Name: Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-25T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 25 s
Description: Scopri come quantificare i livelli di nitriti e nitrati nei campioni biologici mediante chemiluminescenza. Questo metodo semplice e altamente sensibile consente di tracciare il metabolismo dell'ossido nitrico in diversi contesti di ricerca.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Gli autori vogliono riconoscere i contributi critici di Dr A. Dejam e MM Pelletier a sviluppare l&#39;uso di soluzione di nitrito di preservare per le misure di nitriti nel sangue.

Tutti i protocolli, tra cui l&#39;uso di animali sono stati approvati per l&#39;uso da NIDDK cura degli animali e del Comitato uso e sangue umano è stato ottenuto da banca del sangue NIH da donatori sani. Preparazione 1. Esempio <ol><li> Preparazione della soluzione di nitrito di conservazione <ol><li> Preparare una soluzione contenente 890 mM ferrocianuro di potassio (K 3 Fe (CN) 6) e 118 mM NEM (N-etilmaleimide) in acqua distillata. Sciogliere bene fino a quando è chiaro di colore giallo, senza cristalli presenti. Aggiungere NP-40 (ottil phenoxylpolyethoxylethanol) in un rapporto 1: 9 (v / v, NP-40 / soluzione). Mescolare delicatamente per evitare la formazione di schiuma e conservare a 4 ° C per circa una settimana). </li></ol></li><li> Raccolta e preparazione dei campioni di sangue <ol><li> Raccogliere il sangue utilizzando almeno un ago 20 G per evitare emolisi con eparina per prevenire la coagulazione (5 U / ml). Per il campione di sangue intero, mescolare il sangue con nitrito di conservazione immediatamente soluzione in un rapporto 1: 4 (v/ V / sangue). </li><li> Per i campioni di plasma e globuli rossi, centrifugare il sangue raccolto per 5 minuti a 4000 xga 4 ° C per separare i globuli rossi (RBC) e plasma. Prendere il surnatante (plasma) e mescolare con nitrito di preservare soluzione come sopra descritto per la determinazione dei livelli di nitriti nel plasma. </li><li> Rimuovere accuratamente plasma e buffy coat dal campione e pipetta RBC dal fondo del tubo rimanente per evitare la contaminazione da altri tipi di cellule del sangue utilizzando un puntale cut-off, e trasferirlo in una provetta contenente nitriti soluzione conservando nello stesso rapporto come sopra. </li><li> Mescolare ogni campione (plasma e RBC) con metanolo freddo ad un rapporto 1: 1 o 1: 2 (v / v campione / metanolo) e centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 minuti per precipitare le proteine. Prendere il surnatante e utilizzarlo per la misurazione nitriti o congelare campioni preparati, se necessario, il ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. Nota: Nitrito rea rapidamenteCTS con ossiemoglobina (oxyHb) nel sangue formare nitrati. Poiché oxyHb è sempre presente in grande eccesso rispetto nitrito, questa reazione porta alla distruzione quasi completa del nitrito di sangue nativo con un arco di tempo di ~ 10 min. Per preservare la maggior parte endogena nitrito di sangue, soluzione di nitrito-conservazione viene aggiunto ai campioni di sangue intero immediatamente dopo il prelievo di sangue. La soluzione rapidamente lisare i globuli rossi e ossidare oxyHb in metaemoglobina (metHb), una forma inattiva di emoglobina che non reagisce chimicamente con nitriti. </li></ol></li><li> Preparazione dei campioni da altri tipi di fluido corporeo <ol><li> Dopo la raccolta del campione in apposito contenitore, mescolare bene con nitrito di preservare soluzione, deproteinate e misurare immediatamente o congelare e conservare a -80 ° C. </li></ol></li><li> Raccolta e preparazione dei campioni di tessuto <ol><li> Raccogliere tessuti provenienti da animali perfusi con soluzione fisiologica eparinizzata (10 U HEPArin / ml). Excise circa 1 g di tessuto desiderata e omogeneizzare sia utilizzando un omogeneizzatore manuale o automatizzato omogeneizzatore. </li><li> Aggiungere quantità nota di nitrito preservare soluzione come necessario per conseguire omogenato liscia. </li><li> Una volta che il tessuto è omogeneizzato, precipitare le proteine ​​usando metanolo freddo (1: 1 o 1: 2 rapporto v / v campione / metanolo) come sopra descritto, campioni quindi centrifugare a 13.000 xga 4 ° C per 15 min. </li><li> Raccogliere i livelli di nitriti surnatante e misura. Se necessario, congelarli a qualsiasi fase di preparazione in ghiaccio secco e conservare a -80 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Preparazione di Riduzione Solutions <ol><li> Tri-ioduro (I 3) ridurre la soluzione per nitriti e R- (X) NESSUN specie determinazione 1,3,4 <ol><li> Preparare una soluzione di 301 mM