Modifiche e risoluzione di problemi Usando MRI come guida, la lunghezza sutura può essere ottimizzato per garantire che la punta di silicone occlude correttamente la MCA per creare l&#39;ischemia focale. Se la risonanza magnetica non è disponibile, i cuccioli possono essere eutanasia prima di riperfusione per la dissezione di visualizzare il posizionamento della sutura. Regolare la lunghezza della sutura come necessario. Il peso dei cuccioli altamente correlata con i requisiti di lunghezza occlusione sutura. Il tempo di occlusione può essere modificato per regolare il grado di gravità della lesione. Inoltre, la forma e la lunghezza sutura sono critici. Per P10 ratti Sprague-Dawley e Long Evans pesatura 19-21 g 10 mm è la lunghezza ottimale di inserimento nella nostra esperienza. Ulteriore inserimento della sutura occlusione può causare perforazione del MCA. Inoltre, la coerenza nella forma del filamento di occlusione in ogni chirurgia si tradurrà in una maggiore consistenza del pregiudizio pattern 19, 20. Per questo motivo, si consiglia di utilizzare suture professionalmente realizzati per questo scopo specifico. E &#39;anche importante notare che il modello pregiudizio può variare tra gli operatori a causa delle differenze apparentemente minute a tecnica. Limitazioni della tecnica L&#39;esecuzione di questa tecnica in un piccolo, lo sviluppo di roditore richiede esperienza significativa. Se eseguito correttamente, il chirurgo è in grado di causare un modello di lesioni molto coerente in tutti gli animali di diverse dimensioni e di raggiungere un tasso di sopravvivenza superiore al 95%. Inoltre, adeguati strumenti chirurgici sono essenziali. Gli strumenti chirurgici devono essere ben tenute a garantire che tutti i suggerimenti dello strumento si avvicinano in modo corretto. Importanza di questa tecnica rispetto ai metodi esistenti o alternativi Mentre ipossia-ischemia, o il modello di Rice-Vannucci 2 </sup&gt;, è più comunemente utilizzato per studiare danno ipossico-ischemico nel cervello in via di sviluppo, è importante notare che questo modello di tMCAO è distinto da HI a che non ci sia l&#39;ischemia focale transitoria senza ipossia globale, seguita da una fase di riperfusione quando il ostruzione viene rimosso e il flusso di sangue viene ripristinato. Ciò causa una lesione più costante e riproducibile ed è più clinicamente traslazionale provocando un modello infortunio simile a quello osservato negli ictus neonatale a termine. In questo modo lo studio dei tipi di lesione focali e risposte compensatorie nel tessuto illeso. Le future applicazioni Dopo aver imparato questa tecnica Questo modello è simile alla causa più comune di ictus nei neonati umani, un trombo occlusivo transitorio che si verifica durante il periodo perinatale 11, 21. L&#39;eziologia non è del tutto chiara ed è più probabile multifattoriale, ma si presume nella maggior parte dei casi to derivare da emboli passando dalla placenta 11. Inoltre, molti nati con ictus perinatale presunta spesso presenti con attività convulsiva entro o sottile esame neurologico focale Anomalie 22. Questo rende l&#39;utilizzo di un modello di lesioni traslazionale coerente per identificare i meccanismi di progressione lesioni e le possibili strategie terapeutiche cruciali.

