Name: In linea Size-esclusione e cromatografia a scambio ionico su una SAXS Beamline (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-05T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 9 s
Description: Impara a implementare la cromatografia SEC e IEC in linea con SAXS per migliorare la qualità dei dati strutturali. Questo metodo riduce i tempi tra preparazione e misurazione, evitando la denaturazione del campione proteico.

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Ringraziamo il sostegno finanziario per il progetto dalla sovvenzione francese REPLIPOX ANR-13-BSV8-0014 e dalle sovvenzioni per la ricerca del Service de Santé des Armées e della Délégation Générale pour l'Armement. Siamo grati all'ESRF per il tempo del fascio SAXS. Ringraziamo Andrew McCarthy, Gordon Leonard, Wim Burmeister e Guy Schoehn per il sostegno finanziario e scientifico.

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Per molti macromolecole, una fase finale di purificazione mediante cromatografia è richiesto prima raccolta dati SAXS per ottenere un buon insieme di dati di qualità. Tuttavia, non tutti i campioni rimangono stabili; essi possono essere soggette a aggregazione o riequilibrio ad una miscela di stati di oligomerizzazione. Pertanto, una fase di purificazione finale online sulla linea di luce per ridurne al minimo il tempo tra purificazione e la raccolta di dati al fine di ottenere i dati SAXS migliore qualità. A seconda delle proprietà biofisiche della proteina di interesse, SEC-SAXS o IEC-SAXS potrebbero essere scelti per ottenere la qualità del campione ottimale. Qui, su un costrutto proteina derivata dalla elicasi / primasi D5, entrambe le tecniche sono spiegate e discusse. Acquisizione dei dati SEC-SAXS sta diventando sempre più standardizzato ed è disponibile su molti BioSAXS linee di luce. L&#39;analisi dei dati, in particolare la sottrazione dello sfondo, è relativamente semplice e facile. Tuttavia, un segnale di buffer stabilee la separazione sufficiente delle specie macromolecolari rimane essenziale. Pertanto, è fondamentale riservare tempo sufficiente per equilibrare fondo colonna. In mancanza di questo metodo può essere dovuto a contaminanti persistenti di dimensioni simili alla proteina di interesse, basse concentrazioni, e buffer sensibili alle radiazioni. In pratica, inizialmente, SEC-SAXS è suscettibile di essere utilizzato come metodo di scelta per la maggior parte dei campioni macromolecolari. Tuttavia, molti protocolli di purificazione richiedono una fase IEC prima a causa della presenza di contaminanti o aggregazione. Dato che ogni fase di concentrazione e la cromatografia è associata a perdite di campione (stimata al 30-50%) e il tempo, diretta IEC-SAXS è vantaggioso. Per i campioni che non possono essere purificati mediante SEC, sia per la presenza di &quot;contaminanti&quot; di dimensioni simili o perché gravemente aggregato alle concentrazioni necessarie, IEC-SAXS sarebbe sempre essere l&#39;approccio più adatto. Inoltre, le portate superiori supportatida molti colonne IEC possono contribuire a ridurre il tempo di transito tra la purificazione e di misurazione. Nell&#39;esempio qui presentato, IEC è stato usato con una eluizione passo, che consente la separazione degli stretti picchi di D5 323-785 da contaminanti scegliendo accuratamente i passi concentrazione salina. In linea di principio, il numero di passi è illimitato, ma praticamente, è richiesto almeno 1 punto a picco, e non troppi deve essere scelto. Per il metodo di sottrazione dello sfondo descritto sopra, è essenziale misurare un numero relativamente elevato di differenti composizioni tampone al fine di trovare una corrispondenza. Un aspetto negativo condiviso di