Name: Misura della differenzialmente metilato INS DNA Specie in campioni di siero umano come una cellula morte biomarker di Islet β (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 34 s
Description: Scopri come misurare il DNA differenzialmente metilato di INS nel siero umano come biomarker di morte delle cellule β. Questo metodo utilizza la PCR digitale per rilevare precocemente il diabete di tipo 1.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione UC4 DK104166 del National Institutes of Health (a RGM). Desideriamo ringraziare l'assistenza dell'Indiana Diabetes Research Center Translation Core supportato dalla sovvenzione P30 DK097512 del National Institutes of Health.

Dichiarazione etica: I protocolli sono stati approvati dall'Indiana University Institutional Review Board. I genitori dei soggetti hanno fornito il consenso informato scritto e i bambini di età superiore ai 7 anni hanno fornito il consenso alla loro partecipazione.
1. Lavorazione del siero
NOTA: Il test descritto è stato rigorosamente testato utilizzando siero umano isolato come segue.
<ol>
	<li>Raccogliere il sangue in una provetta per la raccolta del sangue con tappo rosso (senza additivi; non rivestita).</li>
	<li>Lasciare riposare a temperatura ambiente per 30 minuti per consentire la formazione del coagulo.</li>
	<li>Provetta da centrifuga a 2.000 x g per 10 min a temperatura ambiente. Trasferire il surnatante (siero) in una nuova provetta destinata alla conservazione del siero (provette in polipropilene con tappo a vite, dimensioni dipendenti dai campioni).</li>
	<li>Conservare i campioni a -80 ºC fino al momento dell'isolamento del DNA.</li>
</ol>
2. Estrazione del DNA del siero
NOTA: Il DNA viene estratto con un kit di estrazione del DNA utilizzando 50 μl di siero (consigliato), seguendo il protocollo del produttore con alcune modifiche.
<ol>
	<li>Preparare 200 μl di tampone di lisi + 1 μl di poli(A) (5 μg) per campione in una provetta da microcentrifuga. Vortice per 15 sec. Mettere da parte fino al passaggio 2.3.</li>
	<li>Prelevare campioni di siero dal congelatore a -80 ºC e scongelare a temperatura ambiente. Portare il volume del campione di siero fino a 200 μl totali utilizzando soluzione salina tamponata con fosfato (PBS, con cloruro di calcio e cloruro di magnesio).</li>
	<li>Lisi il campione aggiungendo 20 μl di proteasi (1,4 unità Anson/ml) al campione, seguito da 200 μl di tampone di lisi/miscela di poliA (dal passaggio 2.2) e vortice per 8 secondi. Incubare il campione a 56 °C per 10 minuti, quindi centrifugare brevemente per 7 secondi alla massima velocità in una microcentrifuga (>10.000 x g).</li>
	<li>Far precipitare il DNA aggiungendo 230 μl di etanolo al 100% al campione e agitare per 8 secondi. Centrifugare brevemente per 7 secondi alla massima velocità (>10.000 x g).</li>
	<li>Applicare il DNA alla colonna di centrifuga aggiungendo 600 μl di miscela di campioni alla mini colonna di centrifuga. Centrifugare a 6.000 x g per 1 min. Eliminare il flusso e posizionare la colonna in un tubo pulito.</li>
	<li>Lavare il DNA aggiungendo 500 μl di tampone di lavaggio 1 alla colonna. Centrifugare a 6.000 x g per 1 min. Eliminare il flusso e posizionare la colonna in un tubo pulito. Aggiungere 500 μl di tampone di lavaggio 2 alla colonna e centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 3 minuti. Posizionare la colonna in una nuova provetta per microcentrifuga da 1,5 ml e centrifugare nuovamente alla massima velocità per 1 minuto.</li>
	<li>Eluire il DNA posizionando la colonna in una nuova provetta da microcentrifuga da 1,5 ml e aggiungendo 60 μl di tampone di eluizione direttamente sul filtro. È importante cambiare i puntali da un campione all'altro per evitare la contaminazione incrociata. Incubare a temperatura ambiente per 5 minuti, quindi centrifugare a 6.000 x g per 1 minuto. Aggiungere altri 60 μl di tampone di eluizione e centrifugare a 6.000 x g per 1 minuto. </li>
	<li>Conservare il DNA a -20 ºC per un uso successivo o procedere immediatamente alla conversione del bisolfito.</li>
</ol>
3. Conversione del bisolfito
NOTA: La conversione del bisolfito viene eseguita utilizzando un kit di conversione del bisolfito, seguendo il protocollo del produttore con alcune modifiche.
<ol>
	<li>Per convertire le citosine non metilate in uracili, aggiungere 130 μl di reagente di conversione del bisolfito a 20 μl di DNA dal passaggio 2.7 in una provetta per PCR (provetta singola per PCR da 0,2 ml o provette per PCR a 8 strisce). Conservare i restanti 40 μl di DNA per un uso futuro o per utilizzarlo in reazioni replicate. Mescolare 20 volte pipettando su e giù e centrifugare brevemente per assicurarsi che non vi siano gocce sui lati o sul coperchio. Incubare a bagnomaria o termociclatore come segue: 98 °C per 8 min, 54 °C per 60 min, 4 °C per 5 min.