Ictus durante il periodo neonatale è una causa importante di morte e disabilità, che si verificano in ben 1 a 2.300 nati vivi 1. Questo porta a sviluppo del sistema nervoso centrale alterata e aumentata morbilità a lungo termine, tra cui una maggiore incidenza di epilessia, paralisi cerebrale, ritardo mentale, e altri tipi di motore o disfunzione cognitiva. Gli effetti per tutta la vita di ictus precoce rendono modelli animali traslazionali essenziale per esaminare i meccanismi di danno e riparazione in questa popolazione, comprese le strategie per proteggere il cervello danneggiato o per migliorare la riparazione. Diversi modelli di ischemia sono stati utilizzati per studiare le lesioni cerebrali in animali adulti, e mentre la Rice-Vannucci (Modificata Levine) 2 procedura viene comunemente utilizzato per studiare danno ipossico-ischemico nel cervello in via di sviluppo, focale ischemia-riperfusione è un meccanismo distinto di lesioni provocando lesioni focali, con un nucleo ferito e Penumbra e tessuti remoto indenne. I modelli Koizumi 3 e 4 Longa stati sviluppati in ratti adulti per raggiungere transitoria occlusione dell&#39;arteria cerebrale media attraverso l&#39;arteria carotide comune (CCA) e l&#39;arteria carotide esterna (ECA), rispettivamente. In entrambi i modelli, la legatura permanente e cauterizzazione di rami dell&#39;arteria sono importanti per ridurre al minimo il sanguinamento e di snellire la procedura chirurgica, che provoca anche effetti negativi sulla capacità dell&#39;animale di alimentare e ad aumentare di peso dopo un trauma. Inoltre, ci sono distinti meccanismi di lesione nel cervello immaturo e modelli specifici di lesioni visti come risultato. Più di recente, ictus photothrombotic (metodo Rose-Bengal) 5 e permanente legatura MCA 6 sono stati utilizzati per studiare ictus neonatale e adulti. Sia ictus photothrombotic e MCA legatura creano variazioni permanenti del flusso sanguigno cerebrale che si traducono in una mancanza di reperfusionico. Riperfusione è un componente critico di sviluppo e nella progressione di lesioni focali, con maggiore eccitotossicità, formazione di radicali liberi, e la produzione di ossido nitrico che porta alla morte cellulare ritardata che coinvolge cascate di segnalazione che sono distinti dalla fase ischemica 7. Ipossia-ischemia coinvolge permanente legatura unilaterale carotide seguita da ipossia globale, che varia da causa di danno ipossico-ischemico nell&#39;uomo e non causa un pattern lesione focale costante, rendendo studio del nucleo danneggiato e penombra più impegnativo. Abbiamo precedentemente descritto un modello ictus ischemia-riperfusione non emorragica nel ratto immaturo utilizzando transitoria cerebrale media occlusione dell&#39;arteria (MCAO) 8, 9, 10. Questo è un metodo meno invasivo che accede e occlude il MCA attraverso l&#39;arteria carotide interna senza ligati permanenteo cauterizzazione. Questo fornisce un modello di lesione simile alla causa più comune di ictus nel periodo perinatale 11, 12. Questo modello di ischemia-riperfusione dei risultati lesioni danni al corpo striato ipsilaterale e la corteccia parieto-temporale. Questo modello di tMCAO permette anche il controllo sulla gravità delle lesioni variando la durata di occlusione. L&#39;esame delle vie di segnalazione e cambiamenti istologici nel nucleo ferito e penombra e nel tessuto ipsilaterale e controlaterale illeso possono ulteriormente chiarire i meccanismi di danno e riparazione del cervello immaturo. Questo studio dimostrerà questo importante modello di lesione per il cervello in via di sviluppo.

