Name: Anticancro Efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-01T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Scopri come aumentare l'efficacia della terapia fotodinamica nel trattamento del cancro del polmone utilizzando nanoparticelle mirate caricate con fotosensibilizzatore e farmaco antitumorale.

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Questo studio è stato sostenuto dalla concessione n. 14-2014-017 dal Fondo di ricerca SNUBH. Gli autori sono in debito con J. Patrick Barron, professore emerito, Tokyo Medical University e Professore, Seoul National University Hospital Bundang per il suo pro bono la modifica di questo manoscritto.

NOTA: Tutti i protocolli di studio sugli animali sono stati approvati dal Comitato di Cura e uso istituzionale degli animali di Seoul National University Hospital Bundang (BA1308-134 / 072-01). 1. Sintesi di acido ialuronico-Ceramide (HACE) <ol><li> Solubilizzare 12.21 mmoli di acido ialuronico (HA) oligomero e 9.77 mmoli di tetra- idrossido n -butylammonium (TBA) in 60 ml di acqua bidistillata (DDW). Agitare per 30 min. </li><li> Per sintetizzare il linker DS-Y30 sciogliere 8.59 mmoli di DS-Y30 ceramide e 9.45 mmoli di trietilammina in 25 ml di tetraidrofurano (THF). Mescolare con 8.59 mmol di cloruro di 4-chloromethylbenzoyl in THF. Mescolare per 6 ore a 60 ° C. </li><li> Sciogliere il sintetizzato 8.10 mmoli di HA-TBA e 0,41 mmoli di DS-Y30 linker in una miscela di THF e acetonitrile (4: 1, v / v). Mescolare per 5 ore a 40 ° C. </li><li> Rimuovere impurità filtrando con un agente di filtro, ed eliminare il solvente organico mediante evaporazione sotto vuoto. Purificare il prodotto utilizzando una membrana di dialisi (peso molecolare cut-off: 3,5 kDa) e liofilizzato. </li></ol> 2. Preparazione delle nanoparticelle <ol><li> Sciogliere 1 mg di HB e 1 mg di paclitaxel in 0,5 ml di dimetilsolfossido (DMSO) e miscelare con 0,5 ml di DDW da vortex-miscelazione per 5 min. Poi, solubilizzazione HACE nella mischia dal vortice di miscelazione per un ulteriore 5 min. </li><li> Per eliminare il solvente, il calore a 70 ° C per 4 ore sotto leggera corrente di azoto. </li><li> Risospendere il film composto da HACE, HB, e paclitaxel con 1 ml di DDW. Filtrare con un filtro a siringa (0,45 micron dimensione dei pori) per rimuovere farmaci incapsulati. </li></ol> 3. In Vitro Fototossicità <ol><li> L&#39;assorbimento di nanoparticelle in linee cellulari di cancro al polmone <ol><li> Preparare RPMI-1640 (v / v) di siero fetale bovino medio contenente 10% e 1% (w / v) di penicillina-streptomicina. </li><li> Cellule Seed A549 in piastre di coltura cellulare di 24 pozzetti ad una densità di 1 × 10 5 cellule / pozzetto (triplicato per ognigruppo). Incubare per 24 ore a 37 ° C in un umidificata 5% aria atmosfera di CO 2 e il 95%. </li><li> Dopo l&#39;adesione cellulare, rimuovere il terreno e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di soluzione salina tamponata con fosfato (PBS). </li><li> Sciogliere le nanoparticelle in PBS ad una concentrazione finale di 2 micron / ml HB. Poi, incubare le cellule con 1 ml di PBS, NP vuoti, HB-NP, o HB-P-NP in ciascun pozzetto per 4 ore al buio. </li><li> Rimuovere tutta la soluzione e lavare le cellule aggiungendo 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Aggiungere