Name: Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti Clostridium difficile R20291 Strain (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 51 s
Description: Scopri il modello murino con cefoperazone per studiare l'infezione da Clostridium difficile con il ceppo R20291. Questo metodo consente di monitorare la patogenesi batterica e valutare nuove terapie.

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Gli autori desiderano ringraziare Trevor Lawley del Wellcome Trust Sanger Institute per le spore di C. difficile R20291 e James S. Guy del North Carolina State University College of Veterinary Medicine per le cellule Vero, entrambi utilizzati in questo manoscritto. L'istopatologia animale è stata eseguita presso la LCCC Animal Histopathology Core Facility presso l'Università della Carolina del Nord a Chapel Hill, con l'assistenza speciale di Traci Raley e Amanda Brown. Il nucleo di istopatologia animale LCCC è supportato in parte da una sovvenzione di supporto del nucleo del centro NCI (2P30CA016086-40) all'UNC Lineberger Comprehensive Cancer Center. Vorremmo anche ringraziare Vincent Young, Anna Seekatz, Jhansi Leslie e Cassie Schumacher per le utili discussioni sul protocollo del test di citotossicità cellulare Vero. JAW è finanziato dalla sovvenzione Ruth L. Kirschstein National Research Service Award Research Training T32OD011130 da NIH. La CMT è finanziata dal premio per lo sviluppo della carriera in metabolomica K01GM109236 dal NIGMS del NIH.

<ol><li>Antibiotic Resistance Threats in the United States. , U.S.D.o.H.a.H. Services. Available from: 
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare in questo momento.

Questo protocollo caratterizza il decorso clinico, compresa la perdita di peso, la colonizzazione batterica, la citotossicità delle tossine e le alterazioni istopatologiche nel tratto gastrointestinale, dei topi trattati con antibiotici sottoposti a test con spore di C. difficile R20291. Ci sono diversi passaggi critici all'interno del protocollo in cui l'attenzione ai dettagli è essenziale. Il calcolo accurato dell'inoculo di spore di C. difficile è fondamentale. Questo calcolo si basa sull'enumerazion...

Clostridium difficile è un anaerobica,, bacillo spore gram-positivi che causa pericolo di vita la diarrea 1. Infezione da C. difficile (CDI) è associato ad un aumento della morbilità e della mortalità umana e si traduce in più di 4,8 miliardi di $ in spese sanitarie per anno 1-4. Nel 2013, i Centri per il Controllo e la Prevenzione delle Malattie classificati C. difficile come un rischio resistenza agli antibiotici urgente, indicando che essa pone una minaccia urgente per la salute pubblica 1. Attualmente, il trattamento antibiotico con vancomicina e metronidazolo sono considerati lo standard di cura per CDI 5. Purtroppo, il ripetersi di CDI dopo il successo del trattamento con antibiotici è alto, che si verificano nel 20 - 30% dei pazienti 2,5-7. Pertanto, la scoperta di nuove terapie contro questo patogeno enterico è necessario. Per valutare terapie contro il C. difficile, un modello animale approssimare la malattia umana in acè necessario un ceppo linically rilevanti. Inizialmente, i postulati di Koch sono stati stabiliti per il C. difficile nel 1977 utilizzando un modello di criceto siriano clindamicina trattati con 8. Questo modello è ancora utilizzato oggi per studiare gli effetti delle tossine di C. difficile sulla patogenesi 9,10. Tuttavia, CDI nel modello criceto si traduce in alti tassi di mortalità e non, sul ravvicinamento delle manifestazioni della malattia insidiosi croniche che possono essere visti in esseri umani con CDI 10,11. Sulla base della accessibilità e la disponibilità di piattaforme reagente murini in ricerca, un modello murino di CDI è rilevante. Nel 2008, un modello di topo robusto CDI è stato istituito con il trattamento di topi con un cocktail di antibiotici nell&#39;acqua potabile (kanamicina, gentamicina, colistina, metronidazolo e vancomicina) per 3 giorni, seguiti da un&#39;iniezione intraperitoneale di clindamicina 12. Questo topi resi sensibili alla colite CDI e grave. Dipenderezione della dose somministrata inoculo, una serie di segni clinici e letalità può osservare utilizzando questo modello. Da quel momento, i vari regimi antibiotici sono stati studiati che alterano la flora intestinale murino, diminuendo la resistenza colonizzazione al punto in cui C. difficile può colonizzare il tratto gastrointestinale (rivisto nel miglior et al. E Lawley &amp; Young) 13,14. Più di recente, un ampio spettro di cefalosporina, cefoperazone, data in acqua potabile per 5 o 10 giorni rende riproducibile topi suscettibili di CDI 15. Dal momento che la somministrazione di cefalosporine di terza generazione sono associati ad un aumentato rischio di CDI negli esseri umani, l&#39;uso del modello cefoperazone riflette in modo più accurato la malattia 16 in natura. Cefoperazone trattati topi suscettibili di C. difficile è stato messo in discussione con entrambe le spore di C. difficile e le cellule vegetativa di una varietà di ceppi che vanno a clinicarilevanza e virulenza 17. Nonostante alcuni degli studi originali che utilizzano C. cellule vegetative difficile del come la forma infettiva, spore di C. difficile del sono considerati la principale modalità di trasmissione 18. Negli ultimi dieci anni, C. difficile R20291, un NAP1 / BI / 027 ceppo, è emerso, causando epidemie di CDI 19,20. Abbiamo cercato di determinare il decorso clinico della malattia, quando i topi Cefoperazone trattati si sono sfidati con il C. difficile ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. Dettagli Questo protocollo il decorso clinico, tra cui la perdita di peso, la colonizzazione batterica, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici nel tratto gastrointestinale dei topi sfidati con spore di C. difficile R20291. Nel complesso, questo modello di topo si rivela essere una piattaforma sperimentale prezioso per CDI approssimare malattie umane. Questo modello caratterizzato mouse può quindi essere utilizzato per valutare gli effettidi nuove terapie per il miglioramento della malattia clinica e sul restauro della resistenza colonizzazione contro C. difficile.

<table><tbody><tr><td>#62 Detergente disinfettante sporidiciale Perisept&nbsp;</td><td>SSS Navigator</td><td>48027</td><td>Questo prodotto richiederà la diluizione come raccomandato dal produttore</td></tr><tr><td>0,22 &mu; m filtro</td><td>Fisherbrand</td><td>09-720-3</td><td>Alternativa alla piastra filtrante per campioni individuali testati nel Vero Cell Assay</td></tr><tr><td>0,25% Tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200-056</td><td>Deve essere riscaldato in bagnomaria a 37 &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>0,4% Trypan Blue</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>1% Peniciilin/Streptomycin</td><td>Gibco</td><td>15070-063</td><td></td></tr><tr><td>10% inattivato a caldo FBS</td><td>Gibco</td><td>16140-071</td><td>Deve essere riscaldato a bagnomaria a 37 gradi; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>siringa di plastica da 1 ml&nbsp;</td><td>BD Medical Supplies</td><td>309628</td><td></td></tr><tr><td>1x PBS</td><td>Gibco</td><td>10010-023</td><td></td></tr><tr><td>Tappo a vite per microcentrifuga da 2 ml</td><td>Corning</td><td>430917</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a fondo piatto per colture cellulari a 96 pozzetti</td><td>Costar Corning</td><td>CL3595</td><td></td></tr><tr><td>Piastra filtrante a 96 pozzetti</td><td></td> Guarnizione adesiva MSGVS2210 <td></td><td>Millipore</td></tr><tr><td></td><td>ThermoScientific</td><td>AB-0558</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Agar</td><td>Becton Dickinson</td><td>214010</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Bacto Proteose Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211684</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Cefoperazone</td><td>MP Bioworks</td><td>199695</td><td></td></tr><tr><td>Cefoxitine</td><td>Sigma</td><td>C47856</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Antitoxin Kit</td><td>Tech Labs</td><td>T5000</td><td>Utilizzato come controllo per il saggio Vero Cell</td></tr><tr><td>Clostridium difficile Tossina A</td><td>List Biological Labs</td><td>152C</td><td>Controllo positivo per Vero Cell Assay</td></tr><tr><td>D-cicloserina</td><td>Sigma</td><td>C6880</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Acqua distillata</td><td>Gibco</td><td>15230</td><td></td></tr><tr><td>DMEM 1x Media</td><td>Gibco</td><td>11965-092</td><td>Deve essere riscaldato a bagnomaria a 37 &deg; C prima dell'uso</td></tr><tr><td>Fruttosio</td><td>Fisher</td><td>L95500</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Bright-Line, Sigma</td><td>Z359629</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Fisher</td><td>P285-500</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>MgSO4 (anidro)</td><td>Sigma</td><td>M2643</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Millex-GS 0.22 &mu; m filter</td><td>Millex-GS</td><td>SLGS033SS</td><td>Filtro per piastre TCCFA</td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Sigma</td><td>S-0876</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher</td><td>S640-3</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Lama per bisturi monouso numero 10</td><td>Miltex, Inc</td><td>4-410</td><td></td></tr><tr><td>Piastre PCR Fisherbrand</td><td></td><td>14230244</td><td></td></tr><tr><td>Capsula di Petri in plastica</td><td>Kord-Valmark Brand</td><td>2900</td><td></td></tr><tr><td>Divaricatore di cellule sterili a forma di L</td><td>in plastica Fisherbrand</td><td>14-665-230</td><td></td></tr><tr><td>Siringa passo-passo</td><td>Dymax Corporation</td><td>T15469</td><td></td></tr><tr><td>Taurocholate</td><td>Sigma</td><td>T4009</td><td>Parte delle piastre TCCFA (vedi sotto)</td></tr><tr><td>Acqua distillata ultrapura</td><td>Invitrogen</td><td>10977-015</td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6J Topi</td><td>The Jackson Laboratory</td><td>664</td><td>I topi dovrebbero avere 5-8 settimane di età</td></tr><tr><td>Microscopio ottico Olympus BX43F</td><td>Fotocamera Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DP27</td><td>Olympus Life Science</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cellSens Dimension software&nbsp;</td><td>Olympus Scienze</td><td></td><td></td> della vita</tr></tbody></table>

cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti<em&gt; clostridium difficile</em&gt; r20291 strain

Cefoperazone-treated Mouse Model of Clinically-relevant Clostridium difficile Strain R20291

Clostridium difficile è un patogeno enterico anaerobico, gram-positivo, sporigeno che è associato ad un aumento della morbilità e della mortalità e di conseguenza rappresenta una minaccia urgente per la salute pubblica. La recidiva di un'infezione da C. difficile (CDI) dopo un trattamento efficace con antibiotici è elevata, si verifica nel 20-30% dei pazienti, rendendo quindi necessaria la scoperta di nuove terapie contro questo patogeno. Gli attuali modelli animali di CDI determinano alti tassi di mortalità e quindi non si avvicinano alle manifestazioni croniche e insidiose della malattia osservate nell'uomo con CDI. Per valutare le terapie contro C. difficile, è necessario un modello murino che si avvicini alla malattia umana utilizzando un ceppo clinicamente rilevante. Questo protocollo delinea il modello murino di CDI con cefoperazone utilizzando un ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabile, R20291. Le tecniche per il monitoraggio clinico della malattia, l'enumerazione batterica di C. difficile, la citotossicità delle tossine e le alterazioni istopatologiche in tutta la CDI in un modello murino sono descritte in dettaglio nel protocollo. Rispetto ad altri modelli murini di CDI, questo modello non è uniformemente letale alla dose somministrata, consentendo l'osservazione di un decorso clinico prolungato dell'infezione concordante con la malattia umana. Pertanto, questo modello murino di CDI si dimostra una preziosa piattaforma sperimentale per valutare gli effetti di nuove terapie sul miglioramento della malattia clinica e sul ripristino della resistenza alla colonizzazione contro C. difficile.

Durante uno studio rappresentativo, 5 settimane di età C57BL / 6 topi WT sono stati pretrattati con cefoperazone nella loro acqua potabile (0,5 mg / ml) per 5 giorni e ha permesso a 2 giorni lavare con acqua potabile normale. I topi sono stati sfidati con 10 5 spore di C. difficile R20291 tramite sonda gastrica al giorno 0 (Figura 1A). I topi sono stati monitorati per la perdita di peso e segni clinici (letargia, inappetenza, diarrea, e la postura ing...

Questo protocollo delinea il modello di topo cefoperazone di infezione da Clostridium difficile (CDI) con un ceppo clinicamente rilevante e geneticamente trattabili, R20291. L&#39;enfasi sul monitoraggio clinico della malattia, C. enumerazione batterica difficile, la tossina citotossicità, e cambiamenti istopatologici tutto CDI in un modello di topo sono dettagliati nel protocollo.

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; R20291 Strain

Clostridium difficile is an anaerobic, gram-positive, spore-forming enteric pathogen that is associated with increasing morbidity and mortality and ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è fornire una guida passo dopo passo per l'implementazione del modello murino di Clostridium difficile con cefoperazone, con particolare enfasi sul monitoraggio della malattia clinica, sulla quantificazione batterica, sulla citotossicità delle tossine e sui cambiamenti istopatologici dopo la sfida. Questo protocollo dettagliato aiuterà i ricercatori a eseguire con precisione un modello murino di infezione da Clostridium difficile, essenziale per lo studio della patogenesi di questo batterio e per la valutazione di nuove terapie. Il principale vantaggio dell'utilizzo di questo modello murino è che l'esposizione a un singolo antibiotico per cinque giorni rende i topi suscettibili alla colonizzazione da C. difficile e a un decorso clinico prolungato dell'infezione, simile a quello osservato nell'uomo.Per iniziare, prelevare il ceppo di riserva di C.difficile di interesse e vortexare. In una cappa a flusso laminare, diluire il ceppo in acqua sterile in un tubo con tappo a vite fino a una concentrazione di dieci alla quinta spore per 25 microlitri. Etichettare la miscela come inocolo di spore e inserire il tubo in un bagno d'acqua a 65 gradi Cel

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JoVE Journal

Immunology and Infection

Immunologia e Infezioni

Fonte: Winston, J. A., et al. Modello murino trattato con cefoperazone del ceppo clinicamente rilevante di Clostridium difficile R20291.  J. Vis. Esp. (2016)Questo video mostra la procedura per inoculare topi pretrattati con antibiotici con spore di Clostridium difficile per stabilire un modello murino di infezione al fine di studiare la patogenesi e le risposte dell'ospite.

Stabilimento di un modello murino di infezione da Clostridium difficile

Fonte: Winston, J. A. et al. Modello murino trattato con cefoperazone del ceppo clinicamente rilevante di Clostridium difficile R20291. J. Vis. Esp. (2016)Questo video dimostra la quantificazione di Clostridium difficile in campioni fecali di un modello murino infetto utilizzando tecniche di coltura selettiva. Descrive le procedure per la raccolta dei campioni, l'elaborazione anaerobica, la diluizione seriale e l'enumerazione delle colonie per valutare la colonizzazione batterica e le...

