Name: Lanalisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8 + T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Scopri come quantificare le cellule T CD8+ specifiche per il virus dell'AIDS nei macachi rhesus mediante citometria a flusso. Questo metodo ottimizzato consente l'analisi diretta di campini biologici ex vivo senza stimolazione in vitro.

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Vorremmo ringraziare David Watkins per supportare gli esperimenti che hanno permesso l&#39;ottimizzazione del presente metodologia. La ricerca riportato nella presente pubblicazione è stato sostenuto in parte da una sovvenzione pilota fornito dal Miami Center for AIDS Research del National Institutes of Health con il numero premio P30AI073961. Il contenuto è di esclusiva responsabilità degli autori e non rappresentano necessariamente il punto di vista ufficiale del National Institutes of Health.

I campioni periferico cellule mononucleate del sangue (PBMC) utilizzati in questo manoscritto sono stati ottenuti da macachi Rhesus indiani alloggiati presso la Wisconsin Nazionale Primate Research Center. Questi animali sono stati curati secondo la relazione Weatherall sotto un protocollo approvato dalla University of Wisconsin Graduate School cura degli animali e del Comitato Usa 33. Tutte le procedure sugli animali sono stati eseguiti in anestesia e tutti gli sforzi sono stati fatti per ridurre al minimo il potenziale sofferenza. 1. Il trattamento PKI NOTA: Questo è opzionale, ma consigliato per Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Vedi i Risultati e discussione sezioni. <ol><li> Risospendere PBMC in terreno R10 ad una concentrazione di 1,6 x 10 7 cellule / ml. </li><li> Aggiungere 50 ml di questa sospensione cellulare al corrispondente citometria a flusso tubi. Aggiungere 50 ml di una soluzione 100 nM di PKI in ogni provetta. </li><li> Vortex ogni provetta. Incubare a 37 ° C per 30 min. Alla fine di questopasso, ogni tubo deve avere 100 ml di una sospensione cellulare contenente 8,0 x 10 5 PBMC e 50 Nm di PKI. </li><li> Procedere al passaggio pMHC-I tetramero colorazione. </li></ol> 2. La colorazione con fluorocromo etichettati pMHC-I Tetrameri <ol><li> Prima di preparare la pMHC-I tetramero master mix, centrifugare le provette tetramero pMHC-I a 20.000 xg per almeno 15 minuti a 4 ° C. L&#39;obiettivo di questa fase è quello di pellet aggregati proteici nella soluzione tetramero pMHC-I che può aumentare la colorazione di fondo. Terminata la fase di centrifugazione è fatto, evitare di pipettaggio dal fondo del tubo, dove si sono accumulati gli aggregati proteici. </li><li> Preparare abbastanza master mix tetramero pMHC-I a macchiare tutte le provette sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale di questo master mix per tenere conto di errori pipettaggio. </li><li> Diluire pMHC-I tetrameri nel buffer di macchia (ad esempio, Brilliant Stain Buffer) in modo che 25 ml di pMHC-I tetramero master mix sono Added per ogni test. <ol><li> Etichetta PBMC con due tetrameri pMHC-I per test; una coniugata allophycocyanin (APC) e l&#39;altra a Brilliant Violet (BV) 421. </li></ol></li><li> Aggiungere 8,0 x 10 5 PBMC al corrispondente citometria a flusso tubi in un volume finale di 100 microlitri. Se le cellule sono state sottoposte a trattamento PKI sopra descritto, essi dovrebbero essere già risospese in 100 pl in questa fase. </li><li> Aggiungere 25 ml di pMHC-I tetramero master mix alla corrispondente citometria a flusso tubi. Alla fine di questa fase, il volume finale in ciascun tubo dovrebbe essere 125 microlitri. </li><li> Agitare ogni provetta per omogeneizzare la sospensione cellulare. </li><li> Incubare al buio a temperatura ambiente per 45 min. Preparare il cocktail superficie di colorazione mAb durante questo 45 min di incubazione. </li></ol> La colorazione 3. Surface <ol><li> Preparare abbastanza master mix mAb a macchiare tutte le provette sperimentali. Preparare un eccesso del 15% del volume totale della master mix per spiegareper l&#39;errore pipettaggio. </li><li> Regolare il volume del master mix con tampone macchia in modo che 50 microlitri sono aggiunti per test. </li><li> Per una corretta esclusione dei non-CD8 + T-cellule e la delineazione di sottoinsiemi di memoria, uso titolato quantità di anticorpi monoclonali diretti contro le seguenti molecole del master mix superficie di colorazione. NOTA: I fluorocromi coniugati a ciascun