Name: Osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Scopri un protocollo per osservare il comportamento di accoppiamento in Bursaphelenchus xylophilus, nematode del pino. Questo metodo consente di ottenere adulti vergini per studi comportamentali accurati in biologia.

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Najie Zhu e Liqun Bai contribuito in maniera uguale a questo lavoro. Questo lavoro è stato sostenuto finanziariamente dal Fondo speciale per la ricerca scientifica forestale nel benessere pubblico (201.204.501) e la National Science Foundation naturale della Cina (31.170.604, 31.270.688 e 31.570.638). Ringraziamo il Dott Holighaus Gerrit e il Dr. Danielle Hickford per i loro utili suggerimenti sulla scrittura inglese.

1. Acquisizione di Virgin adulti Nematodi <ol><li> Nematode del pino isolato e condizioni di coltura NOTA: Il B. xylophilus isolare Nxy61 è stato originariamente estratto da un malato massoniana Pinus nella zona di Ningbo della provincia di Zhejiang in Cina. <ol><li> Preparare Potato Dextrose Agar (PDA, vedere la Tabella dei Materiali) piastre per la coltivazione di Botrytis cinerea. </li><li> Per l&#39;inoculazione, pugno un pezzo di tappeto funghi con diametro di 10 mm da un tappeto di B. cinerea e metterlo al centro di una nuova piastra PDA. Culture B. cinerea per 5 d a 25 ° C al buio. </li><li> Cultura i nematodi pineta nella capsula di Petri preparato contenente B. cinerea a 25 ° C al buio. </li></ol></li><li> Acquisizione di B. xylophilus uova <ol><li> Posizionare un tubo di gomma bloccato sotto un imbuto e tenere l&#39;imbuto preparata in un rack per montare ilApparecchio imbuto Baermann. Inserire due strati di carta filtro, invece di garza in bocca dell&#39;imbuto. </li><li> Trasferire le colture fungine per la messa a punto imbuto e aggiungere acqua fino a quando il tappeto fungina è immerso. Attendere 2 h, e nematodi usciranno dalla cultura fungina, attraversare la carta da filtro, e stabilirsi nella parte più bassa dell&#39;imbuto Baermann. </li><li> Raccogliere il primo paio di gocce di acqua dal fondo del tubo in un tubo da 15 ml e raccogliere nematodi rilasciando lentamente il morsetto sul tubo. </li><li> Centrifugare le collezioni precedenti a 3.000 xg per 2 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Rimuovere lo strato superiore di acqua con una pipetta e risospendere con 1 ml di sterile bidistillata (dd) H 2 O. </li><li> Con una pipetta, trasferire la risospensione sopra per un piatto di Petri nuovo vetro (6 cm di diametro). Aggiungere 3 mL di soluzione sterile dd H 2 O alla piastra di Petri per garantire che i nematodi sono in grado di nuotare liberamente. </li><li> Tenere i nematodi nel bicchieres Petri per 10 min a 25 ° C al buio. Le uova saranno deposte da femmine gravide. A causa della loro superficie glicoproteina, le uova si attacchi al fondo del piatto di vetro Petri. </li><li> Rimuovere l&#39;acqua e vermi con attenzione, senza disturbare le uova. Aggiungere 3 ml di sterile dd H 2 O per il piatto di vetro Petri immediatamente per evitare che le uova si secchi. </li><li> Ripetere il passaggio 1.2.8 3x per rimuovere tutte le larve e gli adulti, e di ottenere le uova puri. Aggiungere un supplemento di 2 ml (5 ml in totale) di sterile dd H 2 O alla piastra di Petri. </li></ol></li><li> Acquisizione dei giovani quarto stadio (larve J4) <ol><li> Hatch le uova raccolte per 24 ore al buio a 25 ° C per ottenere J2 larve. </li><li> Trasferire le larve J2 con una pipetta in una provetta 15 mL, centrifugare a 3000 xg per 2 minuti, e rimuovere lo strato superiore di acqua. </li><li> Risospendere le larve J2 con 200 ml di sterile dd H 2 O, e poi trasferirlila piastra PDA contenente B. cinerea. </li><li> Cultura larve J2 per 52 ore a 25 ° C