KI insieme a 138 mm I 2 soluzione in acqua. Mescolare con acido acetico glaciale in rapporto 2: 7 (v / v / soluzione acida) su un agitatore magnetico per ~ 30 minuti fino a quando tutticristalli sono dissolti. Preferibilmente tenere in bottiglia scura, come ioduro è sensibile alla luce, ed utilizzare entro una settimana dalla preparazione. Nota: Questa soluzione consentirà di ridurre il nitrito in NO e sarà anche rilasciare NO da R-SNO, R-NNO e Fe-no gruppi funzionali (R- (X) -NO), ma il nitrato non sarà influenzata. Il segnale dai gruppi funzionali sopra NO-based può essere separato dal segnale vero nitriti mediante trattamento di metà del campione con sulfanilamide acidificato (AS) e confrontando AS-trattati e il segnale non trattato. Forme come irreversibilmente diazonio cazione con nitriti e questo complesso può essere ridotta I 3 soluzione. Per AS trattamento, preparare 290 soluzione mM di Sulfanilamide in 1 M HCl e aggiungerlo a una aliquota di campione in rapporto 1: 9 (v / v AS / campione). Misurare il segnale CL in parti AS-trattati e non trattati del campione. Calcolare il segnale vero nitriti come una differenza di parte AS-trattate e non trattate di campione. Il nitrito può essere misurato anche utilizzando un NIT selettivoRite-riducendo soluzione di miscela di acido ascorbico / acido acetico, come descritto nella parte 2.2. Tuttavia, a causa della piccola quantità di solito di R- (X) -NO specie presenti, misurazioni utilizzando campioni AS-trattati sono nella maggior parte dei casi una buona approssimazione del tenore totale di nitriti. </li></ol></li><li> Acido ascorbico / acido acetico soluzione (4A) per la determinazione selettiva di nitriti 2 <ol><li> Preparare 500 mm acido ascorbico in acqua. Mescolare questa soluzione con acido acetico glaciale in un rapporto 1: 7 (v / v, acido ascorbico / acido acetico) per preparare la miscela di reazione. Nota: Questa soluzione è specifica per il nitrito, non rilascerà NO da qualsiasi R- (X) NESSUN specie o nitrato. Tuttavia, la soluzione di ascorbico e acido acetico deve essere preparata estemporaneamente ogni giorno prima delle misurazioni, come acido ascorbico ossida facilmente in soluzione. Il completamento della riduzione nitriti dipende dalla concentrazione di acido ascorbico; e almeno 50 mM di acido ascorbico è raccomandato completa reduction di nitriti plasma. Tuttavia, si consiglia di eseguire alcuni esperimenti pilota con diverse concentrazioni di acido ascorbico e gli standard di nitriti nel range di concentrazione di nitriti previsto prima misurazioni campione finale. Tenere presente che l&#39;acido ascorbico esaurisce leggermente durante le misurazioni, sono raccomandati così frequenti cambi di miscela di reazione nella camera di reazione di vetro. </li></ol></li><li> Vanadio (III) riducendo soluzione di cloruro di determinazione nitrato 9 <ol><li> Preparare 51 mM soluzione di VCl 3 in 1 M HCl. soluzione filtro attraverso il filtro 200 micron e conservare in una bottiglia scura, utilizzare entro due settimane. Nota: Questa soluzione ridurrà nitrati, nitriti e tutti R- (X) -NO specie, quindi se quantità comparabili di nitriti o altro R- (X) -NO specie sono presenti insieme con nitrato, il contenuto finale nitrati deve essere calcolato come la differenza tra i segnali CL ottenuti con VCl 3 e3 riducendo soluzioni. </li></ol></li></ol> 3. chemiluminescenza (CL) Setup Analyzer e Misure <ol><li> Soluzione standard <ol><li> Preparare 1 mM soluzione di nitrito di sodio (nano 2). La stessa soluzione può essere utilizzata per nitriti e nitrati determinazioni. </li></ol></li><li> Utilizzando analizzatore Nota: Attualmente ci sono due disponibili in commercio NO analizzatori che sono abbastanza sensibili per finalità di ricerca biologica - Sievers NOA e Ecophysics CLD 88Y. Entrambi operano sullo stesso principio; la differenza principale è che CLD 88Y utilizza l&#39;ossigeno dall&#39;aria camera per rendere ozono (O 3), mentre NOA richiede un serbatoio di ossigeno esterna a questo scopo. La procedura che segue descrive il set up per il Sievers NOA. <ol><li> configurazione dello strumento <ol><li> Eseguire la configurazione iniziale del analizzatore secondo le raccomandazioni del fabbricantecome visto in Figura 1. </li><li> Aprire serbatoio O 2 collegato allo strumento. Scegliere &quot;analisi&quot; e &quot;inserire&quot; dal menu principale del pannello frontale. Nella schermata successiva scegliere &quot;start&quot; e premere &quot;invio&quot;. Collegare la trappola di acido (contenente 1 M NaOH) allo strumento come mostrato in Figura 1. </li><li> Attendere fotomoltiplicatore raffredda alla temperatura inferiore a -12 ° C e la camera di reazione viene evacuato a 6 Torr. Ci vogliono circa 30 minuti per raggiungere una linea di base piana e stabile. La linea di base deve stabilizzare entro 1 - 2 mV, il suo valore nominale è meno importante della sua stabilità. Nota: Se il nitrato è misurato, accendere il bagno di raffreddamento ad acqua (a 4 ° C, che serve trappola fredda per vapori acidi e acqua) e bagno di acqua di riscaldamento (camera di reazione principale, 95 ° C). Il tasso di riduzione dei nitrati in NO in VCl 3 soluzione dipende dalla temperatura, ed è molto lento a camera temperatura, è necessario in modo sostanziale aumento della temperatura per osservare la reazione. </li><li> Aprire il serbatoio Lui e collegare la camera di reazione di vetro per intrappolare acido come visto in Figura 1. Riempire la camera di reazione con soluzione riducente adeguata, ridurre il gorgogliare al minimo e connettersi camera di reazione alla trappola di acido. Utilizzando tentativi ed errori, regolare la velocità di ribollimento Egli per abbinare il tasso di aspirazione strumento (di solito ~ 200 ml / min per NOA di Siever). </li><li> Accendere il computer che controlla lo strumento e avviare il software Liquid Labview-based. Per attivare la comunicazione tra lo strumento e il software di acquisizione, premere &quot;Invio&quot; quando nel menu &quot;Dati&quot; fino a schermo si legge &quot;in uscita abilitato&quot;, quindi premere &quot;chiaro&quot; per tornare indietro alla schermata dei dati. </li><li> Attendere una traccia linea di base stabile sullo schermo e iniziare l&#39;iniezione di campioni e gli standard di nitrito in riducendo soluzione attraverso il setto. Attendere sempre per raggiungere una linea di base stabile a poppaer il picco. Questo può richiedere fino a 2 min. Il software Liquid ha un&#39;opzione per &quot;marcare&quot; i tempi di iniezione e annotare l&#39;iniezione e sarà esportare questi commenti in un file separato (filename.info) come un utile complemento per il file di dati (filename.data). </li><li> Una volta che i campioni e gli standard sono misurati, scegliere &quot;stop&quot; opzione nel menu del software Liquid - questo scriverà i dati da un file temporaneo in un file permanente conosciuto come &quot;filename.data&quot;. Premendo l&#39;opzione &quot;abortire&quot; terminerà la misurazione senza scrivere dati acquisiti in un file permanente. </li><li> Per terminare esperimento, scollegare la macchina dal recipiente di reazione spegnendo il rubinetto sulla parte superiore del recipiente di reazione e scollegare il tubo tra trap acidi e recipiente di reazione (vedere Figura 1). Ora smettere analizzatore NOA - premere &quot;chiaro&quot;, andare a &quot;analisi&quot;, mettere la macchina in &quot;stand-by&quot; e stand-by &quot;conferma&quot;. Se usato regolarmente, ilstrumento può essere lasciato in modalità stand-by per diverse settimane. Spegnere rifornimento di ossigeno. Poi lavare la soluzione riducendo dalla camera di reazione, scollegare e chiudere il serbatoio Egli dal recipiente di reazione di vetro e rifinire recipiente di reazione. </li></ol></li><li> Norme e iniezioni di esempio <ol><li> Iniettare 50 ml di soluzione di nitrito di 1 micron in miscela di reazione con una siringa Hamilton ben lavata. Attendere almeno 1 - 2 min tra le iniezioni per ottenere una buona separazione dei picchi. Ripetere l&#39;iniezione di 50 ml per ottenere i duplicati per ogni punto di dati. Lavare la siringa con acqua deionizzata dopo ogni iniezione. </li><li> Per acquisire una serie completa di dati per curva standard, continuare con iniezioni duplicate di 100, 150 ml (altri 200 ml potrebbero essere necessari se si prevedono elevate concentrazioni di nitriti e nitrati) di soluzione di nitrito di 1 micron. In ogni caso, aver cura di attendere che il segnale scende di nuovo alla linea di base e quindi acquisire 1 - 2 min di base per ottenere una buona separazione dei picchi. Nota: standard nitriti possono essere misurati in qualsiasi momento durante gli esperimenti. Tuttavia, è preferibile acquisire la curva standard prima della misurazione dei dati, in quanto serve anche come un controllo indipendente della funzionalità dello strumento. Quando i dati sono raccolti, quantità di campione iniettata dovrebbe portare a picchi ben pronunciate. Tuttavia va tenuto presente che il fotomoltiplicatore è lineare solo fino a ~ 800 mV, quindi nessuno del picco deve essere superiore a ~ 700 mV. Ciò può essere ottenuto sia diminuendo di campione quantità iniettata o diluendo il campione con acqua deionizzata. Ogni punto dovrebbe essere misurata almeno in doppio. </li></ol></li></ol></li></ol>

