L'analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8 ⁺ T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione

L'obiettivo generale di questo test è quello di enumerare e caratterizzare le popolazioni di cellule T CD8 positive specifiche per il virus dell'immunodeficienza delle scimmie generate dalla vaccinazione o dall'infezione primaria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia delle cellule T, come ad esempio qual è la frequenza delle cellule T CD8 antigene-specifiche indotte dalla vaccinazione o dall'infezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può quantificare le cellule T CD8 antigene-specifiche in campioni biologici ottenuti direttamente ex vivo senza la necessità di restimolazione in vitro.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla valutazione delle cellule T CD8 specifiche per l'incisione nel macaco rhesus e allo studio delle risposte delle cellule T CDB in diversi contesti di malattia. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa delle conoscenze incomplete disponibili per la genetica MHC del macaco rhesus e perché la colorazione citofluorimetrica richiede un'applicazione precisa degli anticorpi. Inizia ri-sospendendo il PBMC rhesus in R10 medium.

Aggiungere una concentrazione di 1,6 volte 10 alla settima cellula per millilitro. Aliquotare 50 microlitri di cellule al numero appropriato di provette per citometria a flusso e aggiungere 50 microlitri di inibitore della proteina chinasi a ciascuna provetta. Agitare ogni provetta e incubare i campioni a 37 gradi Celsius per 30 minuti.

La quantità corretta di peptide titolato MHC tetramero deve essere diluita in una miscela master sufficiente a colorare tutte le provette sperimentali. Pertanto, è importante preparare un eccesso del 15% del master mix, per tenere conto degli errori di pippetting. Mentre le cellule sono in incubazione, pellettare gli aggregati proteici nella soluzione di tetramero mediante centrifugazione, per ridurre al minimo la colorazione di fondo.

Successivamente, diluire i tetrameri in una quantità sufficiente di tampone colorante, in modo da poter aggiungere 25 microlitri della miscela master di tetrameri a ciascuna provetta per citometria a flusso. Quindi agitare le provette del campione e incubare le soluzioni di tetramero PBMC al buio, a temperatura ambiente per 45 minuti. Al termine dell'incubazione, aggiungere 50 microlitri di miscela master di colorazione nelle provette del campione appropriate.

E mescola i tubi per il vortex. Dopo 25 minuti al buio a temperatura ambiente, lavare le celle con il tampone di lavaggio, pellettare le celle mediante centrifugazione e decantare accuratamente i surnatanti senza disturbare i pellet. Agitare le cellule nel tampone rimanente in ogni provetta e fissare i campioni con 250 microlitri di paraformaldeide al 2% per provetta.

Immediatamente agitare e incubare le provette al buio, a 4 gradi Celsius. Dopo 20 minuti, lavare le celle in un tampone di lavaggio fresco. Pellettare le celle mediante centrifugazione e decantare il surnatante senza disturbare il pellet.

Risospendere le cellule in 500 microlitri di tampone di permeabilizzazione, vortice e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti al buio. Quindi lavare e pellettare le celle. Quindi decantare i surnatanti come descritto in precedenza.

Procedere all'aggiunta di 50 microlitri di miscela master per coloranti intracellulari nelle apposite provette. Agitare ogni campione e incubare a temperatura ambiente al buio per 30 minuti. Al termine dell'incubazione, lavare e pellettare le cellule.

I campioni sono ora pronti per essere acquisiti in un citometro a flusso. I tetrameri Mamu-B017.01 producono tipicamente una colorazione fioca, che può essere sostanzialmente migliorata con il pre-trattamento delle cellule, con un inibitore della proteina chinasi. Per evitare la colorazione di fondo, le cellule MHC di classe uno compatibili che contengono o meno la popolazione di cellule T CD8 positive antigene-specifiche di interesse, devono essere marcate con il tetramero pertinente e diluizioni multiple, per determinare la quantità ottimale che si traduce nella migliore separazione tra le cellule T CD8 positive e negative del tetramero e negative.

In questi grafici, viene mostrata la strategia di gating utilizzata per analizzare l'entità e il fenotipo di memoria delle risposte delle cellule T CD8 CD8 specifiche Gag CM9 indotte dal vaccino in un macaco rhesus Mamu-A 01 positivo. Si noti che la popolazione di cellule T CD8 positive al tetramero è ben separata con una colorazione di fondo minima. E con i sottoinsiemi di memoria chiaramente delineati dalla loro espressione di CD28, CCR7 e Granzyme B all'interno del gate del tetramero.

Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in circa tre ore se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di aggiungere i reagenti corretti a ciascuna miscela di anticorpi o tetrameri master e di lavorare con le provette sperimentali ogni volta come dimostrato. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia per esplorare la specificità e il fenotipo delle cellule T CD8 antigene-specifiche.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come impostare una colorazione del tetramero MHC di classe uno nel test del modello di macaco rhesus della ricerca sull'HIV-1 AIDS umano. Non dimenticare che lavorare con campioni biologici di macachi rhesus richiede precauzioni speciali, come indossare i dispositivi di protezione individuale appropriati durante l'elaborazione del campione.