<table><tbody><tr><td>Isoflourane</td><td>Henry Schein</td><td>50033</td><td>anestetico, al 3%</td></tr><tr><td>Surgioscopio trinoculare</td><td>World Precision Instruments</td><td>PSMT5N</td><td></td></tr><tr><td>Cuscinetto riscaldante</td><td>Sunbeam</td><td>000731-500-000</td> Termometro IR <td>con impostazione da bassa a media</td></tr><tr><td></td><td>Extech Instruments</td><td>72-5270</td><td></td></tr><tr><td>Kit di retrazione per piccoli animali&nbsp;</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>18200-20</td><td></td></tr><tr><td>Forbici CermaCut</td><td>Strumenti per le scienze</td><td>14958-09</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5SF Pinze</td> Strumenti per <td>le scienze fini</td><td>112522-00</td><td>2x</td></tr><tr><td>Dumont #5/45 Pinze</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>11251-35</td><td>2x</td></tr><tr><td>B-2 Micro Clamp</td><td>Strumenti per le scienze fini</td><td>00398-02</td><td></td></tr><tr><td>Forcepts per l'applicazione del morsetto</td><td>Fine Strumenti di scienza</td><td>00072-14</td><td></td></tr><tr><td>Micro Vannas Forbici</td><td>Strumenti di scienza fine</td><td>15000-03</td><td>2mm tagliente Suture</td></tr> di <tr><td>occlusione</td><td>Doccol</td><td>602123PK10</td><td>701712PK5Re</td></tr><tr><td>Righello</td><td>Strumenti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>di scienza fine Agente emostatico&nbsp;</td><td>Avitene</td><td>DVL1010590</td><td></td></tr><tr><td>6-0 Perma-Hand Silk Reverse CuttingSuture</td><td></td><td>Ethicon 769G</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td>0,22 mL/kg</td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone Henry</td><td>Schein</td><td>100-9249</td><td></td></tr><tr><td>Nastro da laboratorio</td><td>VWR</td><td>89097-990</td><td></td></tr></tbody></table>

transient medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale modello di stroke neonatale nei ratti p10

Transient Middle Cerebral Artery Occlusion Model of Neonatal Stroke in P10 Rats

Un certo numero di modelli animali sono stati utilizzati per studiare le lesioni ipossico-ischemiche, le lesioni traumatiche, l'ipossia globale o l'ischemia permanente sia nel cervello immaturo che in quello maturo. L'ictus si verifica comunemente nel periodo perinatale nell'uomo e l'ischemia-riperfusione transitoria è la forma più comune di ictus nei neonati. La fase di riperfusione è una componente critica della progressione della lesione, che si verifica in un periodo di giorni o settimane, e della risposta endogena alla lesione. Questo modello di ratto postnatale del 10° giorno (p10) di occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media (tMCAO) crea una lesione da ischemia-riperfusione focale unilaterale e non emorragica che può essere utilizzata per studiare i meccanismi della lesione focale e della riparazione nel cervello equivalente a termine. Il modello di lesione prodotto da tMCAO è coerente e altamente riproducibile e può essere confermato con risonanza magnetica o analisi istologiche. La gravità della lesione può essere manipolata attraverso cambiamenti nel tempo di occlusione e altri metodi che verranno discussi.