<ol><li>Piknova, B., Schechter, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+Nitrite+in+Blood+Samples+Using+the+Ferricyanide-Based+Hemoglobin+Oxidation+Assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Measurement of Nitrite in Blood Samples Using the Ferricyanide-Based Hemoglobin Oxidation Assay.</a> Methods Mol Biol. 704, 39-56 (2011).</li>
<li>Nagababu, E., Rifkind, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+plasma+nitrite+by+chemiluminescence+without+interference+of+S-%2C+N-nitroso+and+nitrated+species%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Measurement of plasma nitrite by chemiluminescence without interference of S-, N-nitroso and nitrated species.</a> Free Radic Biol Med. 42, 1146-1154 (2007).</li>
<li>Pinder, A. G., Rogers, S. C., Khalatbari, A., Ingram, T. E., James, P. E. The measurement of nitric oxide and its metabolites in biological samples by ozone-based chemiluminescence. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPinder%2C+AG+%22Methods+in+Molecular+Biology%2C+Redox-Mediated+Signal+Transduction%22">Methods in Molecular Biology, Redox-Mediated Signal Transduction</a>. Hancock, J. T. 476, Humana press. Totowa, NJ. 11-28 (2008).</li>
<li>Pelletier, M. M., Kleinbongard, P., Ring-wood, L., Hito, R., Hunter, C. J., Schechter, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+measurement+of+blood+and+plasma+nitrite+by+chemiluminescence%3A+pitfalls+and+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">The measurement of blood and plasma nitrite by chemiluminescence: pitfalls and solutions.</a> Free Radic Biol Med. 41, 541-548 (2006).</li>
<li>Mac Arthur, P. H., Shiva, S., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Measurement+of+circulating+nitrite+and+S-nitrosothiols+by+reductive+chemiluminescence%5BTitle%5D)+AND+%22J+Chromatogr+B%22%5BJournal%5D)">Measurement of circulating nitrite and S-nitrosothiols by reductive chemiluminescence.</a> J Chromatogr B. 851, 93-105 (2007).</li>
<li>Bryan, N. S., Grisham, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methods+to+detect+nitric+oxide+and+its+metabolites+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Biol+Med%22%5BJournal%5D)">Methods to detect nitric oxide and its metabolites in biological samples.</a> Free Radic Biol Med. 43, 645-657 (2007).</li>
<li>Hendgen-Cotta, U., Grau, M., Rasaaf, T., Gharinin, P., Kelm, M., Kleinbongard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reductive+gas-phase+chemiluminescence+and+flow+injection+analysis+for+measurement+of+nitric+oxide+pool+in+biological+matrices%5BTitle%5D)+AND+%22Method+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Reductive gas-phase chemiluminescence and flow injection analysis for measurement of nitric oxide pool in biological matrices.</a> Method Enzymol. 441, 295-315 (2008).</li>
<li>Yang, B. K., Vivas, E. X., Reiter, C. D., Gladwin, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Methodologies+for+the+sensitive+and+specific+measurement+of+S-nitrosothiols%2C+iron-nitrosyls+and+Nitrite+in+biological+samples%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radic+Res%22%5BJournal%5D)">Methodologies for the sensitive and specific measurement of S-nitrosothiols, iron-nitrosyls and Nitrite in biological samples.</a> Free Radic Res. 37, 1-10 (2003).</li>
<li>Smárason, A. K. 1, Allman, K. G., Young, D., Redman, C. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elevated+levels+of+serum+nitrate%2C+a+stable+end+product+of+nitric+oxide%2C+in+women+with+pre-eclampsia%5BTitle%5D)+AND+%22Br+J+Obstet+Gynaecol%22%5BJournal%5D)">Elevated levels of serum nitrate, a stable end product of nitric oxide, in women with pre-eclampsia.</a> Br J Obstet Gynaecol. 104 (5), 538-543 (1997).</li>
<li>Beckman, J. S., Congert, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+Measurement+of+Dilute+Nitric+Oxide+in+Solution+with+an+Ozone+Chemiluminescent+Detector%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%3A+A+companion+to+Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Direct Measurement of Dilute Nitric Oxide in Solution with an Ozone Chemiluminescent Detector.</a> Methods: A companion to Methods in Enzymology. 7, 35-39 (1995).</li>
<li>Bates, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide+measurements+by+chemiluminescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroprotocols%3A+A+companion+to+Methods+in+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide measurements by chemiluminescence detection.</a> Neuroprotocols: A companion to Methods in Neuroscience. 1, 141-149 (1992).</li>
</ol>