entrambe le tecniche è la mancanza di informazioni precise concentrazione proteica. A causa di questo, precisa determinazione della massa sulla base di dispersione in avanti non è possibile. Per proteine globulari come D5 323-785, il volume Porod fornisce un&#39;alternativa, anche se meno precisa, stima di massa, ma per proteine altamente flessibili o disordinate, Questo approccio non sarebbe valido. Una variazione del gradiente graduale metodo IEC-SAXS qui presentato è l&#39;uso di un gradiente lineare invece. Mentre è possibile lavorare con altrettante fasi come desiderato per isolare i sotto-picchi utilizzando una eluizione graduale, nell&#39;approccio gradiente lineare, è necessario ottimizzare attentamente le condizioni di gradiente per separare i picchi completamente prima di iniziare il SAXS sperimentare. Sfondo sottrazione in questo approccio potrebbe essere fatto frame-saggio e potrebbe essere verificata dal confronto tra i singoli fotogrammi, ma richiede una gestione dei dati più avanzata, e un software dedicato non esiste ancora. La scelta di una colonna adatta è fondamentale per entrambe le tecniche, in quanto determina la separazione delle specie macromolecolari. colonne esclusione dimensionale differiscono per capacità di carico, la gamma di dimensioni di macromolecole separabili, e la risoluzione, mentre le colonne a scambio ionico variano nel tipo e la densitàdelle loro cariche immobilizzati. Mentre il protocollo presentato qui è specifico per la linea di luce ESRF BM29, l&#39;adattamento a qualsiasi altra linea di luce SAXS è, in linea di principio, semplice. I requisiti principali sono sufficientemente elevato flusso di raggi X ed un rivelatore adatto (idealmente singolo conteggio di fotoni), per acquisire dati ragionevoli segnale-rumore nell&#39;intervallo di secondi o meno, e un sistema di cromatografia liquida linea capace di creare gradienti. L&#39;implementazione esatta, naturalmente, dipendono dall&#39;ambiente linea di luce locale. I risultati ottenuti sul D5 323-785 utilizzando i due metodi differiscono leggermente. Il raggio di girazione è leggermente più piccolo per i dati IEC che per i dati SEC, e minimi locali della curva di dispersione siano spostate verso leggermente più grandi vettori di scattering. Ciò significa che il D5 323-785 misurata con IEC-SAXS è leggermente più compatto del D5 323-785 misurata con SEC-SAXS. Questo potrebbe be causa di differenze nella preparazione del campione, nel tempo fra purificazione e misura (IEC è più veloce), o, meno probabilmente, ad un contaminante nel campione SEC-purificato. I modelli di perline ottenuti in maniera completamente indipendente con entrambi i metodi sono confrontabili (Figura 1 H). D5 323-785 mostra la cava, la struttura esamerica previsto 18. In conclusione, in linea a scambio ionico e in linea cromatografia dimensione esclusione sono importanti metodi di purificazione biochimici che possono essere accoppiati direttamente al SAXS 6,7,9-12,25,26. Lo sfondo sottrazione dei dati IEC-SAXS è leggermente più difficile e ambiguo che per SEC-SAXS, ma è comunque possibile. A seconda delle proprietà biofisiche della proteina di interesse, sia SEC e IEC-SAXS permettono l&#39;ottimizzazione della separazione specie con vantaggi intrinseci. Fornire motto di spirito che siano correttamente rispettate le fasi di validazione (come descritto), i dati risultanti possono essere analizzatih fiducia, ed i modelli possono essere determinati utilizzando gli strumenti standard disponibili all&#39;interno della comunità. Insieme, entrambe le tecniche consentono la separazione in linea per una vasta gamma di macromolecole biologiche, ottenendo dati non accessibili tramite misurazioni statiche standard.

