Esaminando Assemblea Proteasome con ricombinante archeali proteasomi e nondenaturing PAGINA: il caso di un approccio combinato

Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.

L'obiettivo generale di questo esperimento è analizzare l'assemblaggio di un complesso multiproteico come il proteasoma, utilizzando subunità ricombinanti e l'elettroforesi su gel di poliacrilammide non denaturante, o PAGE. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo del proteasoma, come ad esempio quali specie intermedie si incontrano lungo il percorso di assemblaggio di questo complesso proteico. Il vantaggio principale di questa tecnica è che consente uno screening rapido dell'assemblaggio mediante due approcci paralleli, consentendo il rilevamento di intermedi su e fuori percorso. Questa procedura inizia con l'espressione batterica come descritto nel protocollo di testo. Per eseguire la lisi batterica, scongelare il pallet cellulare indotto che co-esprime la combinazione desiderata di subunità del proteasoma, su ghiaccio per cinque minuti. Una volta scongelato, risospendere il pallet in 600 microlitri di tampone di lisi.Incubare la sospensione a 30