anticorpi monoclonali sono forniti come riferimento: CD14 BV 510, CD16 BV 510, CD20 BV 510, CD8α BV 785, CD28 PE Cy7, e CCR7 FITC. Si noti che i anticorpi monoclonali contro CD14, CD16, CD20 e sono coniugati allo stesso fluorocromo (vale a dire, BV 510) dal momento che verranno inclusi nella porta &quot;dump&quot;. </li><li> Includere un colorante risolvibile per discriminare le cellule morte nel master mix superficie di colorazione [cioè, tintura reattiva ammina (ARD)]. Assicurarsi che il reagente ARD è coniugato ad un fluorocromo con uno spettro di emissione simile a quelli utilizzati nel cancello &quot;dump&quot;. In questo caso, utilizzare ARD Aqua. </li><li> Aggiungere 50 ml diil master mix colorazione descritto nella 3,1-3,4 al corrispondente citometria a flusso tubi. Alla fine di questa fase, il volume finale in ciascun tubo dovrebbe essere 175 microlitri. </li><li> Vortex ogni provetta. Incubare al buio a temperatura ambiente per 25 min. </li><li> Lavare le cellule con tampone di lavaggio (soluzione PBS contenente 0,1% di albumina sierica bovina e 0,45 g / L NaN 3). ATTENZIONE: Sodio azide è una sostanza tossica. L&#39;esposizione a anche piccole quantità può causare sintomi. Maneggiare questa sostanza secondo le linee guida indicate dal salute ambientale e Ufficio Sicurezza (EHS) presso l&#39;istituto in cui vengono eseguiti questi esperimenti. </li><li> Tubi centrifugare a 510 xg per 5 min. decantare con attenzione il surnatante in un contenitore dei rifiuti. Fare attenzione a non disturbare il pellet. ATTENZIONE: non decantare il tampone di lavaggio surnatante in serbatoi contenenti candeggina in quanto si può reagire con l&#39;azide di sodio presente nel tampone di lavaggio e causare la formazione di un gas tossico 34. Contact l&#39;Ufficio EHS presso l&#39;istituto in cui questi esperimenti sono in corso di esecuzione per le linee guida su come smaltire sodio azide. </li><li> Dopo decantazione, vortice le cellule nel liquido rimasto trattenuto in ciascun tubo. </li></ol> 4. cellulare Fixation <ol><li> Aggiungere 250 ml di una soluzione al 2% paraformaldeide (PFA) a tutte le provette per fissare le cellule. ATTENZIONE: PFA è una sostanza tossica. L&#39;esposizione a anche piccole quantità può causare sintomi. Maneggiare questa sostanza secondo le linee guida indicate dall&#39;Ufficio EHS presso l&#39;istituto in cui vengono eseguiti questi esperimenti. <ol><li> Poiché la soluzione PFA 2% deve essere isotonica alle cellule, utilizzare PBS preparare questa soluzione. Cento millilitri di una soluzione PFA 2% è sufficiente per esperimenti multipli. Accuratamente vortice tutte le provette immediatamente dopo l&#39;aggiunta del 2% PFA per evitare la formazione di aggregati di cellule. </li></ol></li><li> Incubare al buio a 4 ° C per 20 min. </li><li> Wcellule cenere di ripetendo i passaggi 3,7-3,9. Una volta che questo passaggio è completato, le cellule possono essere conservate al buio a 4 ° C per 24-48 ore. Prima di procedere alla fase di permeabilizzazione, vortice a fondo i tubi. </li></ol> 5. permeabilizzazione delle cellule <ol><li> Aggiungere 500 ml di tampone permeabilizzazione. Vortex tutte le provette. </li><li> Incubare al buio a temperatura ambiente per 10 min. </li><li> Lavare le cellule ripetendo i punti 3.7-3.9. </li></ol> 6. intracellulare colorazione <ol><li> Preparare abbastanza master mix mAb a macchiare tutte le provette sperimentali. </li><li> Regolare il volume con PBS o buffer di macchia in modo che si aggiungono 50 ml di intracellulare master mix mAb per test. </li><li> Preparare la master mix mAb indicato al paragrafo 6.1 e 6.2 Uso titolata quantità di anticorpi monoclonali diretti contro CD3 e GZM B. NOTA: l&#39;impegno TCR da tetrameri pMHC-I può provocare CD3 internalizzazione, che possono interferire con il rilevamento di tetramero + CD3 + CD8 +Cellule T se l&#39;anti-CD3 mAb è aggiunto al master mix superficie di colorazione. Per evitare questo, aggiungere l&#39;anti-CD3 mAb, in questa fase, che è, dopo le cellule vengono permeabilizzate. I fluorocromi coniugati ad ogni mAb sono elencati come riferimento: CD3 PerCP Cy5.5 e GZM B PE. </li><li> Aggiungere 50 ml di mAb cocktail ai tubi corrispondenti. Incubare al buio a temperatura ambiente per 30 minuti. </li><li> Lavare le cellule ripetendo i punti 3.7-3.9. I tubi sono pronti per essere acquisita in un citometro a flusso. </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

