La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e testare rapidamente i possibili confini di dominio all'interno di grandi proteine a spirale per migliorare la probabilità di trovare un frammento intrinseco che cristallizzerà. Questo metodo può aiutare i ricercatori a semplificare il processo di cristallizzazione per le grandi proteine a spirale, che possono essere notoriamente difficili da cristallizzare. Il vantaggio di questa tecnica è che integra metodi sperimentali e computazionali per identificare e selezionare rapidamente i probabili candidati alla cristallizzazione, migliorando così le loro possibilità di successo.

A dimostrare questa tecnica saranno Jenna Zalewski, una studentessa laureata nel mio laboratorio, e Keith O'Conor, un ricercatore universitario nel mio laboratorio. Per iniziare, combina l'output di strumenti basati sul Web consolidati per generare previsioni dei possibili confini del dominio a spirale come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver generato i plasmidi di espressione e testato i loro livelli di espressione come descritto nel testo, iniziare la purificazione di ogni ceppo che ha espresso con successo la proteina marcata con Ruby.

Per lisare le cellule, prima risospendere ogni pellet cellulare scongelato in 1,5 millilitri di tampone di lisi che è stato integrato con inibitori della proteasi. Aggiungere 30 microlitri di lisozima a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi sonicare, seguendo le istruzioni per lo strumento in uso. Centrifugare il campione in una centrifuga da tavolo per 30 minuti a 14.000 volte G in materiale insolubile in pellet o celle non lassizzate.

Conservare sia il surnatante che il pellet per la successiva analisi tramite SDS-PAGE. Per eseguire la purificazione dell'affinità del nichel, incubare prima 100 microlitri di perle di nichel NTA, prelavate in tampone di lisi con il lisato solubile per cinque-10 minuti. Capovolgere la sospensione più volte per mescolare le perline.

Centrifugare il campione a 800 volte G per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per pellettare le perle. Successivamente lavando il pellet da tre a cinque volte con un tampone di lisi per eliminare i contaminanti non specifici. Infine, eluire la proteina di fusione Ruby dalle perle con tampone di lisi, integrato con un molare imidazolo.

Utilizzare uno spettrofotometro impostato a 280 nanometri per misurare la concentrazione della proteina di fusione Ruby, quindi valutare l'omogeneità del campione caricando da uno a cinque microgrammi di proteina di fusione su un gel PAGE nativo. Far funzionare il gel PAGE nativo al 10% a quattro gradi Celsius per 140 minuti a 175 volt. Immagine della PAGE nativa utilizzando un imager attrezzato per visualizzare la fluorescenza, osservando dove migra la fusione con tag Ruby in questo saggio.

Eseguire una proteolisi limitata per identificare domini ripiegati in modo stabile incubando prima 95 microlitri di fusione Ruby-Shroom SD2 con cinque microlitri di 0,025 Subtilisin A.Campionare la reazione in punti temporali di zero, 0,5, due, cinque, 15, 60 e 120 minuti, rimuovendo 10 microlitri dalla reazione per ogni punto temporale e visualizzando l'andamento della reazione tramite SDS-PAGE utilizzando un gel di acrilammide al 15%. Colora il gel con il blu di Coomassie per valutare se è possibile identificare una specie resistente alla proteasi. Integrare i dati dell'efficienza di purificazione, del comportamento in PAGE nativo e della proteolisi limitata sulle proteine di fusione mRuby2-Shroom parzialmente purificate in una valutazione completa del comportamento complessivo di queste proteine in soluzione.

Eseguire espressioni su larga scala con colture da due litri di mRuby2-Shroom SD2 con l'obiettivo di ottenere da cinque a 20 milligrammi di campione completamente purificato. Dopo la crescita cellulare, pellettare le cellule mediante centrifugazione a 8.000 volte G per 10 minuti. Il pellet di cella risultante può essere conservato a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno.

Quindi, risospendere il pellet in circa otto millilitri di tampone di lisi per grammo di pellet di cella congelata. Lisi le cellule risospese utilizzando un omogeneizzatore. Dopo la lisi cellulare, pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 volte G per 30 minuti.

Successivamente, legare in batch la frazione solubile utilizzando 10 millilitri di resina di nichel NTA prelavata. Versare la sospensione di perle in un'appropriata colonna a gravità e lasciare defluire le proteine non legate, quindi lavare la resina da tre a cinque volte con 40 millilitri di tampone di lisi, seguito da un lavaggio con tampone di lisi integrato con un molare di cloruro di sodio. Eseguire un lavaggio finale della resina con 40 millilitri di tampone di lisi integrato con 80 millimolari di imidazolo.

Eluire la proteina di fusione Rubino-Fungo con 40 millilitri di tampone di lisi contenente un molare di imidazolo. Frazionare manualmente la proteina eluita in frazioni da quattro a 10 millilitri. Confermare le frazioni contenenti la proteina di fusione Ruby-Shroom utilizzando un gel SDS-PAGE al 10%.