La gravità del danno causato da tMCAO dipende in larga misura sia il tempo di occlusione e l'esperienza del chirurgo. A 90-minuti di occlusione spesso produce una lieve a moderata modello infortunio, mentre 3 h produce una lesione moderata-grave. Gravità del danno può essere valutato attraverso una varietà di metodi, tra cui la risonanza magnetica, l'istologia, o analisi comportamentali a breve oa lungo termine. La figura 2 illustra un esempio di DW-MRI eseguita 75 min in un'occlusione 90 min, confermando danno ischemico coinvolge l'emisfero ipsilaterale. Diffusione pesate dimostra aumentata diffusione nello striato ipsilaterale e la maggioranza della corteccia ipsilaterale, senza cambiamenti controlaterale, durante la fase ischemico acuto. Questo è correlato a un livello moderato di lesioni a lungo termine che coinvolge sia la corteccia e la materia grigia profonda. L'occlusione dei risultati MCA inmorte cellulare che inizia nello striato per lesioni meno gravi e si sviluppa un peggioramento lesioni corticali e dell'ippocampo per tempi più lunghi di occlusione e lesioni più gravi. Durante l'ottimizzazione della tecnica chirurgica, come la determinazione della lunghezza di inserimento sutura, RM è consigliabile, in quanto consente la conferma della corretta sutura e visualizzazione di edema e progressione lesioni durante l'occlusione 14, 15, 16. Se la risonanza magnetica non è disponibile, H &amp; E o colorazione viola cresolo sono metodi istologici semplici ed affidabili per determinare la morfologia lesioni e possono essere utilizzati in entrambi i punti temporali precoce e tardiva dopo il tMCAO. La figura 3 illustra uno schema lesione moderata a grave in esame istopatologico dopo 3 h occlusione, dimostrando formazione di cisti e il volume nel corpo striato omolaterale e la corteccia. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page="1" imparziale quantificazione stereologica di sezioni cresolo-viola-macchiata per calcolare il rapporto ipsilaterale volume emisferica controlaterale conferma danno ischemico-riperfusione. specificamente dopo anestetizzare l con euthasol cervello stato raccolto da transcardiac perfusione in m pbs paraformaldeide. seguendo postfixation notte e equilibrazione nel saccarosio stata sezionata a um intervalli ogni sezione xii selezionato montato colorate violetto cresolo>10. Anche con lesioni lievi, modifiche dell'apparato locomotore, come la circuitazione e emiparesi, sono noti nel corso del periodo di occlusione. Con la ferita più grave, questi cambiamenti persistere dopo riperfusione. test comportamentali supplementare può essere utilizzato per valutare la gravità delle lesioni, tra cui rotarod o cilindro di prova di allevamento per la funzione sensomotoria e il labirinto di acqua Morris perla funzione cognitiva 13. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig1.jpg"> Figura 1: in diretta chirurgici Immagini della Procedura tMCAO. (A) Il primo filamento di sutura occhiello attorno al ICA, come illustrato nel passo 1.6. (B) La prima legatura temporaneo è legato e ICA è retratto. Il secondo filamento di sutura viene avvolta attorno alla ICA, lateralmente al primo filamento di sutura, come illustrato nel passo 1.9. (C) La siliconato sutura occlusione viene alimentato nel sito di arteriotomia, come illustrato nel passo 1.12. (D) La seconda legatura temporanea è legata per fissare l'occlusore in posizione, come illustrato nel passo 1.14. bar scala = 1 mm. <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig2.jpg"> Figura 2: MRI Durante Occlusione dimostra l'appropriato unilaterale Injury. Anteriore a posteriore, fette di immagini coronali del DW-MRI, eseguite durante 90 min occlusione, dimostrare maggiore diffusione coinvolge l'emisfero ipsilaterale (frecce), che è coerente con la lesione ischemica in corso nella fase acuta. Ristampato con il permesso di Stroke 11. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig2large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54830/54830fig3.jpg"> Figura 3: unilaterale di lesioni che coinvolgono lo striato e la corteccia a 4 settimane seguenti tMCAO. Posteriore alla anteriore, cresolo-viola macchiato sezioni del cervello coronali (ogni 50 micron) raccolti da P38 animali dimostrano lesioni piuttosto gravi (le frecce indicano la formazione di cisti omolaterale e ridotto corticale eVolume striatale) dopo 3 h tMCAO a P10. Il foro circolare sul lato sinistro rappresenta un identificatore emisfero controlaterale. bar scala = 5 mm. Ristampato con il permesso di Neurobiology of Disease 12. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54830/54830fig3large.jpg" target="_blank">Si prega di cliccare qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

L'ictus neonatale è una causa significativa di lesione cerebrale precoce che richiede un modello traslazionale con modelli di lesione focale coerenti e un'elevata riproducibilità per consentire lo studio. Questo studio descrive la procedura chirurgica dettagliata per la creazione di una lesione da ischemia-riperfusione focale unilaterale non emorragica nei roditori equivalenti a termine.

Transient Medio occlusione dell&#39;arteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10

A number of animal models have been used to study hypoxic-ischemic injury, traumatic injury, global hypoxia, or permanent ischemia in both the immature ...