A pochi passi in questa discussione di merito procedura in quanto sono cruciali per cedere risultati ottimali. Innanzitutto, poiché la qualità dei campioni biologici è un forte predittore del successo di qualsiasi citometria a flusso 38, tutto occorre prestare attenzione a garantire che le cellule sono vitali e in sospensione durante la procedura di colorazione. Questo è particolarmente importante quando si lavora con campioni crioconservati poiché sono più inclini a formazione di grumi e contengono tipicamen...

CD8 + T-cellule comprendono una componente fondamentale del sistema immunitario adattativo, come partecipano tumore sorveglianza immunitaria e contribuire alla eradicazione di patogeni intracellulari 1. In termini semplici, CD8 + T-cellule esprimono i recettori delle cellule T (TCR), che riconoscono specificamente di istocompatibilità di classe complessi peptide-major I (pMHC-I) molecole presenti sulla membrana plasmatica delle cellule ospiti. Poiché questi peptidi sono derivati ​​dalla proteolisi di proteine ​​sintetizzate endogeno, pMHC-I superficie cellulare complessi forniscono una finestra nell&#39;ambiente intracellulare. Al momento l&#39;infezione da virus, per esempio, le cellule infettate mostrerà molecole MHC-I contenenti peptidi del virus di derivazione che possono servire come leganti per TCR espresse da pattugliamento CD8 + T-cellule. Nel caso in cui un CD8 + cellule T specifiche per il virus incontra una cellula infetta presentando il suo ligando pMHC-I, TCR impegno si tradurrà in attivazione + cellule T CD8 e ultinell&#39;intervallo portare a destinazione la lisi cellulare. Data la natura critica di queste interazioni TCR / pMHC-I, che determina la grandezza, la specificità, e fenotipo di rispondere CD8 + T-cellule possono spesso rivelare importanti indizi circa le malattie umane. Fino ai primi anni 1990, la quantificazione di Ag-specifici CD8 + T-cellule invocato il saggio tecnicamente impegnativo diluizione limite (LDA) 2,3. Non solo la LDA ha richiesto diversi giorni per essere completato, ma anche omesso di rilevare le cellule che mancava potenziale proliferativo. Come risultato, la LDA notevolmente sottovalutato la frequenza effettiva di antigene (Ag) specifico d&#39;CD8 + T-cellule che partecipano a una risposta immunitaria. Sebbene lo sviluppo di ELISPOT e dosaggi di citochine colorazione intracellulare notevolmente migliorato la capacità di misurare l&#39;immunità cellulare, questi metodi ancora necessari a stimolazione in vitro per la quantificazione Ag-specifiche cellule T 4. Non è stato fino al 1996 che Altman, Davis, e Colleagues pubblicato il loro punto di riferimento articolo segnalato la sviluppo della tecnologia tetramero pMHC-I 5. Fondamentale per il successo di questa tecnica è stata la multimerizzazione delle molecole pMHC-I, che si estendevano l&#39;emivita delle interazioni TCR / pMHC-I, riducendo così la probabilità di tetrameri pMHC-I cadono fuori durante le fasi di lavaggio dei dosaggi di citometria a flusso. Il vantaggio principale di tetrameri pMHC-I sopra i saggi suddetti è la capacità di rilevare con precisione Ag-specifica CD8 + T-cellule direttamente ex vivo senza la necessità di in vitro ri-stimolazione. Inoltre, la combinazione di pMHC-I tetramero colorazione con multicolore citometria a flusso ha consentito analisi dettagliate della fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione di Ag-specifici CD8 + T-cellule 2-4. Alla luce dei recenti progressi tecnici per la caratterizzazione repertori + CD8 T-cellule da pMHC-I Multimer colorazione 6, l&#39;ampiezza di applicazioni FOR questa metodologia è destinata a continuare in espansione. Poche zone nella ricerca biomedica hanno beneficiato di più dal pMHC-I tetramero colorazione di campo dell&#39;HIV