Plunge congelamento: uno strumento per l'ultrastrutturali e Immunolocalizzazione Studi di cellule in sospensione in microscopia elettronica a trasmissione

L'obiettivo dei seguenti esperimenti è quello di proporre uno strumento per studi ultrastrutturali e di immunolocalizzazione di cellule in sospensione per la visualizzazione in microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è facile da usare, a basso costo e offre un'eccellente conservazione della struttura cellulare. Questa è una coltura di cellule in sospensione.

In primo luogo, le cellule vengono raccolte mediante diverse centrifugazioni per ottenere un pellet in una provetta da microcentrifuga. In una seconda fase, il campione viene rapidamente congelato mediante congelamento a tuffo, che immobilizza le cellule e limita la formazione di cristalli di ghiaccio. Successivamente, viene eseguita la sostituzione con congelamento al fine di sostituire l'acqua con solvente contenente tetrossido di osmio come fissativo per stabilizzare le strutture cellulari.

I risultati mostrano che il congelamento a tuffo e la sostituzione del congelamento preservano perfettamente l'infrastruttura delle cellule. La fissazione chimica era un metodo primario per fissare tessuti o cellule per la microscopia elettronica a trasmissione, ma con questo metodo si osservano solitamente artefatti ed estrazione di contenuti cellulari. Un'alternativa alla fissazione chimica è la criofissazione.

Questo metodo rappresenta la scelta migliore per produrre la massima qualità di morfologia in sezioni sottili di resina. Il congelamento a tuffo è una tecnica di criofissazione che immobilizza istantaneamente le molecole nella cellula per evitare danni causati dalla fissazione chimica convenzionale. Prima del congelamento a immersione del campione, è necessario preparare la griglia tagliata con la pellicola Formvar per essere utilizzata come supporto per il congelamento.

Lucidare il vetrino con un panno privo di lanugine fino a renderlo lucido e pulirlo. Immergere il vetrino in una soluzione di Formvar 0,3% in cloroformio per alcuni secondi e lasciarlo asciugare in posizione verticale in un bicchiere. La manipolazione deve essere effettuata sotto cappa aspirante utilizzando dispositivi di protezione individuale a causa della presenza di cloroformio.

Dopo aver riempito un cristallizzatore con acqua distillata, passare sulla superficie dell'acqua una barra di vetro per rimuovere la polvere. Quando la pellicola è asciutta, incidere i bordi con una lama di rasoio affilata in modo che la pellicola possa sollevarsi. Glassare il vetrino espirando pesantemente sul vetrino per ottenere uno strato di vapore acqueo sulla pellicola.

Far galleggiare immediatamente la pellicola sulla superficie dell'acqua toccando il fondo dello scivolo con un angolo di circa 30 gradi rispetto alla superficie dell'acqua. Abbassare lentamente il vetrino nella vasca, staccando la pellicola se necessario. Il film di Formvar si deposita lentamente sulla superficie dell'acqua.

Attacca la pellicola sul bordo del cristallizzatore usando una pinzetta. Appoggiare delicatamente le griglie di rame da 400 maglie a faccia in giù sulla pellicola nelle regioni dello spessore corretto e senza rughe. La pellicola con le griglie viene prelevata coprendole con carta Joseph mentre galleggiano sulla superficie dell'acqua.

Raccogli il bordo della carta Joseph e la pellicola con le griglie dovrebbe venire con essa. Non lasciare che le dita tocchino la superficie dell'acqua o corri il rischio di lasciare una pellicola nell'acqua. Lasciare asciugare le griglie diverse ore prima di utilizzarle.

Per gli studi ultrastrutturali, mettere l'ampolla di tetrossido di osmio in un pallone di vetro. Agitare bene il pallone per rompere la fiala. Aggiungere un volume appropriato di acetone al 100% per ottenere una concentrazione finale del 4%Agitare il pallone contenente il mezzo di sostituzione del congelamento ed erogare aliquote da 1,5 millilitri nei crioviali con pipetta di trasferimento in plastica.

Chiudere tutti i tappi e conservare in congelatore a meno 84 gradi prima dell'uso. Per gli studi di immunomarcatura delle proteine, preparare lo 0,1% di acetato di uranile in acetone. Quando la soluzione diventa limpida, filtrare con un filtro da 0,2 micrometri ed erogare aliquote da 1,5 millilitri nei crioviali.

Conservare in congelatore a meno 84 gradi prima dell'uso. Per essere sicuri di avere la consistenza appropriata di pellet provenienti da diversi tipi di cellule, le cellule di lievito grezzo in un minimo di mezzo liquido completo per ottenere da 10 a nove cellule. Escherichia coli in terreno DTY per ottenere cinque cellule batteriche da 10 a 10

Leishmania flagellum in AM medium e Trypanosoma brucei in SDM79 medium per ottenere cinque 10 alle otto cellule del parassita. Trasferire il terreno di coltura contenente le cellule in sospensione in una provetta di propilene da 50 millilitri e centrifugare per tre minuti a 1.500 g. Rimuovere il surnatante e risospendere il pellet in un millilitro del rispettivo terreno di coltura cellulare.

Centrifugare in una provetta da microcentrifuga per un minuto a 3.900 g. Rimuovere completamente il surnatante. Per il metodo di congelamento a tuffo, è necessario utilizzare una bombola di propano con un tubo collegato alla bombola di propano.

Essendo il propano potenzialmente esplosivo, realizza la liquefazione in una stanza ben ventilata o in una cappa aspirante. Non sono ammesse fiamme libere. I dispositivi di protezione individuale, compresi i crioguanti, devono essere sempre indossati quando si utilizza l'azoto liquido.

