Name: La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-06T10:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 14 s
Description: Scopri un metodo integrato che combina tecniche sperimentali e computazionali per identificare rapidamente i confini di dominio nelle proteine a grande dominio a spirale avvolta, migliorando significativamente le probabilità di successo nella cristallizzazione.

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Questo lavoro è stato supportato dalla sovvenzione NIH R01 GM097204 (APV e JDH). Il finanziamento per JHM è stato fornito da una borsa di studio estiva per la ricerca universitaria HHMI.

NOTA: Un diagramma del quadro concettuale o workflow è descritta nella figura 1 per riferimento. Il protocollo può essere suddiviso in quattro fasi: previsioni basate computazionali o di sequenza, di espressione proteica e purificazione, caratterizzazione biochimica e cristallizzazione. Gli esempi mostrati analizzano domini Shroom SD2 e / o complessi Shroom-rock, ma possono essere utilizzati con qualsiasi proteina. 1. Utilizzare Fondata strumenti basati sul Web per generare previsioni computazionali di dominio confini avvolto a spirale <ol><li> Raccogliere un Set evolutivo vario di sequenza omologhi. <ol><li> Vai a www.uniprot.org e digitare Shroom nella barra di ricerca in alto. </li><li> Selezionare le sequenze di scaricare selezionando la casella accanto al loro numero di registrazione. Sequenze con una stella indicano sequenze recensiti da UniProt e sono generalmente più affidabili. Fare attenzione a garantire che tutte le sequenze sono complete e accurate. </li><li> Salvare le s selezionatiequences facendo clic sul pulsante Download. </li><li> Allineare la raccolta di sequenze Shroom usando Clustal-Omega 21 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/). Fare clic sul pulsante &quot;Sfoglia&quot; per selezionare il file con le sequenze Shroom e poi premere Invia. </li><li> Dopo l&#39;allineamento è completo, fare clic sul pulsante &quot;Scarica Allineamento file&quot;. </li><li> Aprire la allineamento di sequenze multiple generate in 1.1.5 usando jalview (File | ingresso di allineamento | Da file). All&#39;interno della nuova finestra di allineamento, il colore per identità (colore | Percentuale di identità). </li></ol></li><li> Calcolare le previsioni di struttura secondaria, previsioni di sequenza flessibile o disordinato, e previsto regioni avvolto a spirale all&#39;interno della proteina (s) di interesse. <ol><li> Vai a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, per calcolare le previsioni avvolto a spirale. Copiare e incollare la sequenza nella casella Sequence e fare clic su Invia. NOTA: Questa analisi può richiedere un paio d&#39;ore di compLete. Dal momento che le sequenze Shroom sono abbastanza grandi, possono avere bisogno di essere diviso in blocchi di meno di 1.000 aminoacidi per rientrare nel vincolo dimensioni del server web le sequenze. Nell&#39;analizzare Shrm2, si raccomanda che gli acidi C-terminale 1,000 aminoacidi sono usati come questa sezione contiene il dominio SHRM SD2 che è noto per contenere regioni coiled-coil. Ripetendo questa analisi con altre proteine, si raccomanda di utilizzare le sequenze di proteine ​​integrali quando possibile. Se questo non è un&#39;opzione, utilizzare il più grande frammento possibile o sezionare la sequenza in base ai dati biochimici e funzionali noti. </li><li> Vai a http://gpcr.biocomp.unibo.it/cgi/predictors/cc/pred_cchmm.cgi, per calcolare le previsioni avvolto a spirale. Copiare e incollare la sequenza nella casella Sequence e fare clic su Invia. </li></ol></li><li> Combinare i risultati delle fasi 1.1 a 1.2.2 in un&#39;unica annotazione completa della sequenza Shroom. NOTA: E &#39;altamente incoraggiati a includere anche qualsiasi e tutti i rilevantinformazioni