BioSAXS è un potente strumento per determinare la forma degli oggetti di dimensioni nanometriche 1-4. La dispersione di raggi X da una soluzione contenente macromolecole, dimensionate nell&#39;intervallo nm, viene registrato ad angoli molto bassi. Questa gamma angolare contiene informazioni sui parametri globali: il raggio di rotazione; la massima distanza intraparticellare; la forma delle particelle; e il grado di piegatura, denaturazione, o disturbo. La tecnica non richiede cristalli, e la macromolecola rimane in soluzione e quindi possono essere tenuti in condizioni che mimano alcuni importanti parametri della cella, come la forza ionica, pH, ecc La conoscenza di questi fattori possono contribuire a determinare, per esempio, lo stato oligomerico fisiologicamente rilevanti di una proteina di interesse o per validare un progetto di modello di un complesso. La caratterizzazione delle interazioni proteina-proteina in diverse condizioni di buffer, la creazione di modelli di domini mancanti, il perfezionamento di modelli di omologia, e decessazione di stati piegati e ripiegati discreti può essere eseguita rapidamente e facilmente 5. Come con qualsiasi tecnica, BioSAXS ha debolezze intrinseche: campioni aggregati o denaturati, miscele di particelle, campioni eterogenei, danni da radiazioni, e l&#39;inadeguatezza del buffer può generare dati non-interpretabile. Per molti metodi di analisi, è implicitamente presume che il campione è monodisperse, un requisito che è spesso difficile da ottenere in pratica. In molti casi, la degradazione del campione è sottile e non può essere rilevato nei dati di propria, e qualsiasi tentativo di interpretare i dati dà risultati inaccurati o addirittura fuorvianti. Per superare questi ostacoli, la combinazione di cromatografia dimensione esclusione (SEC) e SAXS è stato implementato in molte linee di luce per garantire la qualità dei dati e per rendere questa tecnica più accessibile per i campioni sempre più difficili 6-11. Recentemente, abbiamo aggiunto un nuovo metodo per il repertorio, sviluppando in linea a scambio ionicocromatografia (IEC) -coupled SAXS 12. Entrambe le tecniche sono aprendo SAXS ad una vasta gamma di particelle biologiche precedentemente impossibili da analizzare. La scelta del metodo da utilizzare dipende dalle proprietà biofisiche delle particelle di interesse. SEC separa macromolecole per la loro dimensione, per cui è necessaria almeno una differenza del 10% in massa molecolare apparente per la separazione. limitazioni fisiche della colonna e proprietà fisiologiche dei campioni, come superfici idrofobiche, la flessibilità, e la mancanza di stabilità, complicano anche la raccolta dei dati, l&#39;analisi e l&#39;interpretazione. Cromatografia a scambio ionico, che separa le molecole in base alla loro carica e, quindi, la loro affinità di legame alla colonna IEC, può essere usato al posto di o in aggiunta a SEC. La carica totale può essere facilmente manipolata cambiando il pH, o variando la concentrazione salina del buffer, fornendo un metodo relativamente semplice per l&#39;el controllataution delle molecole dalla colonna IEC. Utilizzando la carica, la separazione dei tipi simili e dimensioni di molecole, che altrimenti sarebbero difficilmente separabili, può essere effettuata di routine con IEC. Inoltre, IEC ha il vantaggio di essere in grado di trattare i campioni diluiti, permettendo di evitare le fasi di concentrazione, che portano il potenziale rischio di denaturazione della proteina. Purtroppo, come la distribuzione di carica è altamente dipende dal campione, IEC richiede ottimizzazione riguardante il pH e le concentrazioni saline 13,14. Per molte proteine ​​che sono difficili da esprimere, purificare, o entrambi, solo basse quantità di campione sono a disposizione per studiare. È importante essere efficiente e ridurre al minimo il numero di fasi di purificazione e, quindi, le perdite. Per questo motivo, l&#39;ultima fase di purificazione è collegato direttamente prima acquisizione dati SAXS, al fine di aumentare la probabilità di raccogliere un buon insieme di dati. Qui, Presentiamo e confrontare on-line SEC-SAXS e IEC-SAXS. Entrambe le tecniche sono state attuate sulla linea di luce BioSAXS BM29 alla European Synchrotron Radiation Facility (ESRF) di Grenoble, Francia 15. Come un banco di prova, abbiamo utilizzato il dominio D5N e elicasi della proteina del virus vaccinico D5, che era piuttosto difficile da analizzare strutturalmente con altri metodi. Il virus vaccino è un membro della famiglia Poxviridae ed è il 98% identico al virus Variola, la causa del vaiolo. Utilizzando il sistema di vaccino, si studia il meccanismo di replica, concentrandosi qui sull&#39;essenziale D5 elicasi-primasi. D5 è una proteina 95-kDa con un archeo-eucariote primasi (AEP) dominio N-terminale 16 seguito da un cluster regione cisteina (res. 240-345) 16. Inoltre verso la C-terminale viene un dominio D5N (res. 340-460), che è sempre associata a D5 tipo elicasi, e, infine, una superfamiglia 3 (SF3) dominio elicasi (res. 460-785) 17 (Figure 1A). Il dominio elicasi di D5 costruisce una struttura ad anello esamerica che è necessario per stretto legame al DNA. Grazie a recenti studi SAXS e EM, le strutture a bassa risoluzione del primasi ei domini elicasi sono ormai noti 18. Qui vi mostriamo come utilizzare le tecniche di cromatografia in linea attuati sulla linea di luce BioSAXS BM29 a ESRF per acquisire conoscenze nella struttura del frammento C-terminale (residui 323-785) di D5.