	<ol>
		<li>Procedere al passaggio 3.2 o conservare a 4 °C per un massimo di 20 ore.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aggiungere 600 μl di tampone legante alla colonna di centrifuga e posizionare la colonna nella provetta di raccolta fornita. Applicare il DNA bisolfulato sulla colonna e mescolare pipettando su e giù 10 volte. Centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 30 sec. Scartare il flusso.</li>
	<li>Lavare il DNA aggiungendo 100 μl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 30 secondi.</li>
	<li>Eseguire la desolfonazione per rimuovere il gruppo solfonato per finalizzare la conversione delle citosine non metilate in uracile aggiungendo 200 μl di tampone di desolfonazione alla colonna. Lasciare riposare a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi centrifugare alla massima velocità (>10.000 x g) per 30 secondi.</li>
	<li>Lavare il DNA aggiungendo 200 μl di tampone di lavaggio alla colonna e centrifugare alla massima velocità per 30 secondi. Eliminare il flusso continuo e ripetere questa fase di lavaggio.</li>
	<li>Posizionare la colonna in una provetta da microcentrifuga da 1,5 ml. Eluire il DNA aggiungendo 10 μl di tampone di eluizione direttamente al filtro della colonna. Incubare per 1 minuto. Centrifugare per 30 s alla massima velocità per eluire il DNA. Quantificare il DNA recuperato mediante spettrofotometria ad A260. 
	NOTA: Il DNA rilevato dalla spettrofotometria rappresenta principalmente il DNA poliA trasportatore che è stato aggiunto al passaggio 2.3 sopra. Tipicamente, il recupero del poliA è pari al ≥85% dell'input (>4,25 μg).</li>
	<li>Conservare il DNA a -20 °C fino al momento di procedere con la PCR digitale.</li>
</ol>
4. PCR digitale multiplex
<ol>
	<li>Preparare una miscela master con una soluzione sufficiente per ogni campione e controllo. Includere almeno un campione contenente acqua (controllo negativo), un campione di un plasmide contenente INS non metilato (1 pg, controllo positivo), un campione di plasmide contenente INS metilato (1 pg, controllo positivo) e un campione contenente una miscela 1:1 di plasmidi.
	<ol>
		<li>Per preparare la miscela master PCR, aggiungere 12,5 μl per reazione di tampone PCR (ad esempio, 125 μl per 10 campioni), 1,25 μl per miscela primer/sonda di reazione (ad esempio, 12,5 μl per 10 campioni), 8,25 μl per acqua di reazione (ad esempio, 82,5 μl per 10 campioni), 0,5 μl per reazione 5 μl per 10 campioni). 
		NOTA: Gli inneschi e le sonde utilizzati qui sono i seguenti: Innesco in avanti: 5'-GGAAATTGTAGTTTTAGTTTTTGTTATTTGTGTGTGTGTGTGT-3'; Innesco inverso: 5'-AAAACCCATCTCCCCTACCTATCA-3'; Sonda FAM: FAM-5'-ACCCCTACCACCTAAC-3'-MGB; Sonda VIC: VIC-5'-ACCCCTACCGCCTAAC-3'-MGB.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Impostare la reazione PCR multiplex in una piastra a 96 pozzetti. Aggiungere 19,5 μl di master mix a ciascun pozzetto. Aggiungere 2,5 μl di campione di DNA convertito con bisolfito in ciascun pozzetto appropriato (conservare i restanti 7,5 μl di DNA convertito con bisolfito o utilizzarli in reazioni replicate). Miscelare pipettando su e giù più volte. 
	NOTA: Tutti gli 8 pozzetti di fila devono contenere il controllo del campione o del tampone.</li>
	<li>Sigillare con un foglio di alluminio utilizzando una sigillante per piastre e centrifugare in una centrifuga per piastre fino a quando non c'è più liquido sui lati dei pozzetti.</li>
	<li>Configura il generatore automatico di goccioline sul touchscreen. 
	NOTA: Tutti gli 8 pozzetti della cartuccia devono contenere il controllo del campione o del tampone.
	<ol>
		<li>Impostare il numero di righe utilizzate toccando la riga o le righe in cui vengono caricati i campioni sulla piastra a 96 pozzetti dal passaggio 4.2 ed evidenziare la riga in blu per indicare una riga attiva.</li>
		<li>Caricare i materiali di consumo da dietro a davanti per evitare contaminazioni. Per iniziare, aggiungi le cartucce lungo l'ultima fila dello strumento. Caricare le punte nella fila centrale dello strumento. 
		NOTA: Le cartucce possono essere inserite nei supporti solo con l'orientamento corretto.</li>
		<li>Posizionare la piastra a 96 pozzetti nello strumento. Rimuovere un blocco freddo dal congelatore a -20 °C e inserirvi una nuova piastra a 96 pozzetti. Posizionarlo all'interno dello strumento accanto alla piastra a 96 pozzetti caricata con campione.</li>