Aggiungere un milligrammo di proteasi TEV per ogni 25-50 milligrammi di proteina di fusione per rimuovere l'etichetta Ruby. Successivamente, dializzare le frazioni appropriate nel tampone di scissione TEV utilizzando un tubo per dialisi con cutoff molecolare da sei a otto kilodalton. Dializzare le proteine per una notte a temperatura ambiente mescolando lentamente.

Dopo la dialisi, ripetere i passaggi di purificazione per affinità con il nichel. Il dominio Shroom-SD2 dovrebbe fluire attraverso la frazione non legata, mentre il tag Ruby rimane legato alla resina. Utilizzando un concentratore di centrifuga, concentrare le frazioni di picco a circa 10 milligrammi per millilitro, quindi eseguire la cromatografia ad esclusione dimensionale analizzando le frazioni di picco tramite un gel SDS-PAGE al 12%.

Dopo aver raggruppato le frazioni di picco, dializzare la soluzione in tampone di cristallizzazione, quindi concentrare la proteina dializzata a 10 milligrammi per millilitro prima della cristallizzazione. Screening di una piccola serie di 12 condizioni per identificare una concentrazione proteica ottimale per le prove di cristallizzazione utilizzando vassoi di cristallizzazione a goccia da 24 pozzetti. Eseguire prove di cristallizzazione utilizzando il metodo della diffusione del vapore.

Per prima cosa, pipettare 500 microlitri di ciascuna delle 12 condizioni in pozzetti separati. Su ogni piedistallo, fare delle gocce che contengano un microlitro di soluzione a pozzetti e un microlitro di campione proteico. Sigillare rapidamente il vassoio con nastro trasparente, quindi spostarlo in un ambiente adatto a temperatura controllata e privo di vibrazioni.

Esamina le gocce nei vassoi nei prossimi tre giorni utilizzando un microscopio con un ingrandimento fino a 100X. Alla fine del periodo di tre giorni, segnare ogni goccia come priva di precipitazioni, precipitazioni leggere, precipitazioni abbondanti o cristalli. Una concentrazione proteica adeguata non dovrebbe contenere più di sei precipitazioni abbondanti.

Utilizzando la concentrazione proteica determinata, è possibile eseguire lo screening di un'ampia gamma di schermi di cristallizzazione disponibili in commercio. L'uso di un robot per la manipolazione dei liquidi o la cristallizzazione velocizza notevolmente questo processo, riducendo al minimo l'errore nelle gocce. Richiede molte meno proteine, consentendo all'utente di esaminare più condizioni con un singolo campione.

Migliorare le condizioni iniziali identificate dagli schermi larghi variando sistematicamente ciascuna delle variabili all'interno della goccia di cristallizzazione utilizzando vassoi di vagliatura a 24 pozzetti, come in precedenza. La proteolisi limitata viene utilizzata per identificare le regioni della proteina che potrebbero essere flessibili o comunque più accessibili alla proteasi. Di seguito è mostrato un modello di degradazione per un dominio SD2 che è proteoliticamente sensibile e un altro che è abbastanza stabile.

Una proteolisi limitata è stata eseguita nel contesto delle proteine di fusione Ruby. In questo caso, la sequenza linker tra Ruby e il dominio SD2 è stata rapidamente scissa, come previsto, ma i frammenti di Ruby e SD2 risultanti sono rimasti sostanzialmente stabili. L'analisi da parte di PAGE nativo può rivelare rapidamente buoni candidati per la cristallizzazione.

Quattro complessi Shroom-Rock con diverse batterie proteiche sono stati eseguiti su gel nativi di PAGE. Il complesso contenente le rocce da 834 a 913 ha avuto il miglior comportamento e si è cristallizzato prontamente, mentre gli altri si sono cristallizzati solo al momento della degradazione o non sono riusciti a cristallizzarsi completamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare una serie di potenziali confini di dominio per la tua grande proteina a spirale e come utilizzare il sistema Ruby per identificare rapidamente e rapidamente i migliori candidati per la cristallizzazione.

Sebbene la cristallografia rimanga un'attività che richiede molto tempo, l'utilizzo di questa tecnica concentrerà la ricerca di proteine che cristallizzeranno utilizzando saggi semplici per rimuovere i candidati scadenti, consentendoti di dedicare più tempo ai candidati con migliori prospettive di successo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere quante più informazioni possibili quando si selezionano i possibili confini del dominio. Le informazioni che scegli di selezionare quando utilizzi questa procedura varieranno per ogni proteina.

Se possibile, dovrebbero essere eseguiti altri metodi, come saggi cellulari o biochimici, per garantire che i frammenti proteici in questione contengano ancora la funzione di interesse biologico. Sebbene questo metodo sia focalizzato sulle proteine coiled-coil, il quadro generale potrebbe essere facilmente adattato per quasi tutte le proteine. Non dimenticare che lavorare con determinati strumenti e reagenti biologici può essere pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario seguire sempre precauzioni, come l'uso di guanti o l'uso di occhiali protettivi.