<table><tbody><tr><td>1,4-ditiotreitolo [DTT]</td><td>Euromedex</td><td>EU0006-B</td><td></td></tr><tr><td>10% Mini-PROTEAN TGX Gel proteico prefabbricato</td><td>Biorad</td><td>4561033</td><td></td></tr><tr><td>2x Phusion Flash PCR Master Mix</td><td>ThermoFisher scientifico</td><td>F 548</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico glaciale</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20104.298</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio D-5</td><td>Euromedex</td><td>LF45130653</td><td></td></tr><tr><td>Filtri centrifughi Amicon Ultra -15 Ultracel -30K</td><td>Millipore Ltd</td><td>UFC903024</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillina sale sodico</td><td>Euromedex</td><td>EU0400-D</td><td></td></tr><tr><td>Benzonasi</td><td>Novagene</td><td>70750-3</td><td></td></tr><tr><td>blu bromofenolo.</td><td>MERCK</td><td>8122</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail completo di inibitori della proteasi</td><td>Roche</td><td>11231400</td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10 DG Colonna di desalinizzazione</td><td>Bio-rad</td><td>732-2010</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma</td><td>E-5134</td><td></td></tr><tr><td>Glicerolo</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>24388.295</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Euromedex</td><td>26-128-6405-C</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>Roche</td><td>656313</td><td></td></tr><tr><td>HisSelect HF Nickel Affinity Gel</td><td>Sigma</td><td>H0537</td><td></td></tr><tr><td>Acido cloridrico (HCl)</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>20252.295</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole</td><td>AppliChem Panreac</td><td>A1073,0500</td><td></td></tr><tr><td>InstantBlue</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>LB brodo Miller</td><td>Fluka Analytical</td><td>L3152</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>ICN Biomedicals Inc.</td><td></td><td></td>191421</tr><tr><td>NaCl</td><td>VWR Chemicals (BDH Prolabo)</td><td>27808.297</td><td></td></tr><tr><td>NcoI</td><td>Fermentas</td><td>ER0571</td><td></td></tr><tr><td>One Shot BL21 Star (DE3)&nbsp;</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>C6010-03</td><td></td></tr><tr><td>pProEx HTb vettoriale&nbsp;</td><td>Addgene</td><td>10711018</td><td></td></tr><tr><td>Primer</td>&<td>nbsp; Eurofins mwg operone</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QIAprep Spin Miniprep kit</td><td>QIAGEN</td><td>27106</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick Kit di estrazione del gel</td><td>QIAGEN</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR purificazione kid</td><td>QIAGEN</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>75746</td><td></td></tr><tr><td>Superose 6 10/300 GL</td><td>GE Healthcare</td><td>17-5172-01</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Colorazione sicura del gel del DNA</td><td>Tecnologia della vita Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>T4 ligasi</td><td>ThermoFisher scientific</td><td>EL0011</td><td></td></tr><tr><td>TEV</td><td></td><td></td><td>fatto in casa</td></tr><tr><td>TOP 10</td><td>Invitrogen life technology</td><td>C404003&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Euromedex</td><td>26-128-3094-B</td><td></td></tr><tr><td>Uno Q 1R colonna&nbsp;</td><td>Bio-rad</td><td>720 0011</td><td></td></tr><tr><td>&beta;-mercaptoetanolo</td><td>MPBiomedicals, LLC</td><td>194834</td><td></td></tr><tr><td>Name</td><td>Company<</td><td>strong>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Softwares</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software