		<li>Aggiungere l'olio all'erogatore nella parte anteriore dello strumento. Seleziona il tipo di olio sul touchscreen.</li>
		<li>Toccare il pulsante blu di avvio per iniziare la corsa. Confermare l'impostazione della piastra e toccare il pulsante di avvio della corsa per iniziare.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Una volta terminato, rimuovere la piastra a 96 pozzetti che contiene le goccioline appena formate e sigillare con un foglio di sigillatura utilizzando un sigillante per piastre.</li>
	<li>Eseguire la PCR10 su un termociclatore utilizzando il seguente programma: 95 °C per 10:00 min; 40 cicli a: 94 °C per 00:30 min, 57,5 °C per 01:00 min; 98 °C per 10:00 min; 12 °C per 10 min o fino a 24 ore.</li>
	<li>Posizionare la piastra sul lettore di gocce e configurare il lettore.
	<ol>
		<li>Fare clic sulla scheda di configurazione. Aprire un nuovo modello facendo clic su modello > nuovo. Immettere un nome per il file.</li>
		<li>Utilizzare l'editor dei pozzetti per impostare i parametri per ogni campione. Assegna a ciascun campione un nome univoco, imposta l'esperimento su Rare Event Detection (R-RED) e imposta il master mix sulla miscela utilizzata nel passaggio 4.1.</li>
		<li>Assegna un nome al Target 1 (cioè non metilato) e imposta il Target 1 come sconosciuto (U). Assegna un nome al Target 2 (cioè metilato) e imposta il Target 2 come riferimento (R).</li>
		<li>Fare clic sulla scheda Esegui per avviare l'esecuzione. Nella finestra delle opzioni di esecuzione, selezionare la chimica di rilevamento (FAM/VIC).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Analisi dei dati
<ol>
	<li>Aprire i risultati nella scheda Analizza e analizzarli utilizzando il grafico 2D basato su controlli positivi (vedere la Figura 1).</li>
	<li>Esporta il file CSV generato dal lettore di droplet in un programma di fogli di calcolo per l'analisi dei dati.</li>
	<li>Per generare "copie per μl" di siero, utilizzare la formula: (concentrazione*250)/(volume di siero utilizzato per l'isolamento del DNA in μl). 6 
	NOTA: I dati vengono in genere convertiti in log10 quando vengono acquisiti da siero umano per garantire la normale distribuzione. In alternativa, i dati possono essere tracciati su una scala log10 e analizzati mediante statistiche non parametriche.</li>
</ol>
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<li>Derks, S., Lentjes, M. H. F. M., Hellebrekers, D. M. E. I., de Bruïne, A. P., Herman, J. G., van Engeland, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methylation-specific+PCR+unraveled%5BTitle%5D)+AND+%22Cell.+Oncol%22%5BJournal%5D)">Methylation-specific PCR unraveled.</a> Cell. Oncol. 26 (5-6), 291-299 (2004).</li>
<li>Husseiny, M. I., Kuroda, A., Kaye, A. N., Nair, I., Kandeel, F., Ferreri, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+quantitative+methylation-specific+polymerase+chain+reaction+method+for+monitoring+beta+cell+death+in+type+1+diabetes%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">Development of a quantitative methylation-specific polymerase chain reaction method for monitoring beta cell death in type 1 diabetes.</a> PloS One. 7 (10), 47942(2012).</li>
<li>Hindson, B. J., Ness, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-Throughput+Droplet+Digital+PCR+System+for+Absolute+Quantitation+of+DNA+Copy+Number%5BTitle%5D)+AND+%22Anal.+Chem%22%5BJournal%5D)">High-Throughput Droplet Digital PCR System for Absolute Quantitation of DNA Copy Number.</a> Anal. Chem. 83 (22), 8604-8610 (2011).</li>
<li>Sozzi, G., Roz, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+prolonged+storage+of+whole+plasma+or+isolated+plasma+DNA+on+the+results+of+circulating+DNA+quantification+assays%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Natl.+Cancer+Inst%22%5BJournal%5D)">Effects of prolonged storage of whole plasma or isolated plasma DNA on the results of circulating DNA quantification assays.</a> J. Natl. Cancer Inst. 97 (24), 1848-1850 (2005).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La metilazione del cytosines di DNA metiltransferasi permette il controllo epigenetico della trascrizione in molti geni. Il gene INS nell&#39;uomo è espresso quasi esclusivamente in isolotto β cellule, e sembra che vi sia una correlazione tra la frequenza di metilazione del cytosines nel gene INS per silenziamento della sua trascrizione 11. Come tale, la maggior parte dei tipi di cellule mostrano sostanzialmente frequenze più elevate di metilazione del gene INS a vari cytosines risp...