al buio. A questo punto di tempo, la maggior parte delle larve J2 avrà sviluppato nella fase iniziale della J4 larve. </li></ol></li><li> Acquisizione di nematodi Adulto Vergine <ol><li> Preparare un ago per la raccolta di nematodi disegnando un capillare di vetro dopo il riscaldamento sopra un bruciatore di alcol. NOTA: La punta di questo ago capillare di solito deve essere di 50 micron di diametro, circa la larghezza del corpo di un nematode adulti, in modo che possa essere utilizzata come strumento per prelevare un singolo nematode. </li><li> Assemblare un imbuto Baermann ed estrarre nematodi delle culture fungine per 2 ore, come descritto ai punti 1.2.1 - 1.2.3. </li><li> Trasferire il J4 con acqua in un piatto pulito Petri. </li><li> Osservare i nematodi allo stereomicroscopio e distinguere tra maschi e femmine per la morfologia dei genitali, come descritto da Mamiya e Kiyohara 8 (Figura 1 </strong&gt;). Prendete una nematode del sesso desiderato con l&#39;ago capillare preparato e trasferirla alla piastra fungine-cultura adeguata per i maschi o femmine. NOTA: Non ci sono più donne che uomini, con la percentuale di femmine a 60 - 70%. La vulva femminile è ovviamente diversa dalla spicule maschile. Rispetto al l&#39;adulto, il spicule o vulva in fase iniziale J4 è più piccolo, ma possono ancora essere facilmente visibile e distinto. Il nematode è sempre in movimento nell&#39;acqua, che a volte aumenta la difficoltà di distinguere maschi e femmine. </li><li> Cultura larve J4 per altre 24 ore a 25 ° C al buio. NOTA: Tutte le nematodi dovrebbero sviluppare in adulti, ma dal momento che sono disaccoppiati, essi sono considerati come adulti vergini. </li><li> Assemblare due Baermann imbuti ed estrarre i adulti vergini dalle colture fungine per 2 ore, come descritto ai punti 1.2.1 - 1.2.3, e trasferire i maschi adulti e femmine vergini in due piatti separati puliti Petri. </li></ol&gt; </li></ol> 2. Osservazione e registrazione video di comportamento di accoppiamento <ol><li> Preparare diverse diapositive concave e aggiungere 200 ml di sterile dd H 2 O a ciascuno dei loro pozzi. </li><li> Sollevare il preparato maschio adulto vergini o femminile e con un ago capillare e mettere solo un nematode nell&#39;acqua di ogni diapositiva concava. </li><li> Mantenere le vergini adulti all&#39;interno del pozzo per 1 ora per far loro adattarsi al nuovo ambiente acquoso. </li><li> Associare un maschio e femmina vergine trasferendo uno di loro da un bene ad un altro con una pipetta. </li><li> Osservare il comportamento di accoppiamento del 1♀ + 1♂ combinazione nella diapositiva concava allo stereomicroscopio. </li><li> Per analizzare l&#39;efficienza di accoppiamento degli adulti vergini, calcolare il loro tasso di successo di accoppiamento (R) e confrontarlo con quello delle coppie di adulti selezionati in modo casuale. Calcolare R come la percentuale di repliche in cui si è osservata copulazione rispetto al numero totale di repliche studiati. </li><li&gt; Per studiare scelta l&#39;accoppiamento e la concorrenza intrasessuale, gruppo e osservare nematodi vergini di due diverse combinazioni: 1♀ + 3♂ e 3♀ + 1♂. </li><li> Al fine di raccogliere dati per l&#39;analisi qualitativa e quantitativa, filmare il comportamento di accoppiamento con il video microscopia. Normalmente, l&#39;intero processo di accoppiamento, dal momento in cui i nematodi sono posti nel pozzo della slitta concava al momento in cui si allontanano dopo l&#39;accoppiamento, viene completata entro 2 ore. Pertanto, registrare il processo di accoppiamento continuo per almeno 2 ore come una replica. Completa almeno 30 replicati in totale per ciascuna combinazione. NOTA: Aggiungere più sterile dd H 2 O (di solito 50 mL) ogni 0,5 h al pozzo per compensare