di controllo della linea di luce BsXCuBE</td><td>ESRF</td><td>Pernot et al. (2013), J. Synchrotron Rad. 20, 660-664</td><td>sviluppo locale</td></tr><tr><td>Software Camserver</td><td>Dectris</td><td>n.a.software</td> <td>di controllo del rivelatore</td></tr><tr><td>DAMAVER</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programma per allineare i modelli ab initio&nbsp;</td></tr><tr><td>DAMMIF</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>ab initio programma di ricostruzione del modello</td></tr><tr><td>Programma HPLC Biologic Duo Flow</td><td>Bio-rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Programma HPLC LabSolutions</td><td>Shimadzu</td><td>n.a.ISPyB</td><td></td></tr> <tr><td></td><td>ESRF</td><td>De Maria Antolinos et al. (2015). Acta Cryst. D71, 76-85.</td><td>Sviluppo locale</td></tr><tr><td>PRIMUS</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programma, che esegue la manipolazione con SAXS sperimentale</td></tr><tr><td>PyMOL</td><td>DeLano Scientific LLC</td><td></td> <td>https://www.pymol.org/ software per la visualizzazione</td></tr><tr><td>SUPCOMB</td><td>ATSAS 2.6.0</td><td>http://www.embl-hamburg.de/biosaxs/download.html</td><td>programma per sovrapporre strutture 3D</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Duo Flow</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>BioLogic Biofrac Raccoglitore di frazioni</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema HPLC</td><td>Shimadzu</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Labsonic P</td><td>Sartorius Stedim biotech</td><td>BBI8535108</td><td></td></tr></tbody></table>

in linea size-esclusione e cromatografia a scambio ionico su una saxs beamline

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological piccolo angolo di diffusione dei raggi X (BioSAXS) è una tecnica potente in biologia molecolare e strutturale utilizzato per determinare struttura in soluzione, la dimensione delle particelle e la forma, e il rapporto superficie-volume di macromolecole. La tecnica è applicabile ad un&#39;ampia varietà di condizioni di soluzione coprono un ampio intervallo di concentrazioni, valori di pH, forza ionica, temperatura, additivi, ecc, ma il campione deve essere monodisperse. Questo avvertimento ha portato alla realizzazione di sistemi di cromatografia liquida su linee di luce SAXS. Qui, descriviamo l&#39;integrazione a monte di esclusione dimensionale (SEC) e cromatografia a scambio ionico (IEC) su una linea di luce, diversi metodi per sfondo ottimale sottrazione e riduzione dei dati. Come esempio, si descrive come utilizziamo SEC-e IEC-SAXS su un frammento della proteina essenziale del virus vaccinia D5, costituito da un dominio D5N elicasi. Noi determinare la sua forma complessiva e peso molecolare, che mostra la struttura esamerica di The proteine.

I risultati dell'analisi invariante model-free sono elencati nella Tabella 1. L'analisi dei dati di 323-785 D5 SEC-SAXS mostrava una stima massa molecolare (da un'analisi Porod) di 345 kDa contro 338 kDa, osservata utilizzando IEC-SAXS. Entrambi sono in accordo con la massa prevista del 6 volte 53,5 kDa (321 kDa) per un esamero. Il initio modellazione ab di entrambi i set di dati è stata intrapresa senza simmetria imposta (SEC-SAXS: χ 2 = 0,88, IEC-SAXS: χ 2 = 3.1) e l'utilizzo di C6 simmetria (SEC-SAXS: χ 2 = 1.0, IEC-SAXS : χ 2 = 4). Come le crisi globali ai dati di scattering per entrambe le ricostruzioni sono paragonabili in entrambi i casi (Figura 1D ed E), C6 simmetria può essere assunto. Pertanto, il modello corrisponde ad una struttura a forma di cono esagonale con un canale centrale, che appare parzialmente ostruita (SEC: Figura 1F; IEC: Figura 1 H). Un esame dei singoli modelli prima media mostra che questa ostruzione è probabile che sia un artefatto del processo di media. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54861/54861fig1x.jpg"> Figura 1: analisi dei dati SAXS e confronto delle D5 323 -785 (figura adattato da riferimenti 12 e 18). A) la struttura del dominio schematica di D5 e D5 proteine 323-785. B) Non connesso a scambio ionico cromatogramma con l'indicazione delle tre cime. Arancione curva: assorbanza a 280 nm (au), curva blu: percentuale di tampone B. Percentuali di tampone B le cime sono indicati. C) Online cromatogramma a scambio ionico. chiave colore come in B. Inoltre, l'intensità misurata è indicato in verde. La dispersione sperimentale curva AND curva del modello ottenuto dal SEC-SAXS D) e IEC E) l'analisi dei dati di D5 323-785 calcolato. Modello F) Perle di D5 323-785 sulla base dei dati SEC e dati G) IEC. H) Sovrapposizione dei modelli SEC e IEC. I pannelli in F) ah) sono stati creati utilizzando un software di visualizzazione molecolare 24. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54861/54861fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Parametri di raccolta dati </td><td></td></tr><tr><td> Strumento: </td><td> ESRF BM29 </td></tr><tr><td> Lunghezza d'onda (Å) </td><td> 0.99 </td></tr><tr><td> q-gamma (A -1) </td><td> ,0032-,49 </td></tr><tr><td> Campione-to-rilevatore distanza </td><td> 2.864 m </td></tr><tr><td> Tempo di esposizione (sec) </td><td> 1 per fotogramma </td></tr><tr><td> intervallo di concentrazione </td><td> n / a </td></tr><tr><td> Temperatura (K) </td><td> 293 </td></tr><tr><td> Rivelatore </td><td> Pilatus 1M (Dectris) </td></tr><tr><td> Flux (fotoni / s) </td><td> 1 × 10 12 </td></tr><tr><td> Dimensione del fascio (micron 2) </td><td> 700 × 700 </td></tr><tr><td> Parametri strutturali per D5 323-785, SEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [da Guinier] </td><td> 0,0237 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [da Guinier] </td><td> 48 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g utilizzato per Guinier </td><td> 0,77-1,24 </td></tr><tr><td> D max (Å) [da p (r)] </td><td> 145 </td></tr><tr><td> q-gamma utilizzato per p (r) (a -1)</td><td> 0,02-0,17 </td></tr><tr><td> Porod volume V p (a 3) [da Scatter] </td><td> (570 ± 5) 3 × 10 </td></tr><tr><td> Massa molecolare M R (kDa) [da V p] </td><td> 345 </td></tr><tr><td> Calcolato monomerico Mr dalla sequenza (kDa) </td><td> 321 </td></tr><tr><td> Parametri strutturali per D5 323-785, IEC </td><td></td></tr><tr><td> I 0 (cm -1) [da Guinier] </td><td> 0,386 </td></tr><tr><td> Rg (Å) [da Guinier] </td><td> 46.5 ± 0.1 </td></tr><tr><td> q min R g - q max R g utilizzato per Guinier </td><td> 0,44-1,29 </td></tr><tr><td> D max (Å) [da p (r)] </td><td> 120 </td></tr><tr><td> q-gamma utilizzato per p (r) (a -1) </td><td> ,03-0,18 </td></tr><tr><td> Porod volume V p (&amp; #197; 3) [da Scatter] </td><td> (577 ± 5) 3 × 10 </td></tr><tr><td> Massa molecolare M R (kDa) [da V p] </td><td> 339 </td></tr><tr><td> Calcolato esamerica Mr dalla sequenza (kDa) </td><td> 321 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: SAXS parametri dei dati. La tabella riassume i parametri di acquisizione dati SAXS e analisi.

La determinazione della struttura in soluzione di una proteina da piccolo angolo X-ray Scattering (SAXS) richiede campioni monodisperse. Qui, vi presentiamo due possibilità per garantire ritardi minimi tra la preparazione del campione e l&#39;acquisizione dei dati: in linea cromatografia dimensione esclusione (SEC) e in linea cromatografia a scambio ionico (IEC).