Il diabete di tipo 1 (diabete di tipo 1) è una malattia autoimmune che si caratterizza per la distruzione di isolotto che producono insulina β cellule da parte delle cellule T autoreattive 1. La diagnosi di diabete di tipo 1 è in genere effettuato al momento della misurazione della (glicemia&gt; 200 mg / dl) iperglicemia in una magra, giovane individuo, che potrebbe presentarsi con chetoacidosi come prova di deficit di insulina. Al momento della diagnosi di diabete di tipo 1, vi è evidenza di sostanziale perdita della funzione delle cellule β e la massa (dal 50 - 90%) 2. Negli studi clinici, diversi farmaci modulatori immunitario che sono stati istituiti al momento della diagnosi ha portato alla stabilizzazione della funzione delle cellule β (e presumibilmente di massa), ma nessuno ha portato a remissione clinica della malattia, una scoperta che ha sollevato la chiamata per lo sviluppo di biomarcatori per la diagnosi precoce della malattia e per il tracciamento longitudinale efficacia di terapie combinate 3,4. Gli sforzi da consorzi internazionali, come ad uns Consorzio Research Network Islet Umana presso il National Institutes of Heath 5, hanno sottolineato la necessità di sviluppare biomarcatori che si concentrano sullo stress delle cellule β e la morte nel diabete di tipo 1. In linea con questi sforzi, il nostro gruppo ed altri hanno recentemente sviluppato test biomarker che misurano circolanti, frammenti di DNA epigeneticamente modificati che nascono principalmente da morire le cellule beta 6-9. In tutti i saggi pubblicati fino ad oggi, il focus è stato sul quantificazione del gene umano codifica preproinsulina (INS), che dimostra maggiori gradi di non metilato siti CpG nelle regioni codificanti e promotore rispetto ad altri tipi di cellule. La liberazione di non metilato frammenti di DNA INS stato ipotizzato come derivanti principalmente dalla morte (necrosi, apoptosi) delle cellule beta. I nostri studi recenti hanno dimostrato che in gioventù, l&#39;innalzamento di DNA sia metilato e metilato INS in posizione -69 bp (rispetto a tegli trascrizionale inizio sito) sono stati osservati in nuova insorgenza diabete di tipo 1, e insieme servito biomarcatori come specifici per questa popolazione 6. Questi dosaggi biomarker comportano l&#39;isolamento di DNA cell-free dal siero o plasma utilizzando kit di spin commerciali, seguita da una conversione bisolfito del DNA isolato (per convertire cytosines non metilato per uracils, lasciando cytosines metilati intatto). In questo rapporto, descriviamo gli aspetti tecnici della raccolta dei campioni di siero, l&#39;isolamento del DNA cell-free dal siero, la conversione bisolfito, e le prestazioni di goccioline PCR digitale (d&#39;ora in poi, PCR digitale) per differenziale metilato INS DNA.