Mettere una piccola quantità di azoto liquido nella vaschetta di polistirolo. Mettere la tazza di ottone nell'azoto liquido. Appaiono delle bolle.

Aspetta che le bolle si plachino. La tazza di ottone viene quindi congelata. Mettere il tubo collegato alla bombola di propano a contatto con la parete del tappo in ottone.

Aprire delicatamente la valvola della bombola di propano. Si forma molto fumo quando il propano non inizia a liquefarsi. Quando il propano inizia a liquefarsi, il fumo scompare.

Arrestare la liquefazione chiudendo la valvola della bombola di propano e rimuovendo rapidamente il tubo collegato alla bombola di propano. Riempi la vaschetta di polistirolo con azoto liquido fino a cinque millimetri dalla parte superiore della tazza di ottone. Congelare piccole tazze di ottone dove sostituiremo il campione dopo il congelamento mettendole in azoto liquido.

Metti una tazza per un campione. Fare attenzione a non mescolare i campioni. Per ottenere l'adeguata consistenza del pellet, è sufficiente rispettare le condizioni di coltura e i parametri di centrifugazione indicati in precedenza.

Congelare le pinzette prima di utilizzarle. Prendi una griglia per microscopia in rame da 400 mesh tagliata con Formvar. Immergere un ago da dissezione a doppio taglio nel pellet.

Mettere, utilizzando l'attrezzo, una goccia di pellet sulla griglia. Immergere molto rapidamente la griglia nel propano liquido e mescolare per qualche secondo. Trasferire rapidamente la griglia congelata nella piccola tazza di ottone.

Per ogni campione, crea almeno tre griglie. Non dimenticare di congelare le pinzette prima di prendere una griglia. Congelare le pinzette prima di utilizzarle.

Rimuovere rapidamente la coppetta e trasferire le griglie congelate nel crioviale utilizzando le pinzette. Rimettere il tappo sul crioviale. Ripetere l'operazione per ogni griglia di ogni campione.

Chiudere i tappi e mescolare il crioviale per assicurarsi che i campioni siano in mezzo di sostituzione del congelamento. Lasciate i crioviali per tre giorni nel congelatore a meno 84 gradi. Trasporta i crioviali in un vassoio di polistirolo per evitare un improvviso aumento della temperatura fino al congelatore a meno 30 gradi.

Lasciate un'ora a meno 30 gradi. Trasportare i crioviali a meno 15 gradi per due ore, quindi mettere i campioni a quattro gradi per due ore e 30 minuti a temperatura ambiente. Rimuovere il mezzo di sostituzione del congelamento utilizzando pipette di trasferimento in plastica e metterlo in un apposito flacone di scarto chiaramente identificato.

Metti circa 500 microlitri di acetone al 100%. Aprire la fiala di vetro e mescolare la crioviale e mettere rapidamente il mezzo di sostituzione del congelamento in una fiala di vetro. Sciacquare un crioviale con acetone al 100%.

Risciacquare tre volte 10 minuti con acetone al 100%. Trasporta i crioviali in un vassoio di polistirolo per evitare un improvviso aumento della temperatura fino al congelatore a meno 30 gradi. Lasciare due ore a meno 30 gradi.

Dopo aver messo i campioni in una fiala di polipropilene, sostituire il mezzo di sostituzione del congelamento con un mezzo di sostituzione del congelamento fresco e lasciare due ore a meno 30 gradi. Risciacquare un'ora con acetone al 100% e tre volte un'ora con etanolo al 100%. Il metodo di congelamento/sostituzione con congelamento a tuffo ha permesso di ottenere un'eccellente conservazione delle strutture intracellulari delle cellule in sospensione.

In Saccharomyces cerevisiae, le strutture non sono rimpicciolite e il citoplasma appare denso. Inoltre, le membrane sono lisce, il che è una prova di una buona conservazione. Tutti gli organelli, come il nucleo, i mitocondri e i vacuoli possono essere perfettamente identificati.

Un'eccellente conservazione si osserva anche in Leishmania flagellum, Trypanosoma brucei ed Escherichia coli. Nel nucleo, sono distintamente visibili la doppia membrana che forma l'involucro nucleare, il poro nucleare, il corpo del polo del fuso e i ribosomi attaccati alla membrana esterna dell'involucro nucleare. Nei mitocondri, le invaginazioni della membrana interna, chiamate cristae, sono chiaramente visibili.

Gli organelli critici sono i vacuoli, perché i grandi cristalli di ghiaccio possono svilupparsi facilmente. Nell'immagine, i vacuoli sono perfettamente conservati senza danni ai cristalli di ghiaccio. Il metodo di congelamento a immersione/sostituzione con congelamento a tuffo può essere utilizzato anche per eseguire l'immunolocalizzazione delle proteine.

La procedura preserva perfettamente l'antigenicità proteica e, come accennato in precedenza, gli organelli sono chiaramente identificati. Diversi anticorpi sono già stati testati per colpire diverse proteine nel lievito, come l'anti-ATP sintasi e l'anti-porina. Tale esperimento è possibile anche per diversi sistemi sperimentali, come nella Leishmania, dove la proteina flabarina è stata localizzata.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare i campioni con il metodo di congelamento/sostituzione del congelamento a tuffo per visualizzarli nella microscopia elettronica a trasmissione. Questa tecnica è rapida, facile da usare, a basso costo e offre un'eccellente conservazione delle infrastrutture cellulari. Attenzione all'azoto liquido, ma soprattutto al tetrossido di osmio e all'acetato di uranile.

Devono essere maneggiati nella cappa aspirante indossando adeguati dispositivi di protezione individuale, inclusi camice da laboratorio e guanti.