mezzo di coltura fresco. </li></ol></li><li> saggio vitalità cellulare <ol><li> Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) al buio per diversi periodi di tempo: 0, 5, 10, 20, 30, e 40 sec (0, 2, 4 , 8, 12, e 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio. </li><li>Aspirare il medio e lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. </li><li> Aggiungere 10 ml di soluzione di misura citotossicità in ciascun pozzetto. Incubare al buio per 2 ore. </li><li> Misurare l&#39;assorbanza a 450 nm usando un lettore di micropiastre. </li></ol></li><li> analisi microscopica <ol><li> Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) al buio per 0, 20, o 40 sec (0, 8, o 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio. </li><li> Aspirare il medio e lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. </li><li> Aggiungere 50 ml di annessina V-FITC e 50 ml di 4 &#39;, 6-diamidino-2-fenilindolo (DAPI, 1,5 mg / ml). Agitare delicatamente la piastra e incubare per 15 min a temperatura ambiente al buio. NOTA: Utilizzare annessina V-FITC dal kit microscopio a fluorescenza. </li><li> Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. Mantenere le cellule in PBS fresco. Identificare le cellule apoptotiche mediante microscopia ottica a ingrandimento 100X. </li></ol></li><li> ordinamento fluorescenza delle cellule attivate (FACS) Analisi <ol><li> Posizionare la piastra di coltura cellulare sotto la fibra PDT (con 1 cm di distanza dalla fibra PDT al pozzo). Indossare occhiali di protezione laser e illuminare le cellule con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) per 0, 20, o 40 sec (0, 8, o 16 J / cm 2). Poi, incubare le cellule per 24 ore al buio. </li><li> Aspirare il medio e lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS freddo. Ripetere la fase di lavaggio, ancora una volta. </li><li> Risospendere le cellule in 1 ml di 1 × tampone di legame (diluire 1 parte di tampone legante 10x; 0,1 M Hepes / NaOH (pH 7,4), 1,4 M NaCl, e 25 mM CaCl 2 a 9 parti di acqua distillata) e trasferimento 100 microlitri della soluzione campione 5 mltubo di cultura. </li><li> Aggiungere 5 ml di annessina V-FITC e 5 ml di ioduro di propidio (PI). Agitare delicatamente la provetta e incubare per 15 minuti a temperatura ambiente (RT) al buio. Aggiungere 400 ml di 1 × tampone vincolante. NOTA: Utilizzare annessina V-FITC e PI dal kit microscopio a fluorescenza. </li><li> Identificare le cellule apoptotiche utilizzando FACS 14. Le linee laser di eccitazione di PI e annessina V-FITC sono 488 nm e 635 nm, rispettivamente. Misurare l&#39;emissione di fluorescenza di PI e annessina V-FITC a 610 ± 20 nm e 660 ± 20 nm, rispettivamente. Raccogliere le cellule acquisite sul citometro di flusso per 10.000 eventi. </li></ol></li></ol> 4. In vivo l&#39;efficacia antitumorale nei topi portatori di tumore <ol><li> Lung modello murino di cancro indotto <ol><li> Preparare 1 × 10 6 cellule A549 in 0,1 ml di mezzo RPMI-1640; tenerlo in ghiaccio. </li><li> Anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml /kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. NOTA: Se si osserva alcun movimento, l&#39;animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti. </li><li> Iniettare le cellule per via sottocutanea nei fianchi sinistra