<table><tbody><tr><td>Vacutainer con tappo rosso&nbsp;</td><td>Beckon Dickinson</td><td>366441</td><td>nessun additivo, interno non rivestito, 10 ml</td></tr><tr><td>Tubo criovale</td><td>Simport</td><td>T310-3A</td><td>polipropilene, tubo con tappo a vite, qualsiasi dimensione</td></tr><tr><td>QIAamp DNA Blood Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>51106</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A)</td><td>Sigma</td><td>P9403</td><td>disloved in tampone TE (10 mM Tris-Cl pH 8.0 + 1 mM EDTA) a 5 &micro; g/&micro; l&nbsp;</td></tr><tr><td>Etanolo assoluto (200 prove)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP2818-500</td><td></td></tr><tr><td>DPBS (con CaCl2 e MgCl2)</td><td>Sigma</td><td>D8662</td><td></td></tr><tr><td>Provette PCR da 0,2 ml a 8 strisce</td><td>MidSci</td><td>AVST</td><td></td></tr><tr><td>Tappi a 8 strisce, Dome</td><td>MidSci</td><td>AVSTC-N</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Kit di metilazione-fulmine</td><td>Zymo</td><td>D5031</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Supermix per sonde (senza dUTP)</td><td>Biorad</td><td>1863024</td><td></td></tr><tr><td>Buffer Control per sonde</td><td>Biorad</td><td>1863052</td><td></td></tr><tr><td>miscela di primer/sonda umana non metilata/metilata</td><td>Life Technologies</td><td>AH21BH1</td><td></td></tr><tr><td>EcoR1</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101L</td><td></td></tr><tr><td>twin.tec PCR Plate 96, semi-gonna</td><td></td><td>Eppendorf 951020346</td><td></td></tr><tr><td>Foglio perforabile Termosaldatore</td><td>Biorad</td><td>1814040</td><td></td></tr><tr><td>PX1 PCR Sigillante</td><td>per piastre Biorad</td><td>1814000</td><td></td></tr><tr><td>QX200 AutoDG Droplet Digital PCR System</td><td>Biorad</td><td>1864101</td><td></td></tr><tr><td>Olio per la generazione automatizzata di goccioline</td><td>Biorad</td><td>186-4110</td><td></td></tr><tr><td>DG32 Cartuccia per generatore di gocce automatizzato</td><td>Biorad</td><td>186-4108</td><td></td></tr><tr><td>Punte per pipette per generatore automatico di gocce</td><td>Biorad</td><td>186-4120</td><td></td></tr><tr><td>Contenitori per punte per pipette per generatore automatico di gocce</td><td>Biorad</td><td>186-4125</td><td></td></tr><tr><td>C1000 Touch Thermal Cycler</td><td>Biorad</td><td>1851197</td><td></td></tr><tr><td>QX200 Lettore di gocce</td><td>Biorad</td><td>186-4003</td><td></td></tr><tr><td>ddPCR Olio per lettore di gocce</td><td>Biorad</td><td>186-3004</td><td></td></tr></tbody></table>