In linea Size-esclusione e cromatografia a scambio ionico su una SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

L'obiettivo generale dell'implementazione della cromatografia online per esclusione dimensionale e scambio ionico su linee di fascio di diffusione di raggi X a piccolo angolo è quello di ottenere dati di modello a bassa risoluzione di migliore qualità, garantendo ritardi minimi tra la preparazione del campione e l'acquisizione dei dati. Questi metodi possono aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia strutturale. Come l'operazione del raggio, la massima distanza intra-particolare, la forma delle particelle, il grado di denaturazione o disordine del ripiegamento.SAXS richiede campioni molari dispersi. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il tempo tra la purificazione e la misurazione è breve, contribuendo ad evitare la denaturazione o l'assegnazione del campione. Prima di recarsi presso l'impianto della linea di luce, preparare un campione concentrato utilizzando metodi precedentemente pubblicati ed eseguire i test SEC.Presso l'impianto della linea di luce, posizionare un millilitro di tampone di filtrazione su gel in una provetta di reazione da 1,5 millilitri. Quindi, collegare il flacone di tampone di filtrazione in gel a un sistema HPLC in linea con il capillare a flusso continuo del set-up SAXS. Impostare la portata, la pressione massima della colonna e il tempo di acquisizione.Notare la contropressione senza la colonna. Eliminare le linee, quindi collegare ed equilibrare la colonna per cromatografia ad esclusione dimensionale. Caricare il campione tampone da un millilitro nello scambiatore di campioni.Uscire e bloccare o bloccare la gabbia sperimentale, quindi accedere al software di controllo della linea di luce in modalità campionatore. Inviare il campione tampone nello scambiatore di campioni direttamente attraverso il capillare a flusso continuo SAXS. Eseguire un breve test SAXS e verificare che l'intensità di diffusione dei raggi X del suono non mostri segni di danni da radiazioni.Commutare il sistema di controllo della linea di luce in modalità HPLC ed eseguire un test SAXS del buffer attraverso l'intero sistema HPLC SAXS. Se i dati non corrispondono alla prima misurazione, riequilibrare ed eseguire un altro test. Successivamente, in laboratorio, centrifugare il campione di proteine a 13.000 volte G per 10 minuti per rimuovere gli aggregati.Trasferire il surnatante in un flaconcino di vetro compatibile con HPLC. Caricare la fiala nell'autocampionatore, annotando la posizione del campione. Bloccare la gabbia e creare una cartella per i dati dell'esperimento nel sistema di controllo della linea di luce.Quindi, nel software HPLC, fare clic su quick batch. Imposta il percorso del file e attiva la conversione automatica ascii dei dati UV/VIS. Inserire il volume di iniezione e la posizione del campione nell'autocampionatore.Fare clic su start'per aggiungere l'esecuzione alla coda. Inserisci il nome del file, ma non fare clic su salva'ancora. Nel software di controllo della linea di luce, impostare il numero di frame di dati in modo che il tempo di raccolta dei dati SAXS sia leggermente superiore al tempo di acquisizione HPLC.Aprire l'otturatore della linea di luce e avviare la raccolta dei dati SAXS. Passare al software HPLC e fare clic su Salva per iniettare il campione. Annotare il numero di fotogramma all'inizio dell'acquisizione dei dati UV/VIS e monitorare l'intensità sommata nel tempo.Durante la preparazione del campione, eseguire un test IEC con un gradiente lineare di cloruro di sodio da 25 millimolari a un molare. Per ogni picco di interesse, determinare la quantità corrispondente di tampone B ad alto contenuto di sale nella fase mobile. Per iniziare l'esperimento IEC SAXS, mettere da parte campioni di un millilitro di tamponi A e B, quindi collegare i tamponi al sistema HPLC.Impostare i parametri HPLC, quindi spurgare il sistema e lavare le linee con il tampone a basso contenuto di sale A.Collegare ed equilibrare la colonna a scambio ionico con il tampone A.Caricare i campioni da un millilitro dei tamponi A e B nello scambiatore di campioni. Bloccare la gabbia ed eseguire un breve test SAXS per ogni campione di tampone in modalità di cambio campione per verificare la suscettibilità del tampone ai danni da radiazioni. Quindi, passare alla modalità HPLC ed eseguire un altro test SAXS per il buffer A.Confrontare i modelli di scattering con quelli ottenuti dal test del campionatore.Creare quindi una cartella per i dati dell'esperimento. Quindi, progettare un gradiente HPLC graduale che inizi con un buffer B ad alto contenuto di sale dello zero percento e aumenti del cinque percento a intervalli di due volumi