l&#39;evaporazione durante il processo di registrazione. </li></ol> 3. Raccolta dati <ol><li> Guarda tutti i video accuratamente sullo schermo del computer e caratterizzare i sub-comportamenti qualitativamente. </li><li> Misurare la durata di accoppiamento utilizzando thfunzione e frame-by-frame del videoregistratore. sottrarre manualmente il tempo a partire dal punto finale. </li><li> Per la combinazione 1♀ + 1♂, analizzare ogni registrazione video e misurare la durata dei seguenti eventi: <ol><li> Misurare la durata di ricerca (cioè, il tempo da quando la femmina e maschio sono introdotti nel pozzo del vetrino concava al momento incontrano e contatto tra loro). </li><li> Misurare la durata del contatto (cioè, il tempo dal primo contatto al momento in cui il maschio è esattamente posizionato vulva della femmina del primo accoppiamento). </li><li> Misurare la durata di copulare (cioè, il tempo da quando il maschio è posizionata precisamente vulva della femmina fino a che scivola dal corpo della femmina dopo l&#39;eiaculazione). Nota: alcuni nematodi possono copulare più volte in 2 ore. In tali casi, misurare la durata di copulazione dalla prima copulazione alla fine del last uno, compreso il tempo in mezzo. </li><li> Misurare la durata di persistente (cioè, il periodo successivo accoppiamento finché il nuoto maschio e femmina distanti l&#39;uno dall&#39;altro e sono separati da una distanza di più di lunghezza del corpo dei nematodi &#39;(di solito 1 mm)). </li></ol></li><li> Contare la frequenza copulazione e la durata di ogni accoppiamento e la durata media di tutti copulazioni in 2 h per ciascuna delle diverse combinazioni (cioè, 1♀ + 1♂, 3♀ + 1♂ e 1♀ + 3♂). </li><li> Calcolare il tasso di successo di accoppiamento per il primo contatto (P) per le diverse combinazioni come il tasso di successo di accoppiamento dopo il primo contatto, che è condotto immediatamente e senza alcuna interruzione. Nella fase a contatto, più contatti possono essere osservati prima copula reale. <ol><li> Quando la distanza tra due individui è superiore alla lunghezza del corpo, si consideri un contatto essere finita. Per una replica, record di P come il 100% quando l&#39;accoppiamento is osserva immediatamente dopo il primo contatto, senza interruzione, o 0,00% se è stata osservata alcuna copulazione o se c&#39;era copulazione ma dopo due o più contatti. NOTA: Ci sono stati 30 repliche per ogni combinazione qui descritta. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Tokushige, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bursaphelenchus+sp.+in+the+wood+of+dead+pine+trees%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Jap.+For.+Soc%22%5BJournal%5D)">Bursaphelenchus sp. in the wood of dead pine trees.</a> J. Jap. For. Soc. 51, 193-195 (1969).</li>
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<li>Mamiya, Y., Kiyohara, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Description+of+Bursaphelenchus+lignicolus.+n.+sp.+%28Nematoda%3A+Aphelenchoididae%29+from+pine+wood+and+histophathology+of+nematode-infested+trees%5BTitle%5D)+AND+%22Nematologica%22%5BJournal%5D)">Description of Bursaphelenchus lignicolus. n. sp. (Nematoda: Aphelenchoididae) from pine wood and histophathology of nematode-infested trees.</a> Nematologica. 18, 120-124 (1972).</li>
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<li>Shinya, R., Chen, A., Sternberg, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sex+attraction+and+mating+in+Bursaphelenchus+okinawaensis+and+B.+xylophilus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Nematol%22%5BJournal%5D)">Sex attraction and mating in Bursaphelenchus okinawaensis and B. xylophilus.</a> J. Nematol. 47 (3), 176-183 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

