Osservazione e quantificazione di comportamento di accoppiamento nel nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare il comportamento di accoppiamento del nematode del pino, Bursaphelenchus xylophilus. Questo metodo può aiutare a far progredire gli studi psicologici sul nematode. Si occupa in particolare dell'osservanza del comportamento di accoppiamento del nematode del pino.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che si possono ottenere adulti vergini, il che rende molto più facile osservare il comportamento di accoppiamento degli adulti. Le implicazioni di questa tecnica si estendono puramente allo studio più ampio dei nematodi, perché hanno comportamenti simili nei cicli di vita. La dimostrazione di questo metodo è fondamentale, poiché l'acquisizione di nematodi adulti vergini è difficile perché i vincoli dei nematodi dello sviluppo richiedono pratica e non è facile distinguere con precisione i maschi dalle femmine nei giovani all'inizio del primo stadio.

Per coltivare i nematodi del pino, preparare prima le piastre di agar destrosio di patate. Per inoculare una piastra, prendi a pugni un pezzo di tappetino fungino con un diametro di 10 millimetri da un tappetino per betritus senaria e mettilo al centro di una nuova piastra PDA. Coltiva il tappetino fungino per cinque giorni a 25 gradi Celsius al buio.

Dopo cinque giorni, aggiungi i nematodi del pino alla capsula di Petri preparata e coltivali per tre giorni a 25 gradi Celsius al buio. Per isolare i nematodi dal fungo, preparare prima uno strumento di raccolta. Posizionare un tubo di gomma clamped sotto un imbuto e tenere l'imbuto preparato in una rastrelliera per assemblare l'apparato a imbuto Baermann.

Quindi, metti due strati di carta da filtro invece di una garza nella bocca dell'imbuto. Ora, trasferisci le colture fungine nella configurazione a imbuto e aggiungi acqua fino a quando il tappetino fungino non è immerso. Dopo due ore, i nematodi usciranno dalla coltura fungina, attraverseranno la carta da filtro e si depositeranno nella parte più bassa dell'imbuto di Baermann.

Raccogli i nematodi posizionando un tubo da 15 millilitri sotto l'imbuto, quindi rilasciando lentamente la pinza per raccogliere qualche goccia d'acqua, che conterrà i nematodi. Centrifugare le raccolte di nematodi a 3.000 G per due minuti a temperatura ambiente. Quindi aspartare il livello superiore dell'acqua e risospendere i vermi in un millilitro d'acqua.

Trasferire la sospensione dei nematodi in un piatto di vetro di sei centimetri e aggiungere tre millilitri di acqua per aiutare i nematodi a nuotare liberamente. Ora raccogli le uova per fare brodi vergini. Trasferisci il piatto in un'incubatrice scura e lascia che le femmine gravide depongano le uova per 10 minuti.

A causa della loro superficie glicoproteica, le uova si attaccheranno al vetro. Quindi rimuovere l'acqua con i vermi con cura per evitare di disturbare le uova attaccate al piatto. Quindi, aggiungere rapidamente 3 millilitri di acqua al piatto per evitare che le uova si secchino.

Ripeti questo processo di pulizia delle uova almeno tre volte, per rimuovere tutte le larve e gli adulti e ottenere le uova pure. Alla raccolta delle uova pure lavate, aggiungere cinque millilitri di acqua e procedere con lo sviluppo delle uova al buio a 25 gradi Celsius. 24 ore dopo l'inizio della coltura delle uova, raccogli le larve J2 schiuse.

Trasferire con cura le larve J2 in un tubo da 15 millilitri. Quindi centrifugare la raccolta a 3.000 G per due minuti. Sparare lo strato superiore di acqua e aggiungere nuovamente 200 microlitri di acqua.

Quindi, coltivare le larve J2 su una piastra PDA preparata con un tappetino di funghi. Dopo 52 ore, la maggior parte delle larve J2 si sarà sviluppata in larve J4 allo stadio iniziale. Assemblare un imbuto di Baermann ed estrarre i nematodi dalle colture fungine per due ore, come descritto in precedenza.