del BALB / C maschile topi nudi (6 - 7 settimane di vita, 20 - 22 g). </li><li> Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia. NOTA: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato. Mantenere i topi in condizioni specifiche esenti da organismi patogeni (SPF). </li><li> Misurare la dimensione del tumore con pinze ogni giorno. Calcolare il volume del tumore (mm 3) come (lunghezza x larghezza 2) / 2. Quando la dimensione del tumore raggiunge circa 200 mm 3 di volume, iniziare l&#39;esperimento. </li&gt; </ol></li><li> studio di efficacia antitumorale <ol><li> Casualmente dividere i topi in 4 gruppi (n = 10 per ciascun gruppo). </li><li> Anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. NOTA: Se si osserva alcun movimento, l&#39;animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti. </li><li> Sciogliere le nanoparticelle in PBS ad una concentrazione finale di 2 mg / ml HB. Iniettare PBS, libero HB, HB-NP, o HB-P-NP attraverso la vena della coda (2 mg / kg come HB) due volte nei giorni 0 e 7. </li><li> Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia. NOTA: Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino al completorecuperato. Mantenere le gabbie buio e in condizioni SPF specifiche. </li><li> 24 ore dopo ciascuna iniezione, anestetizzare i topi con una iniezione ip di xilazina e una miscela di tiletamina e zolazepam (1: 2, 1 ml / kg). Verificare il corretto anestesia pizzicando delicatamente una piccola piega della pelle del mouse. Utilizzare veterinario pomata per gli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. NOTA: Se si osserva alcun movimento, l&#39;animale è sufficientemente anestetizzati per avviare gli esperimenti. </li><li> Posizionare il sito del tumore sotto della fibra PDT (di 1 cm di distanza dalla fibra PDT al tumore). Indossare occhiali di sicurezza laser, spegnere l&#39;interruttore, e illuminare il tumore con un laser PDT (630 nm, 400 mW / cm 2) per 500 sec (200 J / cm 2) due volte nei giorni 1 e 8. </li><li> Mantenere osservando il mouse fino a quando iniziano a muoversi intorno alla gabbia. Non lasciare un animale incustodito fino a quando non ha ripreso conoscenza sufficiente a mantenere decubito sternale. Non restituire un animale che ha oggetto d&#39;importanti lavorie un intervento chirurgico per la compagnia di altri animali fino alla completa guarigione. </li><li> Mantenere le gabbie in condizioni SPF. Mantenere le gabbie al buio per 24 ore dopo il trattamento laser. </li><li> Visivamente controllare il volume del tumore ed i cambiamenti al sito del tumore ogni giorno. Misurare la dimensione del tumore con pinze, e calcolare il volume (lunghezza x larghezza 2) / 2 (mm 3). Scattare foto dei siti tumorali ogni giorno per verificare la presenza di alterazioni della superficie del tumore dopo PDT. </li><li> Il giorno 16, sacrificare cinque topi per gruppo da anestesia terminali che utilizzano isoflurano. </li><li> Con pinze e forbici, tagliare la pelle esterna ed esporre i tumori 15. li raccolto con cura. Fissarli in formalina al 10%, incorporarli in paraffina, e li macchiare con ematossilina e eosina (H &amp; E) per l&#39;analisi istologica 16. </li><li> Dopo 45 giorni di monitoraggio, sacrificare i topi rimanenti anestesia terminali che utilizzano isoflurano. </li></ol></li></ol>