dell&#39;immunologia 7. Anche se CD8 + T-cellule erano state temporalmente associato al controllo iniziale di viremia HIV dal momento della pubblicazione da Altman, Davis, e colleghi hanno 8,9, l&#39;uso di tetrameri pMHC-I, negli anni successivi notevolmente ampliato la nostra comprensione di HIV-specifica CD8 + risposta T-cellulare. Ad esempio, pMHC-I tetramero colorazione aiutato confermare la dimensione robusta di risposte delle cellule T virus-specifici CD8 + nella maggior parte delle persone con infezione da HIV 10-12. Questa metodologia anche facilitato la caratterizzazione di HIV e SIV-specifici + risposte delle cellule T CD8 limitato da molecole MHC-I associate al controllo spontaneo della replicazione virale in assenza di terapia antiretrovirale, un fenomeno noto come &quot;controllo elite&quot; <sup&gt; 13-15. Inoltre, pMHC-I tetrameri hanno contribuito a stabilire l&#39;asse morte programmata 1 (PD-1) / PD ligando 1 (PD-L1) come un percorso reversibile per il fenotipo disfunzionale di + HIV-specifica CD8 T-cellule nel infezione cronica non controllata 16,17. Collettivamente, questi studi sottolineano l&#39;utilità di tetrameri pMHC-I per monitorare le risposte delle cellule T CD8 + contro il virus dell&#39;AIDS. Sperimentale infezione SIV di macachi Rhesus (Macaca mulatta) rimane il migliore modello animale per la valutazione degli interventi del sistema immunitario contro l&#39;HIV / AIDS 18,19. Negli ultimi 25 anni, sono stati compiuti notevoli progressi nella identificazione e caratterizzazione di SIV-specifica CD8 + T-cellule in questa specie di scimmie, tra cui la scoperta di alleli MHC-I e la definizione di binding peptide motivi 13,20-27 . Come risultato, pMHC-I tetrameri sono stati sviluppati per l&#39;analisi di SIV-specifica CD8 + T-cellulerisposte in questo modello animale 28. La maggior parte di questi reagenti sono realizzati i prodotti genici di quattro macaco rhesus alleli MHC-I: Mamu-A1 * 001, Mamu-A1 * 002: 01, Mamu-B * 008: 01, e Mamu-B * 017: 01. Da segnalare, macachi Rhesus non esprimono un MHC-C locus 29. La stragrande maggioranza dei tetrameri pMHC-ho utilizzato nelle attuali esperimenti sono stati prodotti presso l&#39;impianto di NIH Tetramero core alla Emory University. Tuttavia, alcuni di questi reagenti, compresi Mamu-A1 * 001 tetrameri legati alla immunodominante epitopo Gag CM9, può essere ottenuto solo da fonti commerciali a causa di accordi di licenza. Uso tetrameri pMHC-I dei quattro alleli macaco rhesus elencati sopra abbiamo elencato con successo CD8 + T-cellule contro un totale di 21 epitopi SIV (Tabella 1), che sono stati indotta dalla vaccinazione o infezione primaria SIV 30,31 (Martins et al., osservazioni non pubblicate). Il presente manoscritto fornisce unaottimizzato protocollo tetramero colorazione pMHC-I per determinare il fenotipo frequenza e la memoria di SIV-specifici CD8 + cellule T nei macachi rhesus. Il test inizia con un elettivo 30 min di incubazione con un inibitore della proteina chinasi (PKI, qui, Dasatinib è utilizzato) al fine di diminuire TCR internalizzazione e quindi migliorare pMHC-I tetramero colorazione 32. Come descritto di seguito, questo trattamento è particolarmente utile quando si utilizza Mamu-B * 017: 01 tetrameri. Sono inoltre disponibili le istruzioni su come etichettare le cellule con tetrameri pMHC-I coniugato a un fluorocromo e anticorpi monoclonali (MAK, MAB). Questo protocollo include anche un passo permeabilizzazione cella per la rilevazione intracellulare della citolisi associata molecola granzyme B (GZM B). Il mAb contro CD3 viene aggiunto in questa fase anche per migliorare la rilevazione di questa molecola di segnalazione TCR. Come riferimento, vengono elencati tutti i fluorocromi impiegati in questo pannello colorazione.