Quantificazione di Clostridium difficile in campioni fecali da un modello di topo infetto

Citrobacter infezione rodentium fornisce un valido modello per studiare le infezioni batteriche intestinali così come la risposta immunitaria e colite nei topi. Questo protocollo descrive la misura di integrità della barriera, il carico patogeno e danno istologico che permette per la caratterizzazione completa dei contributi patogeni e di accoglienza per murino colite infettiva.

Il<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Mouse Model: Studiare Contributi degli agenti patogeni e Host alla colite infettiva

Di imaging multi-modalità è un valido approccio per studiare la colonizzazione batterica in piccoli modelli animali. Questo protocollo descrive l'infezione di topi con...

4D imaging multimodale di<em&gt; Citrobacter rodentium</em&gt; Infezioni in topi

La capacità di modellare le infezioni del tratto urinario (UTI) è fondamentale per essere in grado di comprendere la patogenesi batterica e generare lo sviluppo di nuove terapie. L'obiettivo di questo lavoro è dimostrare modelli murini di UTI sperimentali e UTI associate a catetere che ricapitolano e predicono i risultati osservati negli esseri umani.

Istituzione e caratterizzazione di UTI e CAUTI in un modello murino

L'efficacia degli antibiotici è più comunemente determinata conducendo studi cinetici di uccisione e misurando le unità formanti colonie (CFU). Integrando la microscopia elettronica a scansione (SEM) con questi metodi standard, possiamo distinguere gli effetti farmacologici del trattamento tra i diversi antibiotici.

Un protocollo per caratterizzare i cambiamenti morfologici di<em&gt; Clostridium difficile</em&gt; In risposta al trattamento antibiotico

Qui, descriviamo un metodo per indurre la meningite meningococcica attraverso una via intracisternale di infezione nei topi adulti. Vi presentiamo un protocollo passo dopo passo dell'infezione da meningococco dalla preparazione dell'inoculum all'infezione intracisternale; quindi registrare la sopravvivenza animale e valutare i carichi batterici nei tessuti murini.

Indurre Meningococcal Meningitis Serogroup C in Topi tramite consegna intracisternale

Viene dimostrato un modello murino di inoculazione transuretrale uropatogena di E. coli (UPEC) per stabilire serbatoi latenti della vescica intracellulare e la successiva esposizione della vescica a G. vaginalis per indurre UPEC UTI ricorrente. Sono inoltre dimostrati l'enumerazione dei batteri, la citologia delle urine e la fissazione e l'elaborazione della vescica in situ per la microscopia elettronica a scansione.

Infezione ricorrente del tratto urinario da Escherichia coli innescata dall'esposizione alla vescica di Gardnerella vaginalis nei topi

Qui, presentiamo un protocollo per stabilire il modello murino di colite indotta da sodio con destrano solfato pseudo-germe indotto da antibiotici per studiare il ruolo del microbiota intestinale nella regolazione degli effetti positivi del Bacillus cereus sulla colite.

Indagine sugli effetti attenuanti della somministrazione di Bacillus cereus sulla colite attraverso la modulazione del microbiota intestinale

Il parto pretermine (parto &lt; 37 settimane) è un problema urgente di salute globale con opzioni di prevenzione e trattamento non ottimali. Presentiamo un modello murino di parto pretermine indotto da infezione batterica vaginale ascendente e delineiamo come analizzare la morbilità e la mortalità neonatale risultanti.

Modellazione dell'infezione vaginale ascendente, della nascita pretermine e della morbilità neonatale nei topi

Questo protocollo descrive i passaggi necessari per la colonizzazione di topi con pks+ Escherichia coli in condizioni non infiammatorie, nonché metodi non invasivi per la validazione della colonizzazione e la valutazione dell'espansione di pks+ E. coli nelle feci.

Colonizzazione con Escherichia coli di Murine pks+ in condizioni non infiammatorie

Scopri il modello murino con cefoperazone per studiare l'infezione da Clostridium difficile con il ceppo R20291. Questo metodo consente di monitorare la patogenesi batterica e valutare nuove terapie.

Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti

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