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<li>Fischer, A. H., Jacobson, K. A., Rose, J., Zeller, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hematoxylin+and+eosin+staining+of+tissue+and+cell+sections%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harbor+Protocols%22%5BJournal%5D)">Hematoxylin and eosin staining of tissue and cell sections.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (5), (2008).</li>
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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

La fase più critica in questo studio sta selezionando le condizioni appropriate laser: lunghezza d&#39;onda, il potere, e il tempo di irradiazione. La corretta lunghezza d&#39;onda della luce adatta per il fotosensibilizzatore specifico è necessario per la PDT. Abbiamo utilizzato un laser a 630 nm, che era appropriato per hypocrellin B. La potenza di uscita è stato un altro fattore importante, che è stato fissato a 400 mW / cm 2 sulla base di molti studi pilota. Potenze di uscita superiore a 400 mW / cm ...

La terapia fotodinamica (PDT) è composta da tre fattori principali: fotosensibilizzatori, luce e ossigeno. La PDT è segnalata come un trattamento promettente per vari tipi di cancro3. Quando i fotosensibilizzatori vengono somministrati al paziente oncologico, si accumulano selettivamente nei tessuti tumorali. Quando viene applicata la corretta lunghezza d'onda della luce, l'ossigeno singoletto altamente reattivo e altri radicali liberi portano al danno delle cellule tumorali4. 
Il cancro ai polmoni è stato introdotto come una delle prime applicazioni per la PDT nei primi anni '805. La PDT offre diversi vantaggi nel trattamento del cancro del polmone. Poiché la PDT è un trattamento non invasivo e non chirurgico, è una scelta alternativa interessante per i pazienti in cui la resezione chirurgica è inappropriata.
Ci sono state molte sfide per migliorare l'efficacia dei fotosensibilizzatori nel campo del cancro. L'aumento dell'accumulo di fotosensibilizzanti nei siti tumorali e la diminuzione dell'accumulo nei tessuti normali sono gli obiettivi identici per gli studi mirati al cancro. Una varietà di sistemi di somministrazione di farmaci mirati, come polimeri, liposomi e nanoparticelle sono adottati come vettori fotosensibilizzanti6-8. Nei nostri studi precedenti, le nanoparticelle hanno aumentato efficacemente le capacità di targeting del cancro dei fotosensibilizzatori9,10. Le nanoparticelle sono vettori ideali per il cancro poiché possiedono capacità di targeting sia passive che attive. I vasi tumorali che perdono offrono ai portatori di dimensioni nanometriche l'opportunità di accumularsi facilmente nei tumori, che è ben noto come effetto di permeabilità e ritenzione (EPR) potenziato11,12. L'interazione tra le nanoparticelle e i recettori specifici sulle cellule tumorali consente il targeting attivo del cancro. In questo studio, abbiamo preparato nanoparticelle a base di acido ialuronico per interagire con CD44, il principale recettore dell'acido ialuronico che è sovraespresso sulle cellule tumorali del polmone13. 
Per massimizzare l'efficacia antitumorale, nel presente studio viene adottata una combinazione di PDT e chemioterapia. Questo concetto di combinazione può consentire un aumento dell'effetto terapeutico. Inoltre, dosi ridotte sia del fotosensibilizzante che del farmaco antitumorale possono ridurre gli effetti avversi. Abbiamo selezionato l'ipocrellina B (HB) come nuovo fotosensibilizzante nel presente studio. L'HB è isolato dal fungo medicinale cinese Hypocrella bambuase. Shang et al. hanno riportato che la PDT basata su HB possiede una maggiore efficacia antitumorale rispetto alla PDT1 basata su derivati dell'ematoporfirina. Il paclitaxel è stato selezionato come farmaco antitumorale poiché ha dimostrato di essere un potenziale trattamento per vari tipi di cancro, tra cui il cancro ai polmoni2. 
Qui, abbiamo confrontato l'efficacia antitumorale della soluzione fotosensibilizzante (ipocrellina B, HB), delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore (HB-NP) e delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore e agente antitumorale (paclitaxel) (HB-P-NP) dopo PDT. Sono state valutate la fototossicità in vitro nelle cellule A549 (adenocarcinoma polmonare umano) e l'efficacia antitumorale in vivo nei topi portatori di tumore A549.

<table><tbody><tr><td>acido ialuronico oligo</td><td>Bioland Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>DS-Y30 (ceramide 3B; principalmente N-oleoil-fitosfingosina)</td><td>Doosan Biotech Co., Ltd.</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>acido adipico diidrazide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A0638</td><td></td></tr><tr><td>N-(3-dimetilamminopropil)-N&prime; -etilcarbodiimmide</td><td>Sigma Aldrich</td><td>39391</td><td></td></tr><tr><td>4-(clorometil)benzoile cloruro</td><td>Sigma Aldrich</td><td>270784</td><td></td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Tokyo Chemical Industry Co., Ltd.</td><td>T0546</td><td></td></tr><tr><td>filtro per siringa</td><td>Sartorius Stedim Biotech GmbH</td><td>17762</td><td>15 mm, RC, PP, 0,45 &micro; m</td></tr><tr><td>trietilammina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T0886</td><td></td></tr><tr><td>Mini-GeBAflex tubi</td><td>Gene Bio-Application Ltd.</td><td>D070-12-100</td><td></td></tr><tr><td>Paclitaxel</td><td>Taihua Corporations</td><td>_</td><td></td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>11875</td><td></td></tr><tr><td>Penicillina&ndash; streptomicina</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td>15070</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Gibco Life Technologies, Inc.</td><td></td><td></td>16140071</tr><tr><td>Celite (Filtrante)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>6858</td><td>Vedere il passaggio 1.4</td></tr></tbody></table>

anticancro efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle

Anticancer Efficacy of Photodynamic Therapy with Lung Cancer-Targeted Nanoparticles