<table><tbody><tr><td>Dasatinib</td><td>Axon medchem</td><td>Axon&nbsp; 1392</td><td>Deve essere risospeso in DMSO e immediatamente memorizzato a -20 &deg; C</td></tr><tr><td>RPMI con Glutamax</td><td>gibco/ Life Technologies</td><td>61870-036</td><td>Deve essere conservato a 4 gradi; C&nbsp;</td></tr><tr><td>Gibco FBS inattivato a caldo</td><td>/ Life Technologies</td><td>10082-147</td><td>Deve essere conservato a 4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina-Amfotericina B</td><td>Lonza</td><td>17-745E</td><td>Deve essere conservato a 4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>DMSO, Anhydrous</td><td>Life Technologies</td><td>D12345</td><td>Conservare a temperatura ambiente.</td></tr>Provette in <tr><td>polipropilene a fondo tondo da 5 ml</td><td>VWR</td><td>60819-728</td><td></td></tr><tr><td>Tetrameri pMHC-I coniugati con fluorocromo</td><td>NIH Tetramer Core o MBL, Inc.</td><td></td><td>Deve essere conservato e mantenuto a 4 °C. Centrifugare a 20.000 x g per 15 minuti prima dell'uso. Non congelare.</td></tr><tr><td>Corpi monoclonali coniugati con fluorocromo</td><td>Varie aziende</td><td></td><td>Devono essere conservati e mantenuti a 4 °C. Non congelare.</td></tr><tr><td>VIVO/MORTO&nbsp; Acqua riparabile Morto&nbsp; Kit per la colorazione delle celle</td><td>Life Technologies</td><td>l34957</td><td>Deve essere conservato a -20 °C. Risospendere ciascuna aliquota in 50 &mu; l di DMSO prima dell'uso.</td></tr><tr><td>Brilliant Stain Buffer</td><td>BD Biosciences</td><td>563794</td><td>Deve essere conservato a 4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata con fosfato</td><td>VWR</td><td>97064-158</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Albumina bovina</td><td>VWR</td><td>700011-230</td><td>Deve essere conservato a 4 gradi C&nbsp;</td></tr><tr><td>Sodio azide</td><td>VWR</td><td>97064-646</td><td>Conservare a temperatura ambiente. Sostanza tossica. Non mescolare con candeggina.</td></tr><tr><td>Candeggina</td><td>VWR</td><td>89501-620</td><td>Prodotto chimico corrosivo, non può essere miscelato con sodio azide. Maneggiare con cura</td></tr><tr><td>Paraformaldeide</td><td>Microscopia elettronica Sciences</td><td>15714-S</td><td>Reagente infiammabile, corrosivo e tossico. Maneggiare con cura</td></tr><tr><td>Polisorbato 20 (Tween-20)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L15029</td><td>Conservare a temperatura ambiente</td></tr><tr><td>Soluzione di permeabilizzazione 2&nbsp;</td><td>BD Biosciences</td><td>340973</td><td>Reagente tossico e corrosivo. Maneggiare con cura</td></tr><tr><td>le provette Sarsdet 1,5 ml tappo a vite</td><td>VWR</td><td>72.692.005</td><td></td></tr><tr><td>2,0 ml DNA/RNA Provette a basso legame</td><td>Eppendorf</td><td>22431048</td><td>L'uso di microprovette sterili è preferibile&nbsp;</td></tr><tr><td>Miscelatore a vortice</td><td>A discrezione dello scienziato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Armadio di biosicurezza&nbsp;</td><td>A discrezione dello scienziato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Milli Q Intergral Sistema di purificazione dell'acqua</td><td>EMD Millipore</td><td>ZRXQ010WW</td><td>Biologia molecolare grado acqua da qualsiasi fornitore può essere utilizzato</td></tr><tr><td>Microcentrifuga</td><td>A discrezione dello scienziato</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Centrifuga A discrezione dello scienziato</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4 ... C&nbsp; frigorifero</td><td>A discrezione dello scienziato</td><td></td><td></td></tr>, <tr>il citometro a flusso<td>BD LSR II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td>deve contenere laser e filtri compatibili con il pannello di colorazione utilizzato.</td></tr>Foglio di alluminio <tr><td>per acqua</td><td></td><td></td><td></td>deionizzata</tr><tr><td></td><td>VWR SCIENTIFIC INC.</td><td>89068-738</td><td></td></tr><tr><td>L'incubatrice</td><td></td><td></td><td>deve essere in grado di mantenere 37 &deg; C&nbsp; temperatura interna</td></tr><tr><td>software FACS Diva</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Flowjo software versione 9.6</td><td>Flowjo</td><td></td><td>Utilizzato per analizzare i file FCS generati dal software FACS Diva</td></tr><tr><td>Punte</td><td></td><td></td><td></td> Micropippette</tr></tbody></table>