L'obiettivo generale dell'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei ratti neonatali è quello di fornire un modello traslazionale di ictus nei neonati a termine. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della lesione cerebrale ischemica neonatale, comprendendo i meccanismi di lesione e riparazione nel cervello in via di sviluppo e come possiamo modificarli con diverse strategie terapeutiche. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un modello fisiologicamente accurato dell'ictus ischemico arterioso focale nei neonati e include anche una componente di riperfusione, che è una parte importante della progressione della lesione nei neonati umani.La dimostrazione visiva di questo modello è fondamentale, perché le fasi di questo intervento chirurgico possono essere molto difficili da imparare. Le rappresentazioni bidimensionali dell'anatomia arteriosa non sempre dimostrano adeguatamente la natura complessa della ramificazione 3D nel ratto. Inizia pesando il cucciolo per assicurarti che sia compreso tra 19 e 21 grammi.Dopo aver anestetizzato il cucciolo utilizzando isoflurano inalato secondo i protocolli approvati, assicurarsi che non vi sia risposta a un pizzicamento del piede. Mantenere la temperatura della superficie corporea con l'uso di un termoforo sotto la fase chirurgica. Fissare l'animale in posizione supina con del nastro adesivo sulle regioni delle spalle.Utilizzare tamponi di cotone sterili per tamponare l'area cervicale anteriore con etanolo al 70%, seguiti da un tampone di soluzione di iodio povidone. Successivamente, infiltrare localmente lo 0,25% di bupivacaina nel sito di incisione pianificato. Quindi, mentre si lavora attraverso uno stereoscopio, praticare un'incisione cervicale anteriore di cinque-sette millimetri per esporre l'arteria carotide comune.Posizionare da due a quattro divaricatori per mantenere la cavità aperta e l'arteria esposta. Quindi, individua l'arteria carotide interna, l'arteria occipitale e l'arteria carotide esterna. Rimuovere il tessuto connettivo e il grasso dalle arterie per avere una visione chiara.Dopo aver tagliato 1,5 centimetri di filo di sutura intrecciato di seta 6-0, slacciare la sutura, estraendo i singoli fili. Assicurati che i singoli fili siano puliti e non sfilacciati. Tenendo il filo di sutura entro una pinza di 45 gradi, spazzare la pinza in un arco sotto l'ICA in modo che le punte emergano tra l'ICA e l'OA. Quindi, afferra l'estremità del filo di sutura e tiralo in modo che l'estremità sia di facile accesso.Rilasciare il filo dal forcipe e far uscire il forcipe da sotto l'ICA, invertendo il movimento precedente. Legare una legatura temporanea attorno all'ICA alla base più vicina al punto in cui si separa dal CCA. Ritrarre con cautela l'ICA lateralmente, quindi utilizzare una clip per fissare il filamento retrattile alla pelle in eccesso vicino alla regione ascellare sul lato opposto all'incisione.Assicurarsi che il filo retrattile sia sufficientemente teso da interrompere il flusso sanguigno prima di procedere al passaggio successivo. L'arteria dovrebbe essere piatta e pallida. Usa una pinza a 45 gradi per afferrare un altro filo di sutura non intrecciato e avvolgilo sotto e intorno all'ICA come prima.Posizionare questo filo lateralmente al filo di retrazione. Quindi tagliare un'arteriotomia di 0,2 millimetri a metà strada tra le legature legate e quelle slegate, errando più vicino alla legatura legata. Ora, utilizzando un righello metrico, misura 10 millimetri di sutura in nylon rivestita di silicone come