La terapia fotodinamica (PDT) è un metodo non invasivo e non chirurgico che rappresenta un'interessante scelta alternativa per il trattamento del cancro del polmone. I fotosensibilizzatori si accumulano selettivamente nel tessuto tumorale e portano alla morte delle cellule tumorali in presenza di ossigeno e della corretta lunghezza d'onda della luce.
Per aumentare l'effetto terapeutico della PDT, abbiamo sviluppato nanoparticelle mirate al cancro del polmone caricate con fotosensibilizzatore e antitumorale. Sono stati applicati sia il targeting passivo basato sull'effetto di permeabilità e ritenzione (EPR) potenziato che il targeting attivo basato sull'interazione acido ialuronico-CD44. Il CD44 è un noto recettore dell'acido ialuronico che viene spesso introdotto come biomarcatore del carcinoma polmonare non a piccole cellule. 
Inoltre, nel presente studio viene adottata una combinazione di PDT e chemioterapia. Questo concetto di combinazione può aumentare gli effetti terapeutici antitumorali e ridurre le reazioni avverse. 
Abbiamo scelto l'ipocrellina B (HB) come nuovo fotosensibilizzante in questo studio. È stato riportato che l'HB provoca una maggiore efficacia antitumorale della PDT rispetto ai derivati dell'ematoporfirina1. Il paclitaxel è stato selezionato come farmaco antitumorale poiché ha dimostrato di essere un potenziale trattamento per il cancro del polmone2. 
Le efficacia antitumorali della soluzione fotosensibilizzante (HB), delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore (HB-NP) e delle nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide incapsulate con fotosensibilizzatore e agente antitumorale (paclitaxel) (HB-P-NP) dopo PDT sono state confrontate sia in vitro che in vivo. Sono state valutate la fototossicità in vitro nelle cellule A549 (adenocarcinoma polmonare umano) e l'efficacia antitumorale in vivo nei topi portatori di tumore A549.
Il gruppo di trattamento HB-P-NP ha mostrato l'effetto antitumorale più efficace dopo la PDT. In conclusione, le HB-P-NP preparate nel presente studio rappresentano un potenziale e nuovo sistema di rilascio di fotosensibilizzatori nel trattamento del carcinoma polmonare con PDT.

Abbiamo preparato sia HB-NP e HB-P-NP con le tecniche di cui sopra. I diametri medi di HB-NP e HB-P-NP erano 220,9 ± 3,2 nm e 211.9 ± 1.6 nm, rispettivamente. La vitalità cellulare delle cellule A549 dopo 4 ore di incubazione con PBS, NP vuoti, HB-NP e HB-P-NP seguito da irradiazione di luce (0 a 16 J / cm 2) è mostrato in Figura 1. Senza luce, la gruppo di trattamento HB-NP non ha mostrato citotoss...

La terapia fotodinamica (PDT) è una scelta alternativa per il trattamento del cancro al polmone. Per aumentare l'effetto terapeutico della PDT, sono state sviluppate nanoparticelle mirate al cancro del polmone combinate con la chemioterapia. Sono state valutate l'efficacia antitumorale della PDT sia in vitro che in vivo con nanoparticelle preparate.