misura della differenzialmente metilato<em&gt; ins</em&gt; dna specie in campioni di siero umano come una cellula morte biomarker di islet β

Measurement of Differentially Methylated INS DNA Species in Human Serum Samples as a Biomarker of Islet &#946; Cell Death

Si ritiene che la morte delle cellule β insulari sia alla base della patogenesi di praticamente tutte le forme di diabete e che preceda lo sviluppo dell'iperglicemia franca, specialmente nel diabete di tipo 1. Lo sviluppo di biomarcatori sensibili e affidabili della morte cellulare β può consentire un intervento terapeutico precoce per prevenire o ritardare lo sviluppo del diabete. Recentemente, diversi gruppi, tra cui il nostro, hanno riportato che il DNA libero da cellule e differenzialmente metilato che codifica per la preproinsulina (INS) in circolazione è correlato alla morte cellulare β nel diabete pre-tipo 1 e nel diabete di tipo 1 di nuova insorgenza. Qui, presentiamo un protocollo passo-passo che utilizza la PCR digitale per la misurazione del DNA INS libero da cellule che viene metilato in modo differenziale alla citosina in posizione -69 bp (rispetto al sito di inizio trascrizionale). Dimostriamo che il test è in grado di distinguere tra citosina metilata e non metilata in posizione -69 bp, è lineare su diversi ordini di grandezza, fornisce una quantificazione assoluta del numero di copie del DNA e può essere applicato a campioni di siero umano da individui con diabete di tipo 1 di nuova insorgenza e controlli liberi da malattia. Il protocollo qui descritto può essere adattato a qualsiasi specie di DNA per la quale si desidera rilevare citosine metilate differenzialmente, sia dalla circolazione che da cellule e tessuti isolati, e può fornire una quantificazione assoluta dei frammenti di DNA.

Per interpretare i dati in modo appropriato, usiamo i controlli plasmide sia per il target INS DNA non metilato e metilato in ogni seduta PCR digitale. Questi controlli assicurano che i segnali corrispondenti al DNA metilato e non metilato sono chiaramente distinguibili. La Figura 1 mostra i diagrammi di dispersione 2-D corrispondenti a gocce per controlli plasmide contenente bisolfito-convertito non metilato INS DNA (Figura 1A), metila...

la morte cellulare β delle isole precede lo sviluppo del diabete di tipo 1 e il rilevamento di questo processo può consentire un intervento terapeutico precoce. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di come misurare le specie di DNA INS differenzialmente metilate nel siero umano come biomarcatore della morte cellulare β.