sutura occlusiva.Tagliare la sutura con una tolleranza extra di due o tre millimetri per la rimozione durante la riperfusione. Tenere la sutura occlusiva con una pinza a 45 gradi e utilizzare una pinza diritta per creare una curva, segnando il punto di arresto dell'avanzamento. Inserire la sutura occlusiva nell'arteriotomia, puntandola parallelamente all'ECA e verso la testa.Far avanzare dolcemente la sutura fino a raggiungere la curva. Quindi utilizzare il filo posizionato lateralmente al filamento di retrazione per legare una legatura temporanea per fissare la sutura dell'occlusione. Rimuovere la clip del divaricatore, quindi tagliare i fili di entrambe le legature temporanee, lasciando il filo che verrà utilizzato per rimuovere il nodo più lungo del filo utilizzato per stringerlo.Rimuovere i divaricatori e chiudere la cavità utilizzando seta intrecciata 6-0 per creare tre o quattro suture interrotte. Togli il cucciolo dall'anestesia e posizionalo su un termoforo all'aria ambiente. Monitorare il cucciolo fino a quando non ha riacquistato sufficiente coscienza per mantenere la decubito sternale e assicurarsi che si sia completamente ripreso prima di riportarlo alla madre.Durante l'occlusione, la risonanza magnetica pesata in diffusione può essere utilizzata per verificare l'induzione appropriata della lesione. Queste immagini mostrano una lesione ischemica in corso, indicata dalla freccia, rilevata dalla DW-MRI durante la MCAO transitoria. Circa due ore e 50 minuti dopo l'occlusione dell'MCA, preparare i materiali chirurgici, quindi iniziare la procedura di riperfusione anestetizzando come prima.Rimuovere le suture interrotte e individuare la giunzione, che è contrassegnata dalle due legature e dall'estremità della coda della sutura occludente. Sciogliere con cura il nodo più laterale della legatura temporanea tirando il filo più lungo e rimuovere il filo di sutura dalla cavità. Esattamente tre ore dopo l'occlusione MCA, far uscire lentamente la sutura occlusiva dall'arteria.Non ci dovrebbe essere resistenza. Usa una pinza per applicare pressione all'arteriotomia, quindi sciogli con cura il nodo mediale per ripristinare il flusso sanguigno. Dopo aver rimosso il filo di sutura dal corpo, applicare un agente emostatico sull'arteriotomia per fermare l'emorragia.Il ritorno della forma originale dell'arteria e del colore rosso conferma che il flusso sanguigno dell'ICA è stato ripristinato. Rimuovere i divaricatori e chiudere la cavità utilizzando seta intrecciata 6-0 per creare tre o quattro suture interrotte. Togliete il cucciolo dall'anestesia e lasciatelo riprendere, monitorandolo come prima, prima di rimetterlo nella gabbia di casa.Ispeziona i cuccioli ogni giorno per cinque giorni. Registra i loro pesi e ispeziona attentamente i siti di incisione per una guarigione appropriata. Queste sezioni cerebrali coronali colorate di viola cresyl-posterior-anterior, da 50 micron, raccolte da animali P-38, dimostrano lesioni piuttosto gravi dopo un TMCAO di tre ore a P-10.La freccia indica la formazione di cisti omolaterali e la riduzione del volume corticale e striatale. Il foro rotondo sul lato sinistro rappresenta un identificatore dell'emisfero controlaterale. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare che, sebbene questa procedura sia concettualmente semplice, il successo e la padronanza possono richiedere ore di ottimizzazione e pratica.Una volta padroneggiata, l'occlusione può essere completata in meno di 10 minuti, mentre la riperfusione può essere completata in meno di cinque minuti.