Anticancro Efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle

Photodynamic therapy (PDT) is a non-invasive and non-surgical method representing an attractive alternative choice for lung cancer treatment. ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è aumentare l'effetto terapeutico della terapia fotodinamica nel trattamento del cancro del polmone utilizzando nanoparticelle mirate al cancro del polmone caricate sia con fotosensibilizzatore che con farmaco anticancro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande fondamentali nel campo della terapia fotodinamica, come ad esempio quali siano le condizioni ottimali degli agenti per studi in vitro e in vivo. Poiché le terapie fotodinamiche sono ampiamente utilizzate nei settori oncologici, studi preliminari su lesioni precancerose con fotosensibilizzatori convenzionali o nuove indicazioni possono essere condotti mediante questa tecnica.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla terapia di diverse malattie come la tubercolosi, le ulcere e i campi della dermatologia, utilizzando diversi moduli annuali. Per iniziare, sintetizzare il ceramide acido ialuronico come descritto nel protocollo testuale allegato. Purificare il prodotto utilizzando una membrana dialitica da 3,5 kilodalton e mionfalizzarlo.Successivamente, preparare nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide da sole. Nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide insieme a un fotosensibilizzatore e nanoparticelle di acido ialuronico-ceramide con un agente antitumorale e il fotosensibilizzatore. Seminare la linea cellulare di cancro al polmone A549 nei pozzetti di una piastra per colture cellulari a 24 pozzetti a una densità di 1 × 10⁵ cellule per pozzetto e incubare le cellule per 24 ore.Il giorno successivo, rimuovere il mezzo e lavare le cellule con un millilitro di PBS. Quindi, sciogliere i nanoparticelle preparate in PBS fino a una concentrazione finale di due micromoli per millilitro del fotosensibilizzatore Hypocrellin B mediante vortex. In quattro pozzetti ciascuno contenenti un millilitro di PBS, aggiungere un millilitro di nanoparticelle vuote di acido ialuronico-ceramide, un millilitro di nanoparticelle contenenti il fotosensibilizzatore e un millilitro di nanoparticelle contenenti sia il fotosensibilizzatore sia il farmaco antitumorale.Al termine, coprire la piastra e incubarla a 37 gradi Celsius per quattro ore al buio per consentire l'assorbimento delle nanoparticelle da parte delle cellule. Successivamente, rimuovere tutta la soluzione e lavare le cellule aggiungendo un millilitro di PBS freddo. Ripetere il lavaggio una volta ancora, quindi aggiungere mezzo di coltura fresco.Successivamente, posizionare la piastra per colture a 24 pozzetti sotto una fibra per terapia fotodinamica e posizionare la fibra a un centimetro dal primo pozzetto. La distanza tra la fibra per terapia fotodinamica e le cellule era il fattore critico in questo studio. Era importante determinare la distanza ottimale in grado di illuminare completamente l'intera popolazione cellulare.Quindi, indossare occhiali di sicurezza e spegnere le luci. Illuminare le cellule con il laser al buio per un periodo compreso tra cinque e 40 secondi, al fine di attivare l'ossigeno singoletto altamente reattivo e altri radicali liberi nei nanoparticelle contenenti il fotosensibilizzatore. Dopo l'esposizione alla luce, incubare le cellule al buio per 24 ore.Successivamente, aspirare il mezzo di coltura e lavare le cellule con un millilitro di PBS freddo. Ripetere il lavaggio un'altra volta, quindi