Dr. Alan Schechter è elencato come co-inventore diversi brevetti rilasciati il ​​National Institutes of Health per l&#39;uso di sali nitriti per il trattamento delle malattie cardiovascolari. Egli riceve royalties basate su NIH concessione di licenze di questi brevetti per lo sviluppo clinico, ma nessun altro compenso.

I passaggi critici all&#39;interno del protocollo Aliquote di tutte le soluzioni (tra cui l&#39;acqua) usate per preparare, diluire o altrimenti trattare campioni originali devono essere salvati e controllati per possibili nitriti o (più spesso) contaminazione da nitrati. Abbiamo trovato che la maggior contaminazione proviene da acqua e molti prodotti chimici usati per il trattamento di campioni (ferricianuro in particolare) contengono anche significativa quantità di contaminazione da nitrati i...

Nitrito, e ad un nitrato meno estendere, i livelli nel sangue riflettono stato generale del corpo NO metabolismo. concentrazione dei nitriti nel sangue e la maggior parte degli organi e tessuti sono solo in alta nanomolari o gamma micromolare basso, il nitrato di solito è presente in quantità molto più elevate - nella gamma micromolare. I cambiamenti nei livelli di nitriti a causa di progressione della malattia o cambiamenti nelle abitudini alimentari sono piuttosto piccole e possono essere misurati solo con un metodo molto sensibile. A causa delle loro molto diversi livelli e diversi processi metabolici, la determinazione separata dei livelli di nitriti e nitrati è essenziale. La cosiddetta &quot;NO determinazione x&quot; dove nitriti e nitrati siano misurate insieme ha ben poco valore. Diversi metodi per quantificare nitriti in vari campioni biologici sono stati sviluppati - il più comune è il più antico, basato sulla reazione di Griess che era stato originariamente descritto in 1879. Anche con modificatio modernans, il limite di sensibilità per i nitriti ottenibile con il metodo di Griess &#39;è nella gamma micromolare bassa. Chemiluminescenza (CL), in combinazione con tri-ioduro riducendo soluzione, è attualmente considerato il metodo più sensibile, che consente la quantificazione in gamma bassa nanomolari della concentrazione di nitriti 1-8,10,11. Lo stesso metodo CL, combinato con vanadio (III) cloruro di riduzione soluzione, può essere utilizzato per misurazioni sensibili di nitrato, con precisione nell&#39;intervallo nanomolare 9. CL rileva libera gas NO. Pertanto, nitriti, nitrati, R-nitrosothiols (R-SNO), R-nitrosamine (R-NNO), o composti metallo-NO (più tardi nel manoscritto di cui come &quot;R- (X) -NO&quot;), deve essere convertito in liberare gas NO al fine di quantificare il loro valore originale via CL. La conversione in NO viene effettuata mediante diverse soluzioni riducenti diversi, a seconda della natura del NO metabolita. Dopo la conversione, libera gas NO viene estratta dal recipiente di reazione da un gas carrier (He, N2 o Ar) nella camera di reazione di CL analizzatore cui l&#39;ozono (O 3) è combinato con NO per formare biossido di azoto (NO 2) nel suo stato attivato. Con il ritorno allo stato fondamentale, NO 2 * emette nella regione infrarossa e fotone emesso viene rilevato da fotomoltiplicatore (PMT) dello strumento CL. L&#39;intensità della luce emessa è direttamente proporzionale alla concentrazione di NO in camera di reazione, che permette di calcolare la concentrazione della specie originali usando curve di taratura adeguate. Nel nostro protocollo, in primo luogo abbiamo presente determinazione CL a base di nitriti e nitrati nelle situazioni cliniche più utilizzate - nel sangue e di plasma, e poi discutiamo come determinare questi ioni in campioni di tessuto. Spiegheremo anche nel dettaglio come preservare la concentrazione di nitrito fisiologica originale in ambienti nitriti reattivo, come il sangue e suoi scomparti, plasma e globuli rossi.

<table><tbody><tr><td>ferricianuro di potassio; K3Fe(CN)6</td><td>Sigma</td><td>702587</td><td></td></tr><tr><td>NEM; N-etilmaleimmide</td><td>Sigma</td><td>4260</td><td></td></tr><tr><td>NP-40; 4-Nonilfenil-polietilenglicole</td><td>Sigma</td><td>74385</td><td></td></tr><tr><td>sulfanilamide; AS&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>S9251</td><td></td></tr><tr><td>HCl</td><td>Sigma</td><td>H1758</td><td></td></tr><tr><td>acido acetico, glaciale</td><td>Sigma</td><td>A9967</td><td></td></tr><tr><td>acido ascorbico&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>A7506</td><td></td></tr><tr><td>ioduro di potassio; KI</td><td>Sigma</td><td>60399</td><td></td></tr><tr><td>iodio; I2</td><td>Sigma</td><td>207772</td> nitrito di sodio <td>tossico e sensibile alla luce</td></tr><tr><td>; NaNO2</td><td>Sigma</td><td>563218</td><td></td></tr><tr><td>cloruro di vanadio(III); VCl3</td><td>Sigma</td><td>208272</td><td>sensibile alla luce, tossico</td></tr><tr><td>GentleMac</td><td>Miltenyi</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sievers NOA 280i</td><td>GE</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CLD 88Y</td><td>&nbsp; Ecofisica&nbsp;</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

Measuring Nitrite and Nitrate, Metabolites in the Nitric Oxide Pathway, in Biological Materials using the Chemiluminescence Method