l'analisi dei simian immunodeficiency virus specifici cd8 + t-cellule in rhesus macachi di peptide-mhc-i tetramero colorazione

Analysis of Simian Immunodeficiency Virus-specific CD8+ T-cells in Rhesus Macaques by Peptide-MHC-I Tetramer Staining

Istocompatibilità di classe complesso Peptide-major I (pMHC-I) tetrameri sono state uno strumento prezioso per studiare le risposte delle cellule T CD8 +. Poiché questi reagenti si legano direttamente ai recettori delle cellule T sulla superficie delle cellule CD8 + linfociti T, tetrameri fluorocromi marcato pMHC-I consentono il rilevamento accurato di antigene (Ag) + SPECIFICI CD8 T-cellule senza la necessità di re in vitro -stimolazione. Inoltre, se combinato con multicolore citometria a flusso, pMHC-I tetramero colorazione può rivelare aspetti chiave di Ag-specifici CD8 + T-cellule, tra cui fase di differenziazione, la memoria fenotipo, e lo stato di attivazione. Questi tipi di analisi sono stati particolarmente utile nel campo della immunologia HIV dove CD8 + T-cellule possono influenzare la progressione in AIDS. infezione sperimentale di macachi rhesus con virus dell&#39;immunodeficienza delle scimmie (SIV) fornisce uno strumento prezioso per studiare l&#39;immunità cellulare contro il virus dell&#39;AIDS. Come risultato, notevole progress è stato fatto nel definire e caratterizzare le risposte delle cellule T in questo modello animale. Qui vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l&#39;enumerazione SIV-specifica CD8 + T-cellule in macachi Rhesus di pMHC-I tetramero colorazione. Il nostro test permette la simultanea quantificazione e la memoria fenotipizzazione di due popolazioni CD8 + pMHC-I tetramero + T-cellule per test, che potrebbe essere utile per il monitoraggio SIV-specifiche risposte delle cellule T CD8 + generati dalla vaccinazione o infezione SIV. Considerando la rilevanza di primati non umani nella ricerca biomedica, questa metodologia è applicabile per studiare le risposte delle cellule T CD8 + in più impostazioni di malattia.

