Cefoperazone trattati modello murino di clinicamente rilevanti Clostridium difficile R20291 Strain

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di fornire una guida passo passo per l'implementazione del modello murino cefoperazone dell'infezione da Clostridium difficile, con particolare attenzione al monitoraggio clinico della malattia, all'enumerazione dei batteri, alla citotossicità delle tossine e ai cambiamenti istopatologici post sfida. Questo protocollo dettagliato aiuterà i ricercatori a eseguire con precisione un modello murino di infezione da Clostridium difficile, che è essenziale per studiare la patogenesi di questo batterio e accedere a nuove terapie. Il vantaggio principale dell'utilizzo di questo modello murino è che l'esposizione a un antibiotico per cinque giorni rende i topi suscettibili alla colonizzazione di C.difficile e a un decorso clinico prolungato dell'infezione in concomitanza con la malattia umana.

Per iniziare, prendiamo il ceppo stock di C.difficile di interesse e vortice. In una cappa a flusso laminare, diluire il brodo in acqua sterile in una provetta con tappo a vite a una concentrazione da dieci a un quinto di spore per 25 microlitri. Etichettare la miscela come inoculo di spore e mettere la provetta in un bagno d'acqua a 65 gradi Celsius per 20 minuti.

Successivamente, nella cappa a flusso laminare, pipettare 50 microlitri di inoculo di spore riscaldato in una provetta sterile per microcentrifuga e passarla nella camera anaerobica fino a nuovo utilizzo. Caricare l'inoculo di spore rimanente in una siringa da un millilitro attaccata a un ago gavage gastrico sterile con punta a bulbo. In un cappuccio a flusso laminare, prendi un topo soggetto e immobilizza la testa trattenendo delicatamente l'animale dalla pelle flaccida del collo e della schiena.

Usando il dito indice e assicurandosi che l'animale non vocalizzi o mostri segni di angoscia, immobilizza ulteriormente la testa dell'animale e allunga l'esofago. Mantenere il mouse in posizione verticale verticale e passare delicatamente l'ago del gavage sul lato della bocca. Dirigere l'ago della sonda gastrica lungo il tetto della bocca e farlo avanzare lentamente nell'esofago.

Una volta che l'ago è a circa metà dell'esofago, iniettare 25 microlitri di inoculo di spore e quindi ritirare delicatamente l'ago. Rimetti l'animale nella sua gabbia e osservalo per eventuali segni di tosse o difficoltà respiratoria che potrebbero indicare una somministrazione tracheale involontaria. Successivamente, prendi l'aliquota dell'inoculo di spore precedentemente conservata nella camera anaerobica e l'eventuale inoculo di spore di sonda rimanente e fai da una a dieci diluizioni seriali in 180 microlitri di 1x PBS.

Eseguire da quattro a cinque di queste diluizioni. Utilizzando una tecnica asettica, trasferire 100 microlitri di ciascuna diluizione seriale in una piastra TCCFA individuale. Prendendo ogni volta un nuovo spandiconcime sterile a forma di L, distribuire uniformemente l'inoculo di diluizione su ogni piastra.

Incubare le piastre in condizioni anaerobiche per 24 ore a 37 gradi Celsius. Infine, contare le colonie di C.difficile su ciascuna piastra di diluizione e calcolare le unità formanti colonie per ottenere la dose infettiva somministrata ai topi. Per raccogliere campioni fecali dai topi per la valutazione, prima trattiene leggermente ma con fermezza il topo soggetto per la pelle flaccida sul collo e sulla schiena, assicurandosi che l'animale non sia in difficoltà.

Usando il mignolo, solleva delicatamente la coda dell'animale, esponendo l'ano. Tenere una provetta sterile per microcentrifuga di peso noto direttamente sotto l'ano dell'animale, assicurandosi che la provetta non tocchi direttamente il topo. Quando l'animale defeca, raccogli il pellet fecale nel tubo.

Conservare la provetta a temperatura ambiente fino a quando non vengono raccolti tutti i campioni necessari. Pesare le provette contenenti feci su una bilancia analitica e registrare la massa con quattro cifre decimali. Calcolare il peso del pellet fecale sottraendo il peso del tubo.

Quindi, calcolare una diluizione da uno a dieci del contenuto e risospendere in 1x PBS. Utilizzare la punta della pipetta per disgregare delicatamente la materia fecale in soluzione. Incubare i campioni a temperatura ambiente per 30 minuti, lasciando che il contenuto si depositi.

Mantenendo le soluzioni in modo anaerobico, effettuare diluizioni seriali per ogni campione in 1x PBS. Trasferire 100 microlitri di ogni diluizione seriale su piastre TCCFA. Utilizzare uno spandiconcime sterile a forma di L e applicare uniformemente il terreno sulle piastre.

Incubare le piastre in condizioni anaerobiche a 37 gradi Celsius per 24 ore. Infine, enumerare le colonie di C.difficile e calcolare l'unità di formazione della colonia per grammo di contenuto fecale. Questa figura mostra il peso del topo nei giorni successivi alla sfida con C.difficile R20291.

Al giorno zero, il peso basale è impostato su 100. Il peso corporeo medio del topo è stato misurato ogni giorno successivo, per 14 giorni. Una significativa diminuzione del peso è stata osservata nei topi sfidati dal secondo al settimo giorno dopo la sfida.

I topi sembravano riprendersi e riguadagnare peso dopo questo punto. Qui, viene mostrato il carico di C.difficile nelle feci nei giorni successivi alla sfida. A 24 ore dalla verifica, tutti i topi sono stati colonizzati con 10-7 CFU per grammo di feci.

Questo carico è diminuito dal settimo giorno in poi, anche se il C.difficile è ancora presente. L'esame istopatologico dei topi nel corso del tempo dell'infezione ha mostrato i cambiamenti patologici più significativi nel cieco. I punteggi istologici totali del cecale erano significativamente diversi tra il giorno zero e il secondo e il quarto giorno dopo la provocazione.

In generale, gli individui che non conoscono questo modello murino possono avere difficoltà con il calcolo e la preparazione dell'inoculo di spore utilizzato per sfidare i topi e il calcolo della carica batterica fecale di C.difficile. Durante il tentativo di questo protocollo, è importante ricordare che le modifiche della dose o del ceppo di spore di C.difficile somministrate ai topi possono alterare l'esito di questo modello.