test comportamentali sono un aspetto fondamentale di ecologia chimica, la neurobiologia, la biologia molecolare e la genetica. Nematodi, e in particolare C. elegans, sono ampiamente utilizzati per gli studi in questi settori. Il comportamento di accoppiamento di C. elegans è stato studiato in precedenza 10-11. Tuttavia, B. xylophilus è gonochoristic e diverso dagli ermafroditi C. elegans, e il suo processo di accoppiamento ha diverse caratteristiche comportamentali 9.<...

Il nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus (Steiner e Buhrer) Nickle, è una delle specie invasive più distruttive, che causa l'appassimento e la morte dei pini. Si ritiene che questo nematode patogeno sia originario degli Stati Uniti, ma è stato trasportato in diversi paesi, tra cui Cina, Giappone, Corea del Sud e Portogallo. Recentemente, è stato segnalato anche in Spagna, uccidendo milioni di pini con enormi perdite economiche e minacciando la produzione forestale e la stabilità ecologica1-5.
Una volta che un pino ospite viene infettato dai nematodi del pino, migliaia di milioni di prole si propagano rapidamente all'interno del tronco. Ciò provoca una disfunzione dello xilema, con conseguente appassimento e infine la morte dell'albero ospite6. Tuttavia, attualmente non esiste un modo efficace per controllare questa malattia. Il comportamento di accoppiamento potrebbe svolgere un ruolo importante nell'elevata fecondità di questo nematode7. Abbiamo quindi studiato il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus in laboratorio, cercando di trovare un modo efficace per disturbare il suo accoppiamento e diminuire la sua fecondità. 
Questo protocollo ha lo scopo di introdurre i metodi dettagliati su come ottenere gli adulti vergini di B. xylophilus e su come osservare e analizzare il comportamento di accoppiamento utilizzando un videoregistratore e uno stereomicroscopio. Questo protocollo può essere utilizzato anche come riferimento per studi comportamentali di altri nematodi.

<table><tbody><tr><td>B. xylophilus isolato Nxy61</td><td></td><td></td><td>Estratto da Pinus massoniana nell'area di Ningbo in Cina</td></tr><tr><td>Ceppo</td><td></td><td></td> di muffa grigia <td>Ottenuto da Forestry Academy of China</td></tr><tr><td>Baermann imbuti</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>falcon tubi Sengong</td> centrifuga <td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>pipetta</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sterile dd H2O</td><td></td><td></td><td>Sterilizzato ad alta pressione di vapore a 121 gradi; C per 30 min.</td></tr><tr><td>Piastre di Petri</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PDA medio</td><td>Huankai Bio.</td><td>021050</td><td></td></tr><tr><td>incubatore</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flusso laminare</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>capillare in vetro</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stereoscopio</td><td>Leica</td><td>LED5000 RL</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio invertito</td><td>Zeiss</td><td>A1</td><td></td></tr><tr><td>vetrini concavi</td><td>Sengong</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino, bursaphelenchus xylophilus

Observation and Quantification of Mating Behavior in the Pinewood Nematode, Bursaphelenchus xylophilus

Un metodo per osservare e quantificare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus, è stato istituito allo stereomicroscopio. Per migliorare l&#39;efficienza di accoppiamento di B. Xylophilus e per aumentare le possibilità di osservazione accoppiamento, adulti vergini sono stati coltivati e utilizzati per l&#39;indagine. Le uova sono stati ottenuti mantenendo i nematodi in acqua e permettendo le femmine di deporre le uova per 10 min. Le larve di secondo stadio (J2) sono stati sincronizzati incubando le uova per 24 ore a 25 ° C al buio, e il primo J4 sono stati ottenuti coltivando la J2 con muffa grigia, Botrytis cinerea, per un altro 52 h. A questo punto di tempo, la maggior parte dei nematodi J4 potrebbero essere chiaramente distinti come maschio o femmina usando la loro morfologia genitale. Il maschio e la femmina J4 sono stati raccolti e coltivate separatamente in due diverse piastre di Petri per 24 ore per ottenere nematodi adulti vergini. Un maschio e una femmina vergine vergine sono stati associati in una goccia di water nel pozzo di una diapositiva concava. Il comportamento di accoppiamento è stato girato con un videoregistratore allo stereomicroscopio. L&#39;intera durata del processo di accoppiamento era 82,8 ± 3,91 min (media ± SE) e potrebbe essere diviso in 4 diverse fasi: ricerca, contatto, che copulano, e persistente. Il verbale medi di durata erano 21,8 ± 2,0, 28,0 ± 1,9, 25,8 ± 0,7 e 7,2 ± 0,5, rispettivamente. Undici sub-comportamenti sono stati descritti: crociera, si avvicina, incontrando, toccando, hoop, localizzare, allegando, eiaculazione, la separazione, quiescenza, e il roaming. È interessante notare che, evidente la concorrenza intra-sessuale è stata osservata quando una femmina è stata raggruppata con 3 maschi o un maschio con 3 femmine. Questo protocollo è utile e prezioso, non solo in indagare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus, ma anche in qualità di riferimento per studi comportamentali degli altri nematodi.