di colonne per raggiungere il 100% di buffer B. Impostare un singolo gradiente in cui non viene iniettato alcun campione. Aprire l'otturatore della linea di luce, avviare la raccolta dei dati SAXS e avviare l'esecuzione HPLC.Prendere nota del numero di fotogrammi trascorsi all'inizio della raccolta dei dati UV/VIS. Dopo la raccolta dei dati, verificare che l'intensità sommata sia rimasta costante per almeno 100 fotogrammi e corrisponda ai valori ottenuti dai campioni dei buffer A e B.Quindi, eseguire un altro metodo HPLC a gradiente graduale, a partire dallo zero percento di buffer B.Creare un passo per ogni percentuale B determinato nell'esecuzione del test di gradiente IEC off-line. Aggiungi i passaggi di sfumatura un punto percentuale sotto e 1,5 punti sopra ciascuno di questi valori.Impostare l'intervallo di ogni fase su 2,5 volumi di colonna e la fase finale del gradiente su 100 percento B.Diluire il surnatante secondo necessità per ottenere la composizione del tampone A.Arrestare le pompe HPLC, scollegare il tubo della colonna dai rivelatori e posizionare l'estremità della linea in un contenitore per raccogliere il flusso della colonna. Quindi, trasferire la linea A del tampone nel campione diluito, assicurandosi che non rimangano intrappolate bolle d'aria nella provetta. Avviare le pompe per aspirare il campione nella colonna.Una volta che il contenitore del campione è quasi vuoto, arrestare le pompe e rimettere in linea il flacone del tampone A. Avviare le pompe e far passare il buffer A attraverso la colonna per due volumi di colonna, quindi arrestare le pompe e ricollegare la colonna ai rilevatori. Utilizzando il nuovo metodo graduale, è possibile impostare una singola esecuzione HPLC senza iniezione automatica del campione.Aprire l'otturatore della linea di luce e acquisire i dati SAXS e UV/VIS. Monitora l'intensità sommata nel tempo. Quindi, utilizzare il software di post-elaborazione per convertire i dati HPLC in un formato ascii.Utilizzando un gestore di dati online, identificare i frame SAXS corrispondenti al picco di eluizione del campione. Verificare che il raggio di giyrazione sia stabile per tutto il picco. Importa i fotogrammi di picco in un programma di elaborazione dati SAXS e crea una curva di scattering media non corretta.Per SCC SAXS, confermare che la regione Q alta del buffer medio, non solo la curva di scattering non corretta. Caricare e scalare i fotogrammi auto-sottratti dal picco, e verificare che non ci siano differenze sistematiche. Calcolare la media di tutte le curve per ottenere la curva SAXS finale.Per IEC SAXS, calcolare una media di 50 fotogrammi da ogni passaggio di sfumatura. Confrontate queste medie con la curva non corretta e selezionate il passo del gradiente con la migliore corrispondenza di Q alto. Sottrarre la media scelta dalla curva non corretta per creare la curva SAXS finale.Infine, determinare la distribuzione della distanza di coppia ed eseguire la modellazione ab initio per determinare il modello più rappresentativo della proteina. I parametri dei dati strutturali ottenuti da SEC e IEC SAXS della proteina D5 erano molto simili. Le stime della massa molecolare erano entrambe in accordo con la massa prevista.La modellazione ab initio è stata eseguita senza simmetria imposta e con simmetria C6. Entrambi i modelli sono compatibili con i dati dell'esperimento, indicando che la struttura proteica possiede simmetria C6. La modellazione molecolare produce una struttura piramidale esogonale con un canale centrale parzialmente ostruito.I modelli medi SEC e IEC erano molto simili. Dopo aver esaminato i singoli modelli, si è scoperto che le ostruzioni del canale erano probabilmente un artefatto del processo di media. SAXS sta diventando ragionevolmente più standard, ma per molti passaggi di purificazione e altri passaggi di cromatografia a scambio ionico necessari per eliminare aggregati o contaminanti.In questo protocollo abbiamo presentato entrambe le tecniche, la cromatografia ad esclusione dimensionale online e la cromatografia a scambio ionico online su una beamline bio SAXS. Un avvertimento di entrambe le tecniche è che la concentrazione precisa della proteina non è nota, quindi non possiamo determinare la diffusione della massa molecolare. Tuttavia, per le proteine globulari, possiamo ancora stimare il volume di massa.Un gradiente lineare potrebbe essere applicato al posto del gradiente a gradini che abbiamo usato qui nella cromatografia a scambio ionico, anche se ciò richiede un'ottimizzazione della condizione tampone per una separazione ottimale dei picchi. Queste tecniche ci permettono di raccogliere dati SAXS di buona qualità, anche su sistemi complicati.

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