Misura della differenzialmente metilato<em&gt; INS</em&gt; DNA Specie in campioni di siero umano come una cellula morte biomarker di Islet β

The death of islet &#946; cells is thought to underlie the pathogenesis of virtually all forms of diabetes and to precede the development of frank ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare specie di DNA della preproinsulina differenzialmente metilato nel siero umano come biomarcatore della morte delle cellule beta. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo del diabete, ad esempio: la morte delle cellule beta si verifica in un determinato momento durante lo sviluppo del diabete di tipo 1? Il vantaggio principale di questa tecnica è che, sfruttando la PCR digitale, possiamo determinare la quantità di morte delle cellule beta partendo da piccolissime quantità di siero.Dopo aver raccolto il siero da campioni di sangue umano seguendo il protocollo indicato nel testo, preparare 200 microlitri di buffer di lisi e un microlitro di poli(A) per ogni campione in un tubo da microcentrifuga. Vortexare il tubo per 15 secondi. Rimuovere i campioni di siero dal congelatore a meno 80 gradi Celsius e scongelarli a temperatura ambiente.Quindi, utilizzare PBS per portare il volume del campione di siero a 200 microlitri. Lisare i campioni aggiungendo 20 microlitri di proteasi e 200 microlitri del tampone di lisi poli(A)mix. Vortexare i tubi per otto secondi e incubare i campioni a 56 gradi Celsius per 10 minuti.Quindi, centrifugare i tubi alla velocità massima per sette secondi. Precipitare il DNA aggiungendo 230 microlitri di etanolo al 100% ai campioni e vorticare i tubi per otto secondi. Quindi, centrifugare i tubi alla velocità massima per sette secondi.Successivamente, applicare 600 µL di miscele campione sulle colonne di centrifugazione e centrifugare le colonne a 6000 × g per un minuto. Scartare il flusso passante e posizionare le colonne in provette pulite. Aggiungere 500 µL di tampone di lavaggio uno sulle colonne e centrifugare i campioni a 6000 × g per un minuto.Quindi, scartare il flusso passante e posizionare le colonne in provette pulite. Aggiungere 500 microlitri del tampone di lavaggio due sulle colonne e centrifugare alla velocità massima per tre minuti. Successivamente, posizionare le colonne in nuove provette microcentrifuga da 1,5 millilitri e centrifugare nuovamente per un minuto.Per eluire il DNA, posizionare le colonne in nuovi tubi microcentrifuga da 1,5 millilitri e aggiungere 60 microlitri di buffer di eluizione direttamente sui filtri. Dopo aver incubato le colonne a temperatura ambiente per cinque minuti, centrifugare i campioni a 6000 ×g per un minuto. Scartare la colonna e conservare i campioni fino al momento della conversione con bisolfito.Per convertire le citosine non metilate in uracili, aggiungere 130 microlitri di reagente per la conversione con bisolfito a 20 microlitri di DNA in provette PCR. Mescolare i campioni 20 volte aspirando e dispensando con una pipetta ed eseguire una breve centrifugazione per assicurarsi che non ci siano gocce sulle pareti o sul coperchio. Incubare i campioni in un bagno termostatato o in un termociclatore come indicato qui.Posizionare le colonne nei tubi di raccolta forniti e aggiungere 600 microlitri di buffer di legame sulle colonne da centrifugare. Applicare il DNA bisolfitato sulle colonne e mescolare aspirando e dispensando 10 volte con una pipetta. Successivamente, centrifugare i campioni alla velocità massima per 30 secondi e scartare il flusso passante.Successivamente, aggiungere 100 microlitri di tampone di lavaggio sulla colonna e centrifugare per 30 secondi. Poi, per rimuovere i gruppi sulfinito e completare la conversione delle citosine non metilate in uracile, aggiungere 200 microlitri di tampone di desolfinazione sulle colonne. Dopo aver lasciato i campioni a temperatura ambiente per 20 minuti, centrifugare le colonne per 30 secondi.Lavare il DNA aggiungendo 200 µL di tampone di lavaggio sulle colonne e centrifugare per 30 secondi. Successivamente, scartare il flusso e ripetere il passaggio di lavaggio. Posizionare le colonne in provette microcentrifuga da 1,5 mL ed eluire il DNA aggiungendo direttamente sul filtro delle colonne 10 µL di tampone di eluizione.Incubare i campioni per un minuto, quindi centrifugarli per 30 secondi per eluire il DNA. Scartare le colonnine e conservare i campioni. Quantificare il DNA recuperato mediante spettrofotometria a un'assorbanza di 260 nanometri.Preparare un mix master con una quantità di soluzione sufficiente per ogni campione e controllo. Includere almeno un campione contenente acqua, un campione di plasmide contenente insulina non metilata e un campione contenente una miscela uno a uno di plasmidi. Impostare le reazioni di PCR multiplex in una piastra a 96 pozzetti aggiungendo prima 19,5 microlitri di mix master in ogni pozzetto.Aggiungere 2,5 µL di campione di DNA convertito con bisolfito nelle pozzette appropriate. Successivamente, mescolare le pozzette aspirando e dispensando più volte con la pipetta. Utilizzare della pellicola di alluminio e un sigillante per piastre per sigillare la piastra e centrifugarla in uno spinner per piastre fino a quando non rimane liquido sui lati delle pozzette.Per configurare il generatore automatico di gocce sullo schermo tattile, impostare il numero di righe utilizzate toccando le righe in cui i campioni vengono caricati nei pozzetti della piastra. Per evitare contaminazioni, caricare le parti monouso da dietro verso davanti, iniziando con le cartucce posizionate lungo la riga posteriore dello strumento. Successivamente, caricare i puntali nella riga centrale.Successivamente, posizionare la piastra a 96 pozzetti nello strumento. Poi, dopo aver rimosso un blocco freddo dal congelatore a meno 20 gradi Celsius, inserire una nuova piastra a 96 pozzetti con bordo in esso. Inserire il blocco con la piastra nello strumento, accanto alla piastra con i campioni.Aggiungere l'olio al dispenser situato davanti allo strumento e selezionare il tipo di olio sul touchscreen. Premere il pulsante blu Avvia per iniziare l'esecuzione. Quindi, confermare l'allestimento della piastra e premere il pulsante Avvia Esecuzione per iniziare.Al termine della corsa, rimuovere la piastra a 96 pozzetti che contiene le goccioline appena formate e sigillarla con un foglio di alluminio utilizzando un sigillante per piastre. Eseguire ora la PCR in un termociclatore utilizzando il seguente programma. Posizionare la piastra sul lettore di goccioline e configurare il lettore cliccando sulla scheda Setup.Quindi, aprire un nuovo modello facendo clic su Modello Nuovo. Utilizzare l'editor delle pozzette per impostare i parametri di ogni campione. Assegnare a ciascun campione un nome univoco.Impostare l'esperimento su Rilevamento di Eventi Rari e impostare il master mix sulla miscela utilizzata per preparare la reazione. Assegnare un nome al Target 1, ad esempio Non Metilato, e impostare il Target 1 come sconosciuto, o U. Assegnare un nome al Target 2, ad esempio Metilato, e impostare il Target 2 come riferimento, o R. Fare clic sulla scheda Esegui per avviare l'esecuzione e inserire un nome file. Quindi, nella finestra Opzioni di Esecuzione, selezionare la chimica di rilevamento.Per analizzare i dati, aprire i risultati nella scheda Analizza e utilizzare il grafico 2D basato sui controlli positivi per analizzare i dati. Questa figura mostra i grafici a dispersione 2D corrispondenti alle goccioline per i controlli plasmidici, contenenti DNA dell'insulina convertito con bisolfito, non metilato, DNA dell'insulina metilato e un miscuglio uno a uno dei due plasmidi. Si noti che in questo pannello si verifica un lieve spostamento delle goccioline positive per FAM nel canale VIC, indicativo della sonda per il DNA dell'insulina metilato.Analogamente, si osserva uno spostamento molto lieve delle goccioline positive per VIC nel canale FAM, indicante una crossreattività della sonda per il DNA non metilato con il DNA metilato. Per dimostrare la linearità degli iniziatori, sono state utilizzate miscele dei due plasmidi in diverse ordini di grandezza nelle reazioni di PCR. Come mostrato qui, concentrazioni variabili di un plasmide possono essere rilevate in modo lineare in presenza di una quantità costante del secondo plasmide.In questa figura, sono stati analizzati campioni di quattro individui con diabete di tipo 1 ad esordio recente e quattro campioni di controllo privi di diabete di tipo 1. I dati mostrano che gli individui con diabete di tipo 1 presentano livelli elevati sia di DNA di insulina non metilato che metilato rispetto ai controlli, come già dimostrato in precedenza. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore per 30 campioni se effettuata correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di evitare contaminazioni durante tutte le fasi. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo del diabete per esplorarne l'utilizzo come biomarcatore per lo sviluppo del diabete di tipo 1. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come determinare la quantità di morte cellulare beta misurando la preproinsulina non metilata e metilata nel DNA libero da cellule proveniente dal siero umano.Non dimenticare che lavorare con tamponi per l'estrazione del DNA può essere estremamente pericoloso e che è sempre necessario adottare precauzioni, come indossare guanti e camice da laboratorio, e non utilizzare agenti disinfettanti contenenti candeggina, durante l'esecuzione di questa procedura.