Il tasso di successo di accoppiamento (R) degli adulti vergini era 86,67% in media, che era significativamente più elevata di quella degli adulti selezionati casualmente: 13,33 ± 4,65% (F = 1301,71, df = 1, p = 0,0001) (Figura 2). Questa scoperta suggerisce che è più facile osservare il comportamento di accoppiamento di B. xylophilus con gli adulti vergini che con gli adulti selezionati casualmente. <p class="jove_content" fo:keep-together....

Viene presentato un protocollo per studiare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Le caratteristiche comportamentali di B. xylophilus sono descritte nel processo di accoppiamento.

Osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

A method for observing and quantifying the mating behavior of the pinewood nematode, Bursaphelenchus xylophilus, was established under a stereomicroscope. ...

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Questo metodo può aiutare a far progredire gli studi psicologici sul nematode. Si occupa in particolare dell'osservanza del comportamento di accoppiamento del nematode del pino.Il vantaggio principale di questa tecnica è che si possono ottenere adulti vergini, il che rende molto più facile osservare il comportamento di accoppiamento degli adulti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono puramente allo studio più ampio dei nematodi, perché hanno comportamenti simili nei cicli di vita. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale, poiché l'acquisizione di nematodi adulti vergini è difficile perché i vincoli dei nematodi dello sviluppo richiedono pratica e non è facile distinguere con precisione i maschi dalle femmine nei giovani all'inizio del primo stadio.Per coltivare i nematodi del pino, preparare prima le piastre di agar destrosio di patate. Per inoculare una piastra, prendi a pugni un pezzo di tappetino fungino con un diametro di 10 millimetri da un tappetino per betritus senaria e mettilo al centro di una nuova piastra PDA. Coltiva il tappetino fungino per cinque giorni a 25 gradi Celsius al buio.Dopo cinque giorni, aggiungi i nematodi del pino alla capsula di Petri preparata e coltivali per tre giorni a 25 gradi Celsius al buio. Per isolare i nematodi dal fungo, preparare prima uno strumento di raccolta. Posizionare un tubo di gomma clamped sotto un imbuto e tenere l'imbuto preparato in una rastrelliera per assemblare l'apparato a imbuto Baermann.Quindi, metti due strati di carta da filtro invece di una garza nella bocca dell'imbuto. Ora, trasferisci le colture fungine nella configurazione a imbuto e aggiungi acqua fino a quando il tappetino fungino non è immerso. Dopo due ore, i nematodi usciranno dalla coltura fungina, attraverseranno la carta da filtro e si depositeranno nella parte più bassa dell'imbuto di Baermann.Raccogli i nematodi posizionando un tubo da 15 millilitri sotto l'imbuto, quindi rilasciando lentamente la pinza per raccogliere qualche goccia d'acqua, che conterrà i nematodi. Centrifugare le raccolte di nematodi a 3.000 G per due minuti a temperatura ambiente. Quindi aspartare il livello superiore dell'acqua e risospendere i vermi in un millilitro d'acqua.Trasferire la sospensione dei nematodi in un piatto di vetro di sei centimetri e aggiungere tre millilitri di acqua per aiutare i nematodi a nuotare liberamente. Ora raccogli le uova per fare brodi vergini. Trasferisci il piatto in un'incubatrice scura e lascia che le femmine gravide depongano le uova per 10 minuti.A causa della loro superficie glicoproteica, le uova si attaccheranno al vetro. Quindi rimuovere l'acqua con i vermi con cura per evitare di disturbare le uova attaccate al piatto. Quindi, aggiungere rapidamente 3 millilitri di acqua al piatto per evitare che le uova si secchino.Ripeti questo processo di pulizia delle uova almeno tre volte, per rimuovere tutte le larve e gli adulti e ottenere le uova pure. Alla raccolta delle uova pure lavate, aggiungere cinque millilitri di acqua e procedere con lo sviluppo delle uova al buio a 25 gradi Celsius. 