Immunocolorazione delle sezioni biocitina-riempite e trasformati per neurochimici Marcatori

L'obiettivo di questo protocollo è quello di presentare un metodo efficiente per identificare i neuroni patchati durante le registrazioni elettrofisiologiche utilizzando biocitina e immunocolorazione per il recupero della morfologia prima della ricolorazione con anticorpi specifici per determinare l'identità neurochimica. Quindi questo metodo descrive un passo importante necessario per studiare la diversità nella struttura e nella funzione neuronale. Questo è essenziale per comprendere il loro ruolo nelle reti cerebrali.

Il vantaggio principale dell'utilizzo di una tecnica di elaborazione sequenziale, è che elimina la perdita di dati a causa dell'incapacità di recuperare la morfologia. Quindi questo aiuta anche a guidare i marcatori neurochimici da testare in queste cellule. Sebbene questo metodo sia descritto per il recupero morfologico di cellule in sezioni spesse, può essere applicato anche a sezioni sottili e su campioni precedentemente colorati e montati.

Generalmente i neutri nuovi a questo metodo possono avere difficoltà a risigillare il soma mentre si staccano dalla cella e possono non riuscire a concedere un tempo adeguato per i riempimenti di successo. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in quanto sono necessarie tecniche specifiche per un efficace riempimento di biocitina delle cellule al fine di recuperare la morfologia completa. Per iniziare questa procedura, nella configurazione a pinza di tensione, applicare piccoli e brevi passi di tensione utilizzando la funzione di test della membrana in modalità bagno mentre ci si avvicina alla cella.

Applicare il cerotto sulla cella applicando l'aspirazione. Quindi, tenere la cella a meno 70 millivolt. Si noti lo sviluppo di una guarnizione gigaohm.

Compensare i transitori capacitivi e quindi applicare l'aspirazione controllata con una siringa o per bocca per ottenere la configurazione dell'intera cella. Stimare la capacità dell'intera cella e la resistenza in serie e arrestare gli impulsi di prova della membrana. La resistenza in serie inferiore a 10 megaohm è ottimale.

Ciò garantirà la creazione di condizioni di registrazione di intere cellule per consentire il riempimento di biocitina. Al termine delle registrazioni fisiologiche, ristabilire la configurazione del patch clamp muovendo lentamente la pipetta di registrazione a piccoli passi, alternando verso l'alto e verso l'esterno in modalità voltage clamp. Il passo più critico per realizzare il recupero morfologico delle cellule è garantire la ri-sigillatura del soma neuronale mentre si stacca la pipetta di registrazione dalla cellula.

Utilizzando la funzione di test della membrana, è possibile visualizzare la perdita di transitori capacitivi e il collasso delle risposte di corrente a una linea retta, che indica la risigillatura della cella e la creazione di un cerotto esterno sulla punta della pipetta. Nel frattempo, mantenere la cella a un potenziale depolarizzato faciliterà il processo di richiusura. Dopo aver staccato la pipetta dalla cellula, conservare la fetta nella camera di registrazione per tre-cinque minuti per garantire il trasporto del colorante ai processi dendritici e assonali distali.

Quindi, trasferire la fetta in una piastra a 24 pozzetti contenente il 4% di PFA per il fissaggio. Da 24 a 48 ore dopo la fissazione del PFA, trasferire tutte le fette fissate in PBS monomolare a punto zero per la conservazione prima dell'immunocolorazione. In questa procedura, lavare i tessuti tre volte per 10 minuti ciascuno in PBS monomolare a punto zero.

Successivamente, bloccare i tessuti con il 10% di siero bloccante per un'ora a temperatura ambiente. Successivamente, incubare le sezioni negli anticorpi primari CB1R a temperatura ambiente durante la notte per identificare l'espressione del recettore dei cannabinoidi di tipo 1. Quindi, lavare le sezioni cerebrali tre volte per 10 minuti ciascuna in PBS 0,1 molari.