Il protocollo qui descritto è stato utilizzato per determinare l'ampiezza e la memoria fenotipo di vaccino-indotta, Gag CM9-specifiche risposte delle cellule T CD8 + in un Mamu-A1 * 001 + macaco rhesus. Per questa analisi, un APC-coniugato tetramero Mamu-A1 * 001 / Gag CM9 è stato utilizzato in un pannello colorazione citometria a flusso a 8 colori. Figura 1A - F mostra la strategia di gating utilizzato per analizzare i dati, che dovr...

Qui, vi presentiamo un protocollo ottimizzato per l&#39;enumerazione e la caratterizzazione di cellule macaco rhesus T CD8 + contro il virus dell&#39;AIDS. Questo articolo è utile non solo al campo della immunologia HIV, ma anche ad altri settori della ricerca biomedica cui sono note le risposte delle cellule T CD8 + influenzare l&#39;esito della malattia.

L'analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8 + T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione

Peptide-major histocompatibility complex class I (pMHC-I) tetramers have been an invaluable tool to study CD8+ T-cell responses. Because these reagents ...

L'obiettivo generale di questo test è quello di enumerare e caratterizzare le popolazioni di cellule T CD8 positive specifiche per il virus dell'immunodeficienza delle scimmie generate dalla vaccinazione o dall'infezione primaria. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'immunologia delle cellule T, come ad esempio qual è la frequenza delle cellule T CD8 antigene-specifiche indotte dalla vaccinazione o dall'infezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che può quantificare le cellule T CD8 antigene-specifiche in campioni biologici ottenuti direttamente ex vivo senza la necessità di restimolazione in vitro.Le implicazioni di questa tecnica si estendono alla valutazione delle cellule T CD8 specifiche per l'incisione nel macaco rhesus e allo studio delle risposte delle cellule T CDB in diversi contesti di malattia. In generale, gli individui che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a causa delle conoscenze incomplete disponibili per la genetica MHC del macaco rhesus e perché la colorazione citofluorimetrica richiede un'applicazione precisa degli anticorpi. Inizia ri-sospendendo il PBMC rhesus in R10 medium.Aggiungere una concentrazione

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Questa procedura dimostra la purificazione e l'espansione in vitro di cellule CD4 + antigene specifico le cellule T del sangue periferico da tutto e la loro visualizzazione utilizzando tetrameri MHC di classe II. Tetrameri consentire la visualizzazione diretta delle cellule T con una singola specificità antigenica e definito MHC di classe II restrizione.

CD4 + antigene specifico visualizzando cellule T con MHC di classe II tetrameri

Una tecnica che combina in colorazione tetramero situ e di ibridazione in situ (ISTH) consente la visualizzazione, la mappatura e l'analisi della vicinanza spaziale del virus-specifiche cellule T CD8 + ai loro infettati da virus obiettivi, e la determinazione delle relazioni quantitative tra questi effettori immuni e gli obiettivi ai risultati infezione.

Una tecnica di visualizzare contemporaneamente Virus specifiche cellule CD8 + T e cellule infettate da virus In situ</em

Abbiamo dimostrato l'utilità di citometria a flusso multicolore per informazioni dettagliate caratterizzazione fenotipica e funzionale del totale così come sottoinsiemi memoria di CD4 + e CD8 + T nei macachi rhesus, il modello ideale per l'HIV / AIDS studi vaccino.