L&#39;ossido nitrico (NO) è una delle principali molecole regolatore dell&#39;omeostasi vascolare e anche un neurotrasmettitore. Enzimatica prodotta NO viene ossidato in nitriti e nitrati dalle interazioni con diverse proteine ​​ossi-eme e altri percorsi ancora poco conosciuti. Il processo inverso, la riduzione dei nitriti e nitrati in NO era stato scoperto nei mammiferi negli ultimi dieci anni ed è guadagnando attenzione come uno dei possibili percorsi per sia prevenire o alleviare una vasta gamma di malattie cardiovascolari, malattie metaboliche e muscolari che si pensa essere associato con diminuzione dei livelli di NO. È quindi importante valutare la quantità di NO e suoi metaboliti in differenti compartimenti corporei - sangue, fluidi corporei e vari tessuti. Sangue, grazie alla sua facile accessibilità, è il vano preferito utilizzato per la stima dei metaboliti. A causa della sua breve vita (pochi millisecondi) e bassa concentrazione di sub-nanomolari, misurazioni affidabili dirette di sangue NO &lt;em&gt; in vivo presentano grandi difficoltà tecniche. Così NO disponibilità è solitamente stimato in base alla quantità dei suoi prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Questi due metaboliti vengono sempre misurati separatamente. Ci sono diversi metodi ben stabiliti per determinare le loro concentrazioni nei fluidi e nei tessuti biologici. Qui vi presentiamo un protocollo per il metodo chemiluminescenza (CL), in base alla rilevazione spettrofotometrica di NO dopo nitriti o nitrati riduzione di (III) soluzioni di cloruro rispettivamente tri-ioduro o vanadio,. La sensibilità per nitriti e nitrati rilevamento è in gamma bassa nanomolari, che stabilisce CL come il metodo più sensibile attualmente disponibile per determinare le variazioni di NO vie metaboliche. Vi spieghiamo in dettaglio come preparare campioni di fluidi e tessuti biologici al fine di preservare quantità originali di nitriti e nitrati presenti al momento della raccolta e su come determinare le loro rispettive quantità nei campioni. Limitazioni della tecnica CL sono anche explained.

La figura 2 mostra i risultati rappresentativi raccolti da standard e cinque campioni diversi. Come mostrato in questa figura, tensione aumenta fotomoltiplicatore immediatamente dopo nitrito contenenti soluzione (standard o campioni) viene iniettato riducendo soluzione (iniezioni volte sono indicati da frecce rosse sotto la curva) e ritorna al valore basale volta tutte nitriti presenti nella iniettato soluzione è stata ridotta. È anche chiaro da questa figura che sono ne...

L'ossido nitrico (NO) è un'importante molecola di segnalazione nell'omeostasi vascolare. La produzione di NO in vivo è troppo bassa per la misurazione diretta. La chemiluminescenza fornisce informazioni utili sul ciclo dell'NO attraverso la misurazione dei suoi precursori e prodotti di ossidazione, nitriti e nitrati. Viene spiegata la determinazione di nitriti/nitrati nei tessuti e nei fluidi corporei.

Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

Nitric oxide (NO) is one of the main regulator molecules in vascular homeostasis and also a neurotransmitter. Enzymatically produced NO is oxidized into ...

