Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la chemiluminescenza per quantificare l'ossido nitrico nei campioni biologici quantificando i livelli di nitrito e nitrato, utilizzando soluzioni riducenti di triioduro e cloruro di vanadio. Questo protocollo fornisce un potente strumento per monitorare il metabolismo e la segnalazione dell'ossido nitrico, sia a livello regionale che longitudinale, da una varietà di campioni biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua semplicità e l'elevata sensibilità.

A dimostrare questa procedura sarà Katelyn Cassel, la nostra borsista IRTA. Ci mostrerà come misurare il nitrito mediante chemiluminescenza accoppiata con una soluzione di triioduro. Per iniziare, prepara una soluzione conservante per nitriti.

Preparare una soluzione contenente un NEM da 118 millimolari e 890 millimolari di ferrocianuro di potassio in acqua distillata. Sciogliere i solidi fino a quando la soluzione non diventa di colore giallo limpido senza cristalli. Quindi aggiungere questa soluzione a NP 40 in un rapporto volume / volume di 9 a 1.

Mescolare delicatamente la soluzione per evitare la formazione di schiuma. Non vorticare mai questa miscela. La soluzione conservante di nitriti può essere utilizzata per circa una settimana se conservata a 4 gradi Celsius.

Il protocollo può essere utilizzato su molti campioni biologici appena ottenuti. In questo caso, il sangue appena prelevato è stato centrifugato per ottenere un campione di plasma per il test. È molto importante elaborare il sangue o qualsiasi campione biologico contenente una grande quantità di proteine eme, come l'emoglobina o la mioglobina il più rapidamente possibile, perché le proteine eme reagiranno con il nitrito e distruggeranno il nitrito.

Ora, al fine di preservare la maggior parte del nitrito endogeno del sangue, mescolare immediatamente il plasma con una soluzione conservante di nitriti in un rapporto da 1 a 4 volume per volume. Durante qualsiasi fase di questa preparazione, il campione può essere congelato su ghiaccio secco. Per deproteinare il campione, mescolarlo con una parte uguale di metanolo freddo.

Quindi, centrifugare il campione a 13000 G per 15 minuti a 4 gradi Celsius per far precipitare le proteine. Prendi il surnatante e usalo per la misurazione dei nitriti. Per la misurazione sensibile dei nitriti, una soluzione riducente del triioduro è considerata la più efficace.

Durante la preparazione, assicurarsi che tutti i cristalli si dissolvano. Conservare la soluzione in un flacone scuro e utilizzarla entro una settimana dalla preparazione. Una soluzione riducente di cloruro di vanadio offre la massima precisione per la misurazione dei nitrati.

Una soluzione 1 micromolare di nitrito viene utilizzata per la determinazione della curva standard per il nitrito e per il nitrato. Configurare l'analizzatore di ossido nitrico secondo le istruzioni del produttore. Per prima cosa, aprire il serbatoio dell'ossigeno, accendere lo strumento e collegarlo a una trappola per acido, che contiene un molare di idrossido di sodio.

Quindi, aprire il serbatoio dell'elio, quindi collegare la camera di reazione in vetro al serbatoio dell'elio. A questo punto, caricare la camera di reazione con una soluzione di triioduro per la misurazione dei nitriti. Aggiungere l'agente antischiuma.

Regolare la portata del gas per rallentare il gorgogliamento. E poi collegare la trappola per acido alla camera di reazione. Usando tentativi ed errori, regolare correttamente il flusso di elio, in modo che corrisponda all'aspirazione dello strumento.

Ora, avvia il software liquido basato sulla programmazione visiva. Innanzitutto, abilitare la comunicazione tra lo strumento e il software di acquisizione dal menu Dati, quindi dal menu principale sul pannello frontale avviare l'analisi. Attendere che il dispositivo di raffreddamento del fotomoltiplicatore si raffreddi al di sotto di meno 12 gradi Celsius e che il fotomoltiplicatore si stabilizzi.

Dopo circa 30 minuti, la linea di base si sarà stabilizzata entro 1 o 2 millivolt. La stabilità del valore è fondamentale, non il valore stesso. Dopo che l'analizzatore si è stabilizzato, utilizzare una siringa Hamilton ben lavata per iniettare le soluzioni.

Innanzitutto, iniettare almeno tre diversi volumi dello standard di nitrito 1 micromolare. Iniettare le soluzioni nella soluzione riducente attraverso il setto. Iniettare ogni standard o campione due volte.

Se si prevedono livelli elevati di nitriti e campioni, prendere in considerazione l'iniezione di un grande quarto volume di soluzione di nitrito standard per una migliore determinazione della pendenza della curva standard. Osservare sempre l'output e attendere che l'analizzatore si ristabilizzi alla linea di base prima di iniettare il campione successivo. Questa operazione richiede almeno un minuto.

Utilizzate volumi di campione con picchi inferiori a 700 millivolt per ottenere risultati accurati. Tra una corsa e l'altra, lavare accuratamente la siringa con acqua deionizzata. È molto importante lavare accuratamente la siringa.

Dopo aver effettuato tutte le misurazioni, premere l'opzione di arresto nel software. I dati verranno salvati automaticamente. Premendo interrompi si interrompe la misurazione senza salvare i dati.

Chiudere il rubinetto di arresto sulla parte superiore del recipiente di reazione e scollegare il tubo che collega la trappola dell'acido e il recipiente di reazione. Dopo l'esperimento, mettere l'analizzatore in standby. Premere analisi sul pannello principale e confermare che entri in modalità standby.

Quindi, chiudere l'ossigeno di alimentazione. Scollegare il tubo dal serbatoio dell'O2 per la trappola dell'acido. Quindi sciacquare la soluzione di triioduro usando l'elio.

Quindi, chiudere e scollegare il serbatoio dell'elio dal recipiente di reazione in vetro. Infine, pulire il recipiente con etanolo e acqua secondo necessità. Gli standard di test insieme ai campioni di plasma mostrano che immediatamente dopo la loro iniezione, la tensione del fotomoltiplicatore aumenta e ritorna alla linea di base una volta che tutto il nitrito è stato ridotto, il che può richiedere fino a un minuto.

Per quantificare il segnale è stata costruita una curva standard a partire dagli standard, utilizzando l'area sotto il picco di salto di tensione. Utilizzando la curva standard, la quantificazione dei campioni è risultata molto riproducibile tra le loro iniezioni duplicate. La chemiluminescenza è considerata il gold standard per determinare le concentrazioni di nitriti.

Una volta padroneggiato, il limite di sensibilità per il nitrito è di soli venti millimolari. La cosa più importante per lavorare con la chemiluminescenza è la precisione. A causa dell'elevata sensibilità del metodo, ogni singolo errore influirà sul risultato finale.

Quindi prenditi il tuo tempo e non avere fretta. Dopo che questa tecnica è stata sviluppata nei primi anni 2000, ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare le vie metaboliche dell'ossido nitrico e imparare che la carenza di ossido nitrico sta causando molte malattie, in particolare malattie cardiovascolari.