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Questo video dimostra il protocollo di immunoprecipitazione DNA metilato (MeDIP). MeDIP è una procedura di due giorni che estrae selettivamente i frammenti di DNA metilato da un campione di DNA genomico utilizzando anticorpi con specificità per 5-metilcitosina (anti-5 MC).

Immunoprecipitazione DNA metilato

Cellulo-mediata linfocitotossicità (LMC) test può essere usato per testare le risposte autoreattivi e lo studio dei meccanismi di morte cellulare in vitro. Tuttavia, utilizzando tecniche confocale live-cell immagini microscopiche con coloranti fluorescenti, il tipo e la cinetica di morte cellulare così come i percorsi utilizzati possono essere studiati in maggiore dettaglio.

Metodi per valutare la morte delle cellule beta Mediata da linfociti T citotossici

Questo video mostra il rilevamento dell'elettrochemiluminescenza degli autoanticorpi delle isole nel siero umano. Gli anticorpi nel siero collegano l'antigene coniugato al rutenio con l'antigene di cattura biotinilato, formando complessi che vengono rilevati mediante misurazioni di elettrochemiluminescenza.

Rilevamento di autoanticorpi delle isole umane mediante un saggio di elettrochemiluminescenza

Microdissezione laser è una tecnica che consente il recupero di cellule scelte da piccole quantità di parenchima. Qui si descrive un protocollo per l'acquisizione di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici da utilizzare per gli studi di trascrittomica. Il nostro protocollo migliora l'autofluorescenza intrinseca delle cellule beta umane, facilitando così la loro collezione.

Protocollo migliorato per microdissezione laser di isole pancreatiche umane da campioni chirurgici

Presentiamo qui un protocollo per l'isolamento delle isole dal modello murino di diabete di tipo 2, Leprdb e i dettagli di un test su cellule vive per la misurazione della secrezione di insulina da isole intatte che utilizza la microscopia a 2 fotoni.

LEPR<sup&gt; Db</sup&gt; Mouse Modello di diabete di tipo 2: pancreas isolamento Islet e live-cella 2-Photon Imaging di isolotti Intact

Qui, presentiamo la metodologia per generare e somministrare composti di microsfere di acido poli(lattico-co-glicolico) caricate con interessi (PLGA) a isole di topo intatte in coltura con successiva analisi di immunofluorescenza della proliferazione delle cellule β. Questo metodo è adatto per determinare l'efficacia dei mitogeni a cellule β candidate.

Amministrazione sostenuta di Mitogeni β-cellule per Intact isole di topo<em&gt; Ex Vivo</em&gt; Uso biodegradabile poli (acido lattico-co-glicolico) Microsfere

Qui, abbiamo presentato i metodi per rilevare i autoantibodies di insule umane utilizzando dosaggi di elettrochemiluminescenza (ECL). Il protocollo usato per predire il diabete di tipo 1, può essere estesa, per rilevare gli autoanticorpi per altre malattie autoimmuni.

Saggi di elettrochemiluminescenza autoanticorpi anti-umano dell'isolotto

Qui, presentiamo un protocollo per generare dati trascrittomi su larga scala di alta qualità e su larga scala di singole cellule da isole pancreatiche umane isolate utilizzando una tecnologia di sequenziamento di RNA microfluidico a celle a goccia.

Sequenziamento dell'RNA a singola cellula e analisi delle isole pancreatiche umane

Questo studio utilizza marcatori di morte cellulare e apoptosi basati sulla fluorescenza multi-colorazione combinati con la microscopia confocale per valutare l'apoptosi indotta da citochine e la morte specifica delle cellule β nelle isole pancreatiche. Rivela cambiamenti spaziali e temporali nella morte cellulare e nell'apoptosi in risposta a stimoli extracellulari.

Trattamento isolato delle isole pancreatiche e misurazione dell'apoptosi

Qui, descriviamo le impostazioni per monitorare in parallelo la bioluminescenza circadiana e l'attività secretoria delle cellule insulari umane e dei miotubi primari. Per questo, abbiamo impiegato la somministrazione genica lentivirale di un reporter di clock con nucleo di luciferasi, seguita dalla sincronizzazione in vitro e dalla raccolta del terreno di deflusso mediante perifusione cellulare continua.

Misura parallela di circadiano Clock espressione genica e la secrezione dell&#39;ormone in colture cellulari primarie umane

Scopri come misurare il DNA differenzialmente metilato di INS nel siero umano come biomarker di morte delle cellule β. Questo metodo utilizza la PCR digitale per rilevare precocemente il diabete di tipo 1.

Misura della differenzialmente metilato

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