che si può ricavare dalla letteratura o da altre fonti circa la funzione delle proteine ​​o di purificazione in questa fase. </li><li> Utilizzando questa sequenza annotata completa, prevedere dominio confini (o una serie di possibili confini) per la proteina, cercando di massimizzare conservazione e predetto caratteristiche strutturali minimizzando la quantità di successione disordinata o flessibile. Se noto, la proteina risultante dovrebbe mantenere le proprietà funzionali di interesse. </li></ol> 2. espresso e purificare proteine ​​con i confini del dominio indicata nella sezione 1 NOTA: L&#39;obiettivo di questa sezione è quello di utilizzare una serie di test rapidi e facilmente quantificabili per lo screening confini del dominio ipotetici generati nella sezione 1. <ol><li> Usando tecniche standard di biologia molecolare, generare un plasmide di espressione con la sequenza codificante desiderata nel frame all&#39;interno della sua 10 -mRuby2-XH2 plasmide (vedere Figura 3 per la mappa vettoriale unND ulteriori dettagli). </li><li> I livelli di espressione di test per ogni plasmide di espressione usando BL21 (DE3) E. coli o di altro idoneo ceppo di espressione nei mezzi di autoinduzione 1 a temperatura ambiente per 18-24 ore. <ol><li> Trasforma plasmidi di espressione, nonché un controllo plasmide vuoto in BL21 (DE3) seguendo le istruzioni fornite con le cellule o utilizzando robusto protocollo di trasformazione, come quella qui (https://www.addgene.org/plasmid-protocols/bacterial -trasformazione/). </li><li> Dal piatto appena trasformato, scegliere una singola colonia e far crescere una cultura di avviamento 5 ml a 37 ° C durante la notte in lisogenia Broth (LB) media con 34 ug / ml kanamicina. </li><li> Il giorno seguente, pellet la cultura e lavare il pellet con LB. fresco </li><li> Aggiungere la coltura starter a 50 ml di mezzi di autoinduzione con 34 ug / ml kanamicina. Lasciare che la cultura di crescere alla saturazione sia a temperatura ambiente o 37 ° C. Tipicamente, crescere per ~ 18-24 ore. </li><li> cell pellets e congelare i pellet cellulari risultanti a -80 ° C indefinitamente prima purificazione. </li><li> Confronto estratti di cellule intere da ogni ceppo espressione e il controllo vettore vuoto mediante SDS-PAGE per determinare il ceppo che produce più efficiente della proteina di fusione desiderata. Per il suo 10 proteine di fusione -mRuby2-Shroom SD2, eseguire 10% gel SDS-PAGE a 180 V per ~ 50 minuti o fino a quando il fronte del colorante raggiunge il fondo del gel 22. </li><li> Gel Stain con Coomassie Blu per visualizzare le proteine cellulari totali all&#39;interno di ogni ceppo 23. </li></ol></li><li> Eseguire una fase iniziale cromatografia di affinità su ogni ceppo che ha espresso con successo proteina mRuby2-fusion. Tipicamente, eseguire i passaggi di purificazione 2.3.2-2.3.7 a temperatura ambiente, a meno che la proteina beneficerà mutate condizioni quali la depurazione a 4 ° C. <ol><li> pellet cellulari Scongelare dal punto 2.2.5. </li><li> Risospendere ogni pellet di cellule in 1,5 ml di tampone di lisi (10% glicerolo, 500 mM NaCl, 40mM imidazolo, 20 mM Tris pH8.0, 1 mM beta-mercaptoetanolo). Integrare il tampone di lisi con inibitori della proteasi a seconda dei casi. </li><li> Aggiungere 30 ml di 10 mg / ml di lisozima e incubare a temperatura ambiente per 20 min. Sonicare seguendo le istruzioni per lo strumento in uso. </li><li> Trasferire in una provetta da 1,5 ml e centrifugare in una tabella centrifuga per 30 minuti a 14.000 xg per pellet materiale insolubile o cellule non lisate. Salvare sia il surnatante e pellet per la successiva analisi mediante SDS-PAGE. </li><li> Eseguire la purificazione di nichel affinità, incubando la frazione solubile con 100 ml di perline Ni-NTA. Incubare le perline con lisato solubile per 5-10 