La streptavidina e l'anticorpo secondario contro il primo anticorpo primario vengono entrambi aggiunti alla piastra a pozzetti e mantenuti per una notte a quattro gradi Celsius. Successivamente, incubare le sezioni nel colorante rosso streptavidina coniugato a quattro gradi Celsius durante la notte al buio per rivelare la biocitina. Successivamente, lavare le sezioni cerebrali tre volte per 10 minuti ciascuna in PBS 0,1 molari.

Per proteggere la fioritura e facilitare la ricolorazione in futuro, montare le sezioni con un mezzo di montaggio equidistante. Sigillare i bordi dei vetrini coprioggetto con smalto trasparente. In questo passaggio, rimuovere lo smalto dal vetrino con un batuffolo di cotone di acetone.

Rimuovere con cura il vetrino coprioggetti utilizzando una pinza a punta fine e mettere alcune goccioline di PBS molare da 0,1 sulle sezioni. È fondamentale non danneggiare il tessuto di processo durante lo smontaggio del tessuto dal mezzo di montaggio acquoso. Rimuovere con cura le sezioni dal vetrino utilizzando un pennello fine e lavarle in PBS 0,1 molare per 24-48 ore su uno shaker, e tenerle al riparo dalla luce a quattro gradi Celsius.

Per garantire la rimozione completa del mezzo di montaggio, lavare le sezioni una o due volte il giorno successivo in PBS 0,1 molare per 10 minuti ogni volta. Quindi, incubare le sezioni con un secondo anticorpo primario colecistochinina per un giorno. Lavare le sezioni cerebrali tre volte per 10 minuti ciascuna in PBS 0,1 molari.

Successivamente, colorare le sezioni con un anticorpo secondario coniugato con fluoroforo capra anti-topo. Assicurarsi che gli spettri di emissione dell'eccitazione dell'anticorpo secondario non si sovrappongano alla streptavidina e alle precedenti colorazioni di immunofluorescenza. Successivamente, montare le sezioni in un mezzo di montaggio acquoso.

Sigillare i bordi del vetrino coprioggetto con smalto trasparente. Dopo il successo del riempimento con biocitina e il primo processo di immunocolorazione, la struttura neuronale può essere visualizzata e ripresa come mostrato nell'immagine confocale ottenuta con un ingrandimento di 60x. La sezione è stata anche immunocolorata per CB1R insieme alla biocitina, e l'immunocolorazione CB1R nel soma neuronale che esprime biocitina è indicata dalla punta della freccia.

La stessa sezione è stata elaborata per l'immuno-reattività CCK dopo una settimana e l'immagine mostra il recupero riuscito della marcatura immunologica CCK in diversi neuroni indicati dall'asterisco. Si noti che la cellula marcata con biocitina indicata dalla punta della freccia non esprimeva CCK. Un'immagine unita dei pannelli A, B e C mostra che tutte e tre le etichette sono visualizzate in modo robusto e la sovrapposizione tra biocitina e CB1R è evidente.

L'immagine mostra che il secondo processo di immunocolorazione non compromette il segnale del precedente processo di colorazione. La morfologia della cellula riempita di biocitina è stata ottenuta dalle immagini confocali prima di questa immunocolorazione CCK. Fondamentalmente, oltre al soma e al dendrite, è possibile visualizzare gli assoni e osservare la co-marcatura dei processi assonali marcati con CB1R e biocitina.

Durante il tentativo di questa procedura, è importante mirare alle cellule sane situate sotto la superficie della fetta per evitare neuroni con processi recisi. E questo potrebbe compromettere il recupero della morfologia. Una volta padroneggiato, il recupero morfologico delle cellule riempite di biocitina può essere ottenuto in modo affidabile durante la registrazione del patch clamp.

L'implementazione di successo della tecnica di immunocolorazione seriale migliorerà l'efficienza del recupero dei dati e faciliterà la caratterizzazione neuronale durante le registrazioni standard di patch clamp. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come utilizzare efficacemente le cellule riempite di biocitina per recuperare la morfologia neuronale e determinare i marcatori neurochimici.