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Induzione chirurgica del danno ischemico cerebrale nel ratto è un modello ampiamente utilizzato per la ricerca ictus. Qui mostriamo l'induzione di ischemia cerebrale focale da occlusione dell'arteria cerebrale media. Visualizzazione delle infarto risultante dalla colorazione istologica e la risonanza magnetica è anche mostrato.

Modello di ischemia cerebrale focale da occlusione endovascolare Sutura della arteria cerebrale media nel ratto

Dimostriamo nel video un metodo per produrre una occlusione dell'arteria cerebrale media in topi adulti utilizzando un monofilamento intraluminale. Mostriamo anche come valutare il grado di infarto cerebrale da 2,3,5-trifeniltetrazolio cloruro (TTC) colorazione.

Modello murino di Mezzo occlusione dell&#39;arteria cerebrale

Fonte: Larpthaveesarp, A., et. al. Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media di ictus neonatale nei ratti P10. J. Vis. Exp. (2017)Questo video mostra l'istituzione del modello di occlusione dell'arteria cerebrale media in un cucciolo di ratto. L'arteria carotide interna (ICA) è esposta e una legatura è fissata per limitare il flusso di sangue. Un occlude viene inserito attraverso l'ICA per raggiungere l'arteria cerebrale media. Il cucciolo viene quindi lasciato riprendersi...

Generazione di un'occlusione dell'arteria cerebrale media in un cucciolo di ratto per indurre l'ischemia cerebrale locale

Descriviamo un metodo altamente riproducibile per l'occlusione permanente di un roditore grande vaso sanguigno cerebrale. Questa tecnica può essere realizzato con pochissima danni periferici, minima perdita di sangue, un elevato tasso di sopravvivenza a lungo termine, e volume dell'infarto coerente commisurato alla popolazione clinica umana.

Cerebrale permanente occlusione di vasi<em&gt; Via</em&gt; Doppio Legatura e resezione

Vari modelli murini di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAO) sono ampiamente utilizzati nella ricerca sul cervello sperimentale. Qui, dimostriamo il modello di transcranica permanente distale MCAO che produce coerente infarto corticale di misura corrispondente al danno imposto dalla maggioranza degli ictus ischemici umani.

Corsa di modellazione in Mouse: Coagulazione permanente dell&#39;arteria cerebrale media distale

Diversi modelli di occlusione dell'arteria cerebrale media (MCAo) sono utilizzati nella ricerca sperimentale sull'ictus. Qui, viene descritto un modello sperimentale di ictus di MCAo transitorio attraverso l'arteria carotide esterna (ECA), che mira a imitare l'ictus umano, in cui il trombo cerebrovascolare viene rimosso a causa della lisi spontanea del coagulo o della terapia.

Modellazione dell'ictus nei topi: occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media attraverso l'arteria carotide esterna

Questo protocollo dimostra un modello unico di ictus del topo con un infarto di medie dimensioni e un eccellente tasso di sopravvivenza. Questo modello consente ai ricercatori preclinici sull'ictus di estendere la durata dell'ischemia, utilizzare topi anziani e valutare gli esiti funzionali a lungo termine.

Un modello modificato di occlusione dell'arteria cerebrale media transcranica per studiare gli esiti dell'ictus nei topi anziani

Questo protocollo descrive il modello di ischemia cerebrale focale transitoria nei topi attraverso l'occlusione intraluminale dell'arteria cerebrale media. Inoltre, vengono mostrati esempi di valutazione dei risultati utilizzando la risonanza magnetica per immagini e test comportamentali.

Modello transitorio di occlusione dell'arteria cerebrale media dell'ictus

Il protocollo attuale descrive un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media che preserva la struttura anatomica dei vasi cerebrali senza causare danni.

Un modello di ratto di occlusione/riperfusione dell'arteria cerebrale media senza danneggiare la struttura anatomica dei vasi cerebrali

L'obiettivo di questo studio era stabilire un metodo riproducibile per eseguire una craniectomia seguita da un'occlusione permanente e selettiva dell'arteria cerebrale media nei ratti, da applicare in studi sperimentali sui deficit di memoria motoria e spaziale.

Occlusione selettiva e permanente dell'arteria cerebrale media nei ratti: un approccio sperimentale per studiare i deficit di memoria motoria e spaziale

Impara l'occlusione transitoria dell'arteria cerebrale media nei ratti neonati P10 per studiare l'ictus neonatale. Questo modello chirurgico riproducibile consente di esplorare i meccanismi di lesione ischemica e le strategie terapeutiche nel cervello in sviluppo.

Transient Medio occlusione dell'arteria cerebrale Modello di Stroke neonatale nei ratti P10

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