24 ore dopo l'inizio della coltura delle uova, raccogli le larve J2 schiuse.Trasferire con cura le larve J2 in un tubo da 15 millilitri. Quindi centrifugare la raccolta a 3.000 G per due minuti. Sparare lo strato superiore di acqua e aggiungere nuovamente 200 microlitri di acqua.Quindi, coltivare le larve J2 su una piastra PDA preparata con un tappetino di funghi. Dopo 52 ore, la maggior parte delle larve J2 si sarà sviluppata in larve J4 allo stadio iniziale. Assemblare un imbuto di Baermann ed estrarre i nematodi dalle colture fungine per due ore, come descritto in precedenza.Nell'attesa, prepara un ago per raccogliere i vermi. Estrarre una punta da un capillare di vetro riscaldato su un bruciatore ad alcool. La punta deve avere un diametro di circa 50 micron, all'incirca la larghezza del corpo di un nematode adulto.Dopo due ore, trasferire le larve J4 in una capsula di Petri pulita come descritto in precedenza. Ora, sesso i nematodi sotto uno stereomicroscopio. Circa due terzi delle larve sono solitamente femmine.La vulva della femmina è ovviamente diversa dall'anatomia del maschio, ma poiché i vermi sono molto attivi, il sessaggio richiederà pratica. Il passo più critico di questo protocollo è quello di distinguere e separare con precisione i maschi dalle femmine all'inizio del primo stadio. Altrimenti, ci sarà mescolanza e cattiva, una volta che diventeranno adulti.E questo rende difficile osservare l'accoppiamento. A poco a poco, raccogli e trasferisci i vermi in una goccia d'acqua su uno scivolo per maschi o femmine. Per garantire il successo, due persone diverse dovrebbero ricontrollare l'assegnazione del sesso.Ora, trasferisci la goccia d'acqua contenente i vermi sessati su un'appropriata piastra di coltura fungina. Quindi, alleva le vergini per altre 24 ore prima di studiare il loro comportamento di accoppiamento. Per osservare il comportamento di accoppiamento dei nematodi di pino, preparare prima diversi vetrini concavi aggiungendo 200 microlitri d'acqua a ciascuno dei loro pozzetti.Quindi, scegli un singolo adulto vergine preparato e trasferiscilo su un vetrino preparato. Tenere gli adulti vergini all'interno del pozzo per un'ora per farli adattare al nuovo ambiente acquoso. Dopo un'ora, aggiungere al pozzetto un singolo adulto vergine del sesso opposto, utilizzando una pipetta.Quindi, osservare il comportamento di accoppiamento al microscopio stereoscopico e filmare il comportamento per l'analisi quantitativa. L'intero processo di accoppiamento si conclude solitamente in due ore. Ogni 30 minuti, aggiungere 50 microlitri di acqua per compensare l'evaporazione.Per studiare la scelta dell'accoppiamento e la competizione intersessuale, raggruppare e osservare nematodi vergini di due diverse combinazioni. Il tasso di successo dell'accoppiamento degli adulti vergini era di circa l'87%, molto più alto di quello degli adulti selezionati casualmente. Le coppie hanno impiegato in media 83 minuti per completare l'intero processo di accoppiamento, che comprende quattro diverse fasi.Cercare, contattare, copulare e soffermarsi. All'interno di queste fasi, si possono osservare molti modelli specifici di comportamento. Quando una femmina incontrava diversi maschi, c'era un'ovvia scelta di accoppiamento.La femmina di solito usa la testa per contattare un maschio, di solito alla testa, al corpo, alla coda e alla regione genitale. La femmina poi si accoppiava con il maschio, o lo lasciava rapidamente, e nuotava verso un altro maschio. Le percentuali di successo dell'accoppiamento sono state misurate dopo il primo contatto per le diverse combinazioni di nematodi.Si è verificata anche la competizione intersessuale. Quando una femmina vergine è stata mescolata con tre maschi vergini, i maschi hanno cercato di avvicinarsi e contattare la femmina il più possibile, per avere la possibilità di accoppiarsi con lei. Quando la vulva era occupata, gli altri maschi cercavano di disturbare il processo di accoppiamento usando violente oscillazioni del corpo o trascinandoli per separarli.La competizione intersessuale femminile è stata vista come più o meno simile alla competizione intersessuale maschile. A causa della competizione intersessuale, le frequenze di copulazione con le diverse combinazioni erano significativamente diverse. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada all'esplorazione dell'ecologia comportamentale nei nematodi.Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in 12 giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di separare con precisione i maschi dalle femmine, i primi giovani in quattro fasi per ottenere adulti vergini.

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