L'obiettivo di questo protocollo è quello di utilizzare la chemiluminescenza per quantificare l'ossido nitrico nei campioni biologici quantificando i livelli di nitrito e nitrato, utilizzando soluzioni riducenti di triioduro e cloruro di vanadio. Questo protocollo fornisce un potente strumento per monitorare il metabolismo e la segnalazione dell'ossido nitrico, sia a livello regionale che longitudinale, da una varietà di campioni biologici. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua semplicità e l'elevata sensibilità.A dimostrare questa procedura sarà Katelyn Cassel, la nostra borsista IRTA. Ci mostrerà come misurare il nitrito mediante chemiluminescenza accoppiata con una soluzione di triioduro. Per iniziare, prepara una soluzione conservante per nitriti.Preparare una soluzione contenente un NEM da 118 millimolari e 890 millimolari di ferrocianuro di potassio in acqua distillata. Sciogliere i solidi fino a quando la soluzione non diventa di colore giallo limpido senza cristalli. Quindi aggiungere questa soluzione a NP 40 in un rapporto volume / volume di 9 a 1.Mescolare delicatamente la soluzione per evitare la formazione di schiuma. Non vorticare mai questa miscela. La soluzione conservante di nitriti può essere utilizzata per circa una settimana se conservata a 4 gradi Celsius.Il protocollo può essere utilizzato su molti campioni biologici appena ottenuti. In questo caso, il sangue appena prelevato è stato centrifugato per ottenere un campione di plasma per il test. È molto importante elaborare il sangue o qualsiasi campione biologico contenente una grande quantità di proteine eme, come l'emoglobina o la mioglobina il più rapidamente possibile, perché le proteine eme reagiranno con il nitrito e distruggeranno il nitrito.Ora, al fine di preservare la maggior parte del nitrito endogeno del sangue, mescolare immediatamente il plasma con una soluzione conservante di nitriti in un rapporto da 1 a 4 volume per volume. Durante qualsiasi fase di questa preparazione, il campione può essere congelato su ghiaccio secco. Per deproteinare il campione, mescolarlo con una parte uguale di metanolo freddo.Quindi, centrifugare il campione a 13000 G per 15 minuti a 4 gradi Celsius per far precipitare le proteine. Prendi il surnatante e usalo per la misurazione dei nitriti. Per la misurazione sensibile dei nitriti, una soluzione riducente del triioduro è considerata la più efficace.Durante la preparazione, assicurarsi che tutti i cristalli si dissolvano. Conservare la soluzione in un flacone scuro e utilizzarla entro una settimana dalla preparazione. Una soluzione riducente di cloruro di vanadio offre la massima precisione per la misurazione dei nitrati.Una soluzione 1 micromolare di nitrito viene utilizzata per la determinazione della curva standard per il nitrito e per il nitrato. Configurare l'analizzatore di ossido nitrico secondo le istruzioni del produttore. Per prima cosa, aprire il serbatoio dell'ossigeno, accendere lo strumento e collegarlo a una trappola per acido, che contiene un molare di idrossido di sodio.Quindi, aprire il serbatoio dell'elio, quindi collegare la camera di reazione in vetro al serbatoio dell'elio. A questo punto, caricare la camera di reazione con una soluzione di triioduro per la misurazione dei nitriti. Aggiungere l'agente antischiuma.Regolare la portata del gas per rallentare il gorgogliamento. E poi collegare la trappola per acido alla camera di reazione. Usando tentativi ed errori, regolare correttamente il flusso di elio, in modo che corrisponda all'aspirazione dello strumento.Ora, avvia il software liquido basato sulla programmazione visiva. Innanzitutto, abilitare la comunicazione tra lo strumento e il software di acquisizione dal menu Dati, quindi dal menu principale sul pannello frontale avviare l'analisi. Attendere che il dispositivo di raffreddamento del fotomoltiplicatore si raffreddi al di sotto di meno 12 gradi Celsius e che il fotomoltiplicatore si stabilizzi.Dopo circa 30 minuti, la linea di base si sarà stabilizzata entro 1 o 2 millivolt. La stabilità del valore è fondamentale, non il valore stesso. Dopo che l'analizzatore si è stabilizzato, utilizzare una siringa Hamilton ben lavata per iniettare le soluzioni.Innanzitutto, iniettare almeno tre diversi volumi dello standard di nitrito 1 micromolare. Iniettare le soluzioni nella soluzione riducente attraverso il setto. Iniettare ogni standard o campione due volte.Se si prevedono livelli elevati di nitriti e campioni, prendere in considerazione l'iniezione di un grande quarto volume di soluzione di nitrito standard per una migliore determinazione della pendenza della curva standard. Osservare sempre l'output e attendere che l'analizzatore si ristabilizzi alla linea di base prima di iniettare il campione successivo. Questa operazione richiede almeno un minuto.Utilizzate volumi di campione con picchi inferiori a 700 millivolt per ottenere risultati accurati. Tra una corsa e l'altra, lavare accuratamente la siringa con acqua deionizzata. È molto importante lavare accuratamente la siringa.Dopo aver effettuato tutte le misurazioni, premere l'opzione di arresto nel software. I dati verranno salvati automaticamente. Premendo interrompi si interrompe la misurazione senza salvare i dati.Chiudere il rubinetto di arresto sulla parte superiore del recipiente di reazione e scollegare il tubo che collega la trappola dell'acido e il recipiente di reazione. Dopo l'esperimento, mettere l'analizzatore in standby. Premere analisi sul pannello principale e confermare che entri in modalità standby.Quindi, chiudere l'ossigeno di alimentazione. Scollegare il tubo dal serbatoio dell'O2 per la trappola dell'acido. Quindi sciacquare la soluzione di triioduro usando l'elio.Quindi, chiudere e scollegare il serbatoio dell'elio dal recipiente di reazione in vetro. Infine, pulire il recipiente con etanolo e acqua secondo necessità. Gli standard di test insieme ai campioni di plasma mostrano che immediatamente dopo la loro iniezione, la tensione del fotomoltiplicatore aumenta e ritorna alla linea di base una volta che tutto il nitrito è stato ridotto, il che può richiedere fino a un minuto.Per quantificare il segnale è stata costruita una curva standard a partire dagli standard, utilizzando l'area sotto il picco di salto di tensione. Utilizzando la curva standard, la quantificazione dei campioni è risultata molto riproducibile tra le loro iniezioni duplicate. La chemiluminescenza è considerata il gold standard per determinare le concentrazioni di nitriti.Una volta padroneggiato, il limite di sensibilità per il nitrito è di soli venti millimolari. La cosa più importante per lavorare con la chemiluminescenza è la precisione. A causa dell'elevata sensibilità del metodo, ogni singolo errore influirà sul risultato finale.Quindi prenditi il tuo tempo e non avere fretta. Dopo che questa tecnica è stata sviluppata nei primi anni 2000, ha aperto la strada ai ricercatori per esplorare le vie metaboliche dell'ossido nitrico e imparare che la carenza di ossido nitrico sta causando molte malattie, in particolare malattie cardiovascolari.

measuring-nitrite-nitrate-metabolites-nitric-oxide-pathway-biological

Research

Ricerca

JoVE Journal

Biology

Biologia

La produzione endogena di ossido nitrico (NO) regola una varietà di funzioni biologiche. Sta diventando sempre più chiaro che l'alterazione o disregolazione di NO segnalazione based è coinvolta in molte malattie umane. Metodi per quantificare relativo numero metaboliti possono fornire nuovi biomarcatori diagnostici o prognostici per le malattie umane.

Tecniche analitiche per il saggio Bioattività Ossido Nitrico

I livelli della molecola infiammatoria di segnalazione cellulare ossido nitrico (NO) sono comunemente dosati utilizzando il reagente Griess. In questo protocollo, abbiamo creato un test di Griess modificato utilizzando tessuto cerebrale vivo di Drosophila al fine di rilevare la secrezione di NO in un metodo semplice, quantificabile e altamente ripetibile.

Nuovo test quantitativo dell'intero tessuto dei livelli di ossido nitrico nella risposta neuroinfiammatoria della Drosophila

In questo articolo descriviamo un metodo relativamente semplice adattato utilizzando il colorante fluorescente diaminofluorescein-2 diacetato (DAF-2DA) e dihydroethidium (DHE) per en face rilevazione simultanea e la visualizzazione di ossido nitrico intracellulare (NO) e di anione superossido (O 2 .- ), rispettivamente, in appena isolato aortas intatte di un modello di obesità del mouse.

En Face Detection di ossido nitrico e superossido in strato endoteliale delle arterie Intact

Lavori precedenti suggeriscono che la composizione isotopica dell'azoto degli ossidi di azoto atmosferici potrebbe distinguere l'influenza di diverse fonti nell'ambiente. Riportiamo un metodo automatizzato, mobile e basato sul campo per l'elevata efficienza di raccolta dell'NOx atmosferico per l'analisi isotopica dell'N con una risoluzione oraria.

Automatizzato, ad alta risoluzione mobile sistema di raccolta per l&#39;analisi isotopica di azoto di NO<sub&gt; x</sub

Questo articolo descrive l'ossido nitrico (NO) protocolli di fumigazione per controllo dei parassiti post-raccolta. Camere di fumigazione vengono scaricate con azoto (N2) stabilire condizioni di bassissima di ossigeno prima di NO viene iniettato. Alla fine, alloggiamenti vengono scaricate con N2 per diluire NO prima di esporre i prodotti all'aria ambiente per evitare l'esposizione a n.2.

Procedure di fumigazione di laboratorio per il controllo dei parassiti con Gas di ossido di azoto

Α-idrossilazione di nitrosamine cancerogene dal citocromo P450s è accettata via metabolica che produce intermedi danneggiano il DNA, che causano mutazioni. Tuttavia, nuovi dati indicano ulteriore ossidazione a nitrosamides può verificarsi. Descriviamo un generale metodo per la rilevazione nitrosamides prodotta da in vitro metabolismo del citocromo P450-catalizzata di nitrosammine.

Un metodo generale per la rilevazione Nitrosamide formazione nel metabolismo In Vitro di nitrosammine di citocromo P450s

Viene fornita in dettaglio una serie di metodi per determinare il tasso potenziale di DNRA basato+ su 14NH4/15NH4. L'NH 4viene convertito in N2O attraverso diversi passaggi e analizzato utilizzando la cromatografia a gas quadrupole- spettrometria di massa.

Misurazione dei tassi potenziali di riduzione del nitrato dissimiliva all'ammonio sulla base di 14NH4/15NH4- Analisi tramite conversione sequenziale in N2O

Presentiamo protocolli per tre diversi metodi per l'omogeneizzazione di quattro diversi gruppi muscolari di tessuto muscolare scheletrico di ratto per misurare e confrontare i livelli di nitrati e nitriti. Inoltre, confrontiamo diversi pesi del campione per indagare se la dimensione del campione di tessuto influisce sui risultati dell'omogeneizzazione.

Preparazione di omogenati muscolari scheletrici di ratto per misurazioni di nitrati e nitriti

Qui presentiamo protocolli per rilevare l'ossido nitrico e i suoi derivati biologicamente rilevanti utilizzando saggi basati sulla chemiluminescenza ad alta sensibilità.

Saggi basati sulla chemiluminescenza per la rilevazione di ossido nitrico e suoi derivati da autoxidazione e composti nitrosi

Questo protocollo descrive un metodo per quantificare la produzione di ossido nitrico (NO) nelle colture epiteliali delle vie aeree differenziate all'interfaccia aria-liquido (ALI) misurando il nitrito nelle secrezioni apicali tramite un saggio di chemiluminescenza a base di triioduro.

Misurazione della produzione di ossido nitrico nelle colture cellulari epiteliali tracheali del topo differenziate all'interfaccia aria-liquido

Scopri come quantificare i livelli di nitriti e nitrati nei campioni biologici mediante chemiluminescenza. Questo metodo semplice e altamente sensibile consente di tracciare il metabolismo dell'ossido nitrico in diversi contesti di ricerca.

Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza (Video) | JoVE Journal

Misurazione nitriti e nitrati, metaboliti in ossido nitrico Pathway, nei materiali biologici utilizzando il metodo chemiluminescenza

Esplora altri video