Multicolor Citometria a Flusso di analisi Cellular risposta immunitaria in macachi Rhesus

Questo protocollo descrive l'uso del peptide: MHC tetrameri e microsfere magnetiche per isolare popolazioni bassa frequenza di epitopo-specifiche cellule T e analizzarli mediante citometria a flusso. Questo metodo consente lo studio diretto delle popolazioni di cellule T endogene di interesse...

Peptide: MHC Tetramero basata Arricchimento di epitopi specifici per cellule T

Questo video mostra un metodo per caratterizzare le cellule T di memoria CD8+ specifiche per il virus dell'immunodeficienza delle scimmie (SIV) utilizzando tetrameri del complesso di istocompatibilità maggiore peptidico di classe I (pMHC-I). Un tetramero pMHC-I è un complesso di quattro molecole MHC-I legate a peptidi specifici per SIV e coniugate a un fluoroforo. Questi tetrameri si legano selettivamente ai recettori delle cellule T (TCR) sulle cellule T CD8+ specifiche per SIV, facilitando la...

Una tecnica di colorazione del tetramero peptide-MHC-I per analizzare le cellule T di memoria CD8+ specifiche per SIV

Qui, descriviamo un metodo che unisce in situ MHC-tetramero colorazione immunoistochimica per determinare la localizzazione, fenotipo e la quantità di cellule T antigene-specifiche nei tessuti. Questo protocollo viene utilizzato per determinare le caratteristiche spaziali e fenotipiche delle cellule CD8 T antigene-specifiche rispetto a strutture in tessuti e altro tipo di cellula.

In Situ MHC-tetramero macchiatura e analisi quantitativa per determinare la posizione, l'abbondanza e fenotipo di cellule T antigene-specifiche CD8 nei tessuti

Descritto è una metodologia per quantificare l'espressione di 96 geni e 18 proteine di superficie da singole cellule ex vivo, che consenta l'identificazione di differenzialmente espressi geni e proteine in cellule infettate da virus rispetto a cellule non infette. Applichiamo l'approccio allo studio SIV-infettati CD4+ T cellule isolate da macachi rhesus.

Cella singola quantificazione del mRNA e l'espressione di proteine di superficie CD4 infettati da Virus di immunodeficienza delle scimmie+ T cellule isolate da macachi Rhesus

Qui, presentiamo un protocollo per l'ex vivo determinazione qualitativa dell'antigene-specifiche CD8+ T cellule. L'analisi è possibile con sospensioni di cellule singole da organi o da piccole quantità di sangue. Una vasta gamma di studi richiedono l'analisi delle risposte a cellula T citotossica (vaccinazione e studi di immunoterapia del cancro).

Determinazione quantitativa simultanea delle anti-vettore e Anti-transgene-Specific CD8+ T cellule tramite MHC I tetramero colorazione dopo la vaccinazione con un vettore virale

Forniamo un protocollo dettagliato per l'isolamento e l'identificazione di rare popolazioni di cellule T antigene-specifiche nei polmoni di topo attraverso l'arricchimento di cellule T basato su biglie magnetiche e i tetrameri peptide:complesso maggiore di istocompatibilità (MHC).

Identificazione di rare cellule T antigene-specifiche da polmoni di topo con tetrameri del complesso peptide:istocompatibilità maggiore

Il saggio di rilascio di cromo, un test comune per rilevare l'attività delle cellule T citotossiche, ha diversi limiti. Utilizzando cellule T CD8 antigene-specifici e la linea tumorale umano cancro al seno, SKBR3, nel presente articolo, un approccio basato impedenza è stata esaminata per la capacità di rilevare uccisione delle cellule.

Determinazione ottimale attività citotossica di specifiche cellule T umane Her2neu CD8 confrontando il Cr51 saggio di rilascio al Sistema xCELLigence

Scopri come quantificare le cellule T CD8+ specifiche per il virus dell'AIDS nei macachi rhesus mediante citometria a flusso. Questo metodo ottimizzato consente l'analisi diretta di campini biologici ex vivo senza stimolazione in vitro.

L'analisi dei Simian Immunodeficiency Virus specifici CD8⁺ T-cellule in Rhesus macachi di peptide-MHC-I Tetramero colorazione

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