Nell'attesa, prepara un ago per raccogliere i vermi. Estrarre una punta da un capillare di vetro riscaldato su un bruciatore ad alcool. La punta deve avere un diametro di circa 50 micron, all'incirca la larghezza del corpo di un nematode adulto.

Dopo due ore, trasferire le larve J4 in una capsula di Petri pulita come descritto in precedenza. Ora, sesso i nematodi sotto uno stereomicroscopio. Circa due terzi delle larve sono solitamente femmine.

La vulva della femmina è ovviamente diversa dall'anatomia del maschio, ma poiché i vermi sono molto attivi, il sessaggio richiederà pratica. Il passo più critico di questo protocollo è quello di distinguere e separare con precisione i maschi dalle femmine all'inizio del primo stadio. Altrimenti, ci sarà mescolanza e cattiva, una volta che diventeranno adulti.

E questo rende difficile osservare l'accoppiamento. A poco a poco, raccogli e trasferisci i vermi in una goccia d'acqua su uno scivolo per maschi o femmine. Per garantire il successo, due persone diverse dovrebbero ricontrollare l'assegnazione del sesso.

Ora, trasferisci la goccia d'acqua contenente i vermi sessati su un'appropriata piastra di coltura fungina. Quindi, alleva le vergini per altre 24 ore prima di studiare il loro comportamento di accoppiamento. Per osservare il comportamento di accoppiamento dei nematodi di pino, preparare prima diversi vetrini concavi aggiungendo 200 microlitri d'acqua a ciascuno dei loro pozzetti.

Quindi, scegli un singolo adulto vergine preparato e trasferiscilo su un vetrino preparato. Tenere gli adulti vergini all'interno del pozzo per un'ora per farli adattare al nuovo ambiente acquoso. Dopo un'ora, aggiungere al pozzetto un singolo adulto vergine del sesso opposto, utilizzando una pipetta.

Quindi, osservare il comportamento di accoppiamento al microscopio stereoscopico e filmare il comportamento per l'analisi quantitativa. L'intero processo di accoppiamento si conclude solitamente in due ore. Ogni 30 minuti, aggiungere 50 microlitri di acqua per compensare l'evaporazione.

Per studiare la scelta dell'accoppiamento e la competizione intersessuale, raggruppare e osservare nematodi vergini di due diverse combinazioni. Il tasso di successo dell'accoppiamento degli adulti vergini era di circa l'87%, molto più alto di quello degli adulti selezionati casualmente. Le coppie hanno impiegato in media 83 minuti per completare l'intero processo di accoppiamento, che comprende quattro diverse fasi.

Cercare, contattare, copulare e soffermarsi. All'interno di queste fasi, si possono osservare molti modelli specifici di comportamento. Quando una femmina incontrava diversi maschi, c'era un'ovvia scelta di accoppiamento.

La femmina di solito usa la testa per contattare un maschio, di solito alla testa, al corpo, alla coda e alla regione genitale. La femmina poi si accoppiava con il maschio, o lo lasciava rapidamente, e nuotava verso un altro maschio. Le percentuali di successo dell'accoppiamento sono state misurate dopo il primo contatto per le diverse combinazioni di nematodi.

Si è verificata anche la competizione intersessuale. Quando una femmina vergine è stata mescolata con tre maschi vergini, i maschi hanno cercato di avvicinarsi e contattare la femmina il più possibile, per avere la possibilità di accoppiarsi con lei. Quando la vulva era occupata, gli altri maschi cercavano di disturbare il processo di accoppiamento usando violente oscillazioni del corpo o trascinandoli per separarli.

La competizione intersessuale femminile è stata vista come più o meno simile alla competizione intersessuale maschile. A causa della competizione intersessuale, le frequenze di copulazione con le diverse combinazioni erano significativamente diverse. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada all'esplorazione dell'ecologia comportamentale nei nematodi.

Una volta padroneggiata, questa procedura può essere completata in 12 giorni, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di separare con precisione i maschi dalle femmine, i primi giovani in quattro fasi per ottenere adulti vergini.