aggiungere 100 microlitri di mezzo e 10 microlitri di soluzione per la misurazione della citotossicità in ciascun pozzetto. Incubare le cellule nella soluzione per due ore al buio, quindi trasferire tutti i campioni in una piastra a 96 pozzetti.Misurare l'assorbanza a 450 nanometri utilizzando un lettore microplacche. Raccogliere le cellule A549 e risospendere un milione di cellule in 0,1 millilitri di mezzo RPMI-1640. Porre le cellule risospese sul ghiaccio.Successivamente, preparare un topo maschio nudo BALB/C per l'iniezione. Quindi, caricare le cellule in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge ed iniettarle nel fianco sinistro del topo. Misurare le dimensioni del tumore ogni giorno con un calibro.Quando il volume del tumore raggiunge circa 200 millimetri cubi, iniziare l'esperimento pesando innanzitutto ogni topo. Successivamente, sciogliere le nanoparticelle in PBS fino a una concentrazione finale di due milligrammi per millilitro e caricare un microlitro della sospensione per grammo di topo in una siringa da un millilitro dotata di un ago da 26 gauge. Iniettare le nanoparticelle mediante iniezione nella vena della coda al giorno zero e al giorno sette.24 ore dopo ogni iniezione, anestetizzare il topo e posizionare il sito tumorale sotto la fibra della terapia fotodinamica in modo che sia a un centimetro dalla fibra. È fondamentale coprire l'intera superficie del tumore con la luce per ottenere i migliori risultati. Indossare gli occhiali di protezione per il laser, spegnere l'interruttore della stanza e illuminare il tumore con un laser per terapia fotodinamica per 500 secondi sia al primo che all'ottavo giorno.Dopo il trattamento laser, mantenere i topi nelle loro gabbie al buio per 24 ore. Monitorare visivamente ogni giorno il volume del tumore e le modifiche al sito tumorale. Utilizzare un calibro per misurare le dimensioni del tumore e scattare fotografie dei siti tumorali ogni giorno per verificare eventuali alterazioni della superficie.Qui è mostrata la vitalità delle cellule tumorali del polmone dopo quattro ore di incubazione con le nanoparticelle seguita da irradiazione luminosa. In assenza di luce, le cellule esposte alle nanoparticelle contenenti soltanto il fotosensibilizzatore non hanno mostrato alcun segno di tossicità, mentre le cellule esposte alle nanoparticelle contenenti sia il fotosensibilizzatore che il paclitaxel hanno mostrato una vitalità cellulare pari a circa l'81%. Con l'aumentare del tempo di irradiazione, la vitalità cellulare è diminuita in entrambi i gruppi trattati con il fotosensibilizzatore.Il gruppo di trattamento contenente anche paclitaxel ha mostrato la maggiore quantità di fototossicità. Ciò si è rispecchiato anche nello studio del modello tumorale, poiché il volume tumorale nei topi trattati con questi due gruppi di trattamento era inferiore rispetto ai controlli. Inoltre, il gruppo trattato con nanoparticelle contenenti paclitaxel e fotosensibilizzatore era significativamente più basso rispetto a tutti gli altri gruppi.Sebbene le dimensioni del tumore fossero significativamente ridotte, i topi trattati con nanoparticelle contenenti sia il fotosensibilizzatore che il paclitaxel hanno mostrato un grave sanguinamento e lo sviluppo più rapido della necrosi. Dopo lo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai trattamenti laser nel campo della terapia fotodinamica per esplorare il trattamento del cancro in sistemi in vitro e in vivo. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come condurre la terapia fotodinamica in sistemi in vitro e in vivo.

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La terapia fotodinamica (PDT) è un metodo non invasivo e non chirurgico per il trattamento del cancro del polmone. I fotosensibilizzatori si accumulano selettivamente nel tessuto tumorale e portano alla morte delle cellule tumorali in presenza di ossigeno e della corretta lunghezza d'onda della luce. In questo video protocollo, viene utilizzato un metodo basato sulla PDT per valutare il potenziale fototossico di un potenziale fotosensibilizzatore nelle cellule di cancro del polmone.

Saggio di fototossicità in vitro: un metodo basato sulla PDT per valutare il potenziale fototossico di un fotosensibilizzatore nelle cellule di cancro del polmone

La terapia fotodinamica (PDT) è un metodo non invasivo e non chirurgico per il trattamento del cancro del polmone. I fotosensibilizzatori si accumulano selettivamente nel tessuto tumorale e portano alla morte delle cellule tumorali in presenza di ossigeno e della corretta lunghezza d'onda della luce. Questo video descrive l'analisi in vivo dell'efficacia antitumorale utilizzando fotosensibilizzatore contenente nanoparticelle in un topo portatore di tumore, per determinare il potenziale...

Analisi dell'efficacia antitumorale in vivo della PDT: una tecnica per determinare il potenziale fototossico di un fotosensibilizzatore nei topi portatori di tumore

Questo video dimostra una tecnica di fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso per trattare il cancro del polmone in un modello murino ingegnerizzato che mostra cellule tumorali che esprimono luciferasi. Dopo aver iniettato un coniugato anticorpo-fotosensibilizzante (APC) che si lega ad antigeni specifici sulle cellule tumorali, il topo viene esposto a radiazioni nel vicino infrarosso, inducendo cambiamenti fotochimici nell'APC e portando alla morte necrotica delle cellule tumorali legate.

Una tecnica di fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso per il trattamento del cancro ai polmoni in un modello murino

Il protocollo qui riportato permette di valutare l'efficacia della terapia fotodinamica (PDT) in linee cellulari e l'ottimizzazione delle impostazioni PDT prima di applicare la terapia in modelli animali.

Citotossico Efficacia della terapia fotodinamica in cellule di osteosarcoma<em&gt; In Vitro</em

Questo protocollo descrive un metodo per la fabbricazione di nanoparticelle polimeriche conduttrici miscelate con fullerene. Queste nanoparticelle sono state studiate per il loro potenziale utilizzo come fotosensibilizzatori di nuova generazione per la terapia fotodinamica (PDT).

Terapia fotodinamica con Blended Condurre Polimero / Fullerene nanoparticelle fotosensibilizzanti

La fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso (NIR-PIT) è una strategia terapeutica emergente per il cancro che utilizza un coniugato anticorpo-fotoassorbitore (IR700Dye) e la luce NIR per distruggere le cellule tumorali. Qui, presentiamo un metodo per valutare l'effetto antitumorale di NIR-PIT in un modello murino di carcinoma polmonare disseminato pleurico e mesotelioma pleurico maligno utilizzando l'imaging a bioluminescenza.

Fotoimmunoterapia nel vicino infrarosso per modelli murini di disseminazione pleurica

Qui, descriviamo un dispositivo nuovo, semplice e a basso costo per eseguire con successo saggi di terapia fotodinamica in vitro (PDT) utilizzando colture cellulari HeLa bidimensionali e verteporfina come fotosensibilizzante.

Un dispositivo di terapia fotodinamica costruito internamente e basato su diodi emettitori di luce per migliorare la citotossicità delle verteporfine in un modello di coltura cellulare 2D

Questo manoscritto presenta un nuovo e innovativo dispositivo di illuminazione stampato in 3D per lo studio della terapia fotodinamica mediata dal Rose Bengala in vitro.

Sviluppo di un innovativo dispositivo di illuminazione basato su LED per l'applicazione in vitro della terapia fotodinamica con il Rose Bengal

Questo protocollo presenta le tecniche e la metodologia necessarie per la terapia ipertermica mirata in modelli di tumori solidi. L'approccio sfrutta la conversione fototermica della luce nel vicino infrarosso mediante nanobarre d'oro iniettate per via intratumorale per indurre un riscaldamento localizzato all'interno del microambiente tumorale.

Induzione di una lieve ipertermia mirata in modelli di tumore murino attraverso la conversione fototermica della luce nel vicino infrarosso mediante nanobarre d'oro intratumorali

Qui viene presentata una procedura per impiantare cellule tumorali pancreatiche che esprimono proteine fluorescenti verdi (PANC-1 GFP) ortotopicamente nel pancreas di topi Balb-c Ola Hsd-Fox1nu per valutare la progressione del tumore e le metastasi.

Fluorescente ortotopico modello murino di cancro al pancreas

Scopri come aumentare l'efficacia della terapia fotodinamica nel trattamento del cancro del polmone utilizzando nanoparticelle mirate caricate con fotosensibilizzatore e farmaco antitumorale.

Anticancro Efficacia della terapia fotodinamica con cancro del polmone con targeting nanoparticelle

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