minuti, invertendo più volte per mescolare perline. </li><li> Centrifugare a 800 xg per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per sedimentare le perline. Seguire questa lavando il pellet 3-5 volte con tampone di lisi per pulire contaminanti non specifici. </li><li> Elute Rubino proteina di fusione dalle perline con tampone di lisi integrata con 1M imidazolo. </li><li> Utilizzare SDS-PAGE per confrontare il comportamento dei Suoi-mRuby2-Shroom proteine ​​nella purificazione &quot;veloce e sporco&quot; di cui sopra. </li></ol></li></ol> 3. Caratterizzare proteine ​​di esempio per identificare quelli con proprietà vantaggiose <ol><li> Utilizzare un set spettrofotometro a 280 nm per misurare la concentrazione della proteina di fusione rubino, e quindi valutare l&#39;omogeneità del campione caricando 1-5 mg di proteina di fusione su un gel nativo PAGE 24. Eseguire il gel PAGE nativa 10% a 4 ° C per 140 min a 175 V. <ol><li> La pagina in immagine nativo utilizzando un imager dotato di visualizzare la fluorescenza, osservando dove la fusione mRuby-tag migra in questo saggio. NOTA: Fare attenzione a rispettare proteina di fusione che è bloccato nel pozzo come questa proteina è probabile aggregato. Se un imager a fluorescenza non è disponibile, si può spesso visualizzare e campioni di immagini concentrato di Rubino tagged proteine ​​sotto una luce nera o con una scatola di luce UV. </li></ol></li><li> Eseguire proteolisi limitata per identificare domini stabilmente piegato. Incubare 95 ml di Ruby-SHRM SD2 fusione a ~ 1 mg / ml con 5 ml di 0,025% Subtilisina A. <ol><li> Campione la reazione in momenti di 0, 0,5, 2, 5, 15, 60, e 120 min, rimuovendo 10 microlitri dalla reazione per ciascun punto di tempo e visualizzando l&#39;andamento della reazione tramite SDS-PAGE su gel di acrilammide 15% . </li><li> Macchia con Coomassie blu come al punto 2.2.7 e valutare se una specie resistenti della proteasi possono essere identificati. </li></ol></li><li> Integrare dati da l&#39;efficienza di purificazione, il comportamento in PAGE nativo, e proteolisi limitata sulle parzialmente purificate proteine ​​di fusione mRuby2-Shroom in una valutazione globale del comportamento complessivo di queste proteine ​​in soluzione. <ol><li> (Facoltativo) Se un test funzionale adatto è disponibile, verificare la presenza di attività a questo punto. </li></ol></li></ol> 4. Produrre cristalli di alta qualità del coiled-coil SD2Dominio da Shroom NOTA: tutte le iniziative in paragrafo 4.1 vengono eseguite a temperatura ambiente a meno che la proteina potrebbe beneficiare di purificazione ad una temperatura diversa, di solito 4 ° C. <ol><li> Utilizzando i 50 ml crescite come una stima approssimativa di espressione e di potenziale di purificazione, eseguire le espressioni su larga scala di mRuby2-Shroom SD2 con l&#39;obiettivo di raggiungere 5-20 mg di campione completamente purificato. Tipicamente 2 L della cultura fornisce un adeguato materiale di partenza. Dopo che le cellule di crescita pellet per centrifugazione a 8.000 xg per 10 min. <ol><li> Risospendere il pellet dalla crescita 2 L in tampone di lisi come prima, utilizzando ~ 2 ml di lisi per grammo di pellet congelato se si utilizza il lisozima per lisi. In alternativa, risospendere in ~ 8 ml / g di pellet se si utilizza un omogeneizzatore o di stampa francese. Pellet detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 xg per 30 min. </li><li> Batch impegna la frazione solubile da 4.1.1 utilizzando 10 ml di resina Ni-NTA. Versare in colonna gravità del casoe permettono proteine ​​non legate a sgocciolare. </li><li> Lavare resina 3-5 volte con 40 ml di tampone di lisi, seguita da un lavaggio con tampone di lisi integrato a 1 M NaCl. </li><li> resina lavata con 40 ml di tampone di lisi supplementato con 80 mM imidazolo. </li><li> Eluire la proteina di fusione Ruby-Shroom con 40 ml di tampone di lisi integrate per 1 M imidazolo. frazionare manualmente la proteina eluita in 4-10 ml frazioni. </li><li> Confermare frazioni contenenti Ruby-Shroom proteina di fusione con il 10% SDS-PAGE. </li><li> Dializzare frazioni appropriate (in genere frazioni 2-4) in 8% glicerolo, 250 mM NaCl, 15 mM imidazolo, 20 mM Tris pH8.0, 1 mm β-ME, utilizzando 6-8 kDa MWCO tubi di dialisi. Aggiungere 1 mg di TEV proteasi per ogni 25-50 mg di proteina di fusione. Dializzare notte a temperatura ambiente con lenta agitazione. </li><li> Ripetere la purificazione nichel affinità passi 4.1.2. a 4.1.6. Il dominio Shroom SD2 dovrebbe ora rimanere nella frazione non legata mentre il suo 10 -mRuby2 rimarrà legato ala resina e si trovano nelle frazioni di eluizione. Confermare con il 12% di colorazione SDS-PAGE con Coomassie blu. </li><li> Dializzare frazioni contenenti dominio Shroom SD2 in 8% glicerolo, 100 mM NaCl, 20 mM Tris pH 8,0, 5 mM tampone beta-mercaptoetanolo durante la notte. </li><li> Eseguire anionico cromatografia a scambio 25 tramite un FPLC, ed eluendo con un gradiente di NaCl dal 0.1-1.0 M NaCl. Analizzare le frazioni con il 12% SDS-PAGE. </li><li> Utilizzando un concentratore di spin (MWCO di 10 kDa o maggiore a seconda della proteina studiata), concentrato frazioni di picco a ~ 0 mg / ml, e quindi eseguire cromatografia ad esclusione sterica 26, analizzando frazioni di picco con il 12% SDS-PAGE. </li><li> Pool frazioni di picco e Dializzare in 20 mM Tris pH 8,0, 50 mM NaCl, 2% glicerolo, 1 mM β-ME, e si concentrano a 10 mg / ml prima cristallizzazione. Opzionale: Durante questa fase, rimuovere 5 campioni microlitri a concentrazioni di 1, 2, 5 e 10 mg / ml nel corso della concentrazione del campione.Eseguire un nativo di caricamento delle pagine 2-5 ml di ogni campione a guardare il comportamento del campione durante questa fase. </li></ol></li><li> Schermo una piccola serie di 12 condizioni per identificare una concentrazione proteica ottimale per prove di cristallizzazione. La composizione di queste condizioni è descritto nella Figura 7. <ol><li> Utilizzando 24-well seduta vassoi cristallizzazione goccia, eseguire prove di cristallizzazione utilizzando il metodo di diffusione del vapore, pipettaggio 500 ml di ciascuna delle 12 condizioni in pozzetti separati seguiti da gocce che inizialmente contenenti 1 ml di soluzione ben e 1 ml di campione proteico sui vetrini . Vedere 27 per ulteriori informazioni su questa tecnica. </li><li> Chiudere immediatamente il vassoio con nastro adesivo trasparente e spostare il vassoio per un ambiente a temperatura controllata adatto che è privo di vibrazioni. La temperatura utilizzata può variare, ma 4 ° C, 16 ° C e 20 ° C sono abbastanza comuni. </li><li> Esaminare le gocce nei vassoi per il prossimo 3 dAYS utilizzando un microscopio fino a ingrandimento 100X. Alla fine del periodo di 3 giorni, segnare ogni goccia come contenete senza precipitazione (chiaro), precipitazione luce, precipitazioni pesanti (marrone), o cristalli. Una concentrazione proteica adatto dovrebbe contenere non più di 6 precipitazioni pesanti. </li><li> Utilizzando la concentrazione proteina identificata in 4.2, programmare una vasta gamma di schermi cristallizzazione disponibili in commercio. L&#39;uso di una manipolazione o cristallizzazione robot liquido accelera notevolmente questo processo riducendo al minimo errore nelle gocce. Esso richiede molto meno proteine ​​pure, permettendo all&#39;utente di schermo più condizioni con un singolo campione. </li><li> Migliorare le condizioni iniziali individuati dagli schermi ampi variando sistematicamente ciascuna delle variabili all&#39;interno della goccia di cristallizzazione con 24 pozzetti vassoi di screening come prima. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Il protocollo qui descritto è stato progettato per aiutare l&#39;utente a identificare i confini del dominio all&#39;interno di grandi proteine ​​avvolto a spirale per facilitare la loro cristallizzazione. Il protocollo si basa su una incorporazione olistica di una varietà di dati da predizioni computazionali ed altre fonti per generare una serie di potenziali dominio confini. Seguono una serie di esperimenti biochimici che sono veloce e poco costoso, e che sono utilizzati per raffinare ulteriormente queste ipotesi iniz...

determinazione della struttura mediante cristallografia a raggi X ha dato un contributo fondamentale a tutti i campi della biologia moderna; fornendo una vista atomico delle macromolecole che sostengono la vita e come interagiscono tra loro in una varietà di contesti; che ci permette di comprendere i meccanismi che causano la malattia e che offrono opportunità di progettare razionalmente farmaci per il trattamento della malattia. Cristallografia è stata a lungo la tecnica sperimentale dominante per determinare la struttura macromolecolare, che rappresentano attualmente il 89,3% della base di dati strutturale (www.rcsb.org). Questa tecnica ha molti vantaggi, compreso il potenziale molto alta risoluzione, la capacità di visualizzare macromolecole con una vasta gamma di dimensioni, di relativamente facile raccolta dei dati, e la possibilità di visualizzare come macromolecola interagisce con solventi e leganti. Nonostante i numerosi miglioramenti tecnologici nel espressione della proteina ricombinante 1,2, purification 3, e della biologia molecolare utilizzato per generare questi sistemi 4, il vero grande ostacolo nel processo cristallografica rimane la capacità di crescere cristalli di qualità diffrazione. Questo è stato particolarmente vero per le proteine ​​che contengono domini di grandi dimensioni avvolto a spirale. E &#39;stato stimato che ben il 5% di tutti gli aminoacidi si trovano all&#39;interno di bobine a spirale 5,6, rendendo questa una caratteristica strutturale molto comune 7, eppure queste proteine sono spesso più difficili da purificare e cristallizzare di proteine globulari 8-10 . Questo è ulteriormente aggravato dal fatto che i domini coiled-coil trovano spesso nel contesto di una proteina più grande, quindi prevedere correttamente i confini di questi domini è fondamentale per evitare l&#39;inclusione di sequenza non strutturata o flessibile che spesso è dannosa per la cristallizzazione. Qui vi presentiamo un quadro concettuale che unisce web-based computazionale analisi con Experimental dati dalla panchina, per aiutare gli utenti di guida attraverso le fasi iniziali del processo cristallografica, tra cui: Come selezionare frammento di proteina (s) per studi strutturali, e come preparare e caratterizzare campioni di proteine ​​prima di tentativi di cristallizzazione. Ci concentriamo la nostra analisi su due proteine ​​contenenti domini di grandi dimensioni avvolto a spirale, Shroom (SHRM) e Rho-chinasi (Rock). Queste proteine sono stati scelti come entrambi contengono domini coiled-coil e sono noti per formare un complesso biologicamente rilevante 11-16. Shroom e Rho-chinasi (Rock) sono previsti per contenere rispettivamente ~ 200 e 680 residui di avvolto a spirale, molte parti della quale sono state caratterizzate strutturalmente 17-20. Il metodo qui descritto fornisce un flusso di lavoro per identificare rapidamente frammenti di coiled-coil contenenti proteine ​​che saranno suscettibili per la cristallizzazione, tuttavia, le tecniche descritte possono essere facilmente adattati per la maggior parte della proteina o proteina complessi o modificati per incorporare high-throughput avvicinamenches come disponibili. Infine, questi metodi sono generalmente poco costosi e possono essere eseguite dagli utenti a quasi tutti i livelli di esperienza.

<table><tbody><tr><td>BL21(DE3) Rosetta</td><td>Emd Millipore</td><td>70954-3</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Star</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C601003</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3) Codon Plus</td><td>Agilent Technologies</td><td>230245</td><td></td></tr><tr><td>Spettro del lisozima</td><td>Chemical Mfg Corp</td><td>L3008-5GM</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA resina</td><td>Life Technologies</td><td>25216</td><td></td></tr><tr><td>SubtilisinA</td><td>Spectrum Chemical Mfg Corp</td><td>S1211-10ML</td><td></td></tr><tr><td>24 pozzetti Cryschem Plate</td><td>Hampton research</td><td>HR3-160</td><td></td></tr><tr><td>INTELLI-PLATE &nbsp; 96:</td><td>Art Robbins Instruments</td><td>102-0001-03</td><td></td></tr><tr><td>PEG 3350</td><td>Hampton research</td><td>HR2-591</td><td></td></tr><tr><td>PEG 8000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-515</td><td></td></tr><tr><td>PEG 400</td><td>Hampton research</td><td>HR2-603</td><td></td></tr><tr><td>PEG 4000</td><td>Hampton research</td><td>HR2-605</td><td></td></tr><tr><td>pcDNA3.1-Clover-mRuby2</td><td>Addgene</td><td>49089</td><td></td></tr><tr><td>Sistema di autoinduzione espresso notturno 1</td><td>Emd Millipore</td><td>71300</td><td></td></tr><tr><td>Brodo di lisogenesi in polvere</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>12795027&nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

la combinazione di wet and dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

Combining Wet and Dry Lab Techniques to Guide the Crystallization of Large Coiled-coil Containing Proteins

Ottenere cristalli per la determinazione della struttura può essere una proposta difficile e dispendiosa in termini di tempo per qualsiasi proteina. Le proteine e i domini a spirale si trovano in tutta la natura, tuttavia, a causa delle loro proprietà fisiche e della tendenza ad aggregarsi, sono tradizionalmente considerati particolarmente difficili da cristallizzare. Qui, utilizziamo una varietà di tecniche rapide e semplici progettate per identificare una serie di possibili confini di dominio per una data proteina a spirale, e quindi caratterizzare rapidamente il comportamento di queste proteine in soluzione. Con l'aggiunta di un tag fortemente fluorescente (mRuby2), la caratterizzazione delle proteine è semplice e diretta. La proteina bersaglio può essere facilmente visualizzata in condizioni di illuminazione normale e può essere quantificata con l'uso di un imager appropriato. L'obiettivo è identificare rapidamente i candidati che possono essere rimossi dalla pipeline di cristallizzazione perché è improbabile che abbiano successo, concedendo più tempo ai migliori candidati e meno fondi spesi per le proteine che non producono cristalli. Questo processo può essere iterato per incorporare le informazioni ottenute dagli sforzi iniziali di screening, può essere adattato per procedure di espressione e purificazione ad alto rendimento ed è potenziato dallo screening robotico per la cristallizzazione.

Un diagramma raffigurante il workflow utilizzato in questo sistema è mostrato in figura 1 e comprende tre fasi principali. analisi computazionale della sequenza è utilizzato per sviluppare ipotesi circa i confini dominio della proteina coiled-coil di interesse. Un esempio di analisi annotata del dominio Shrm2 SD2 è mostrato in Figura 2. In questo schema, l'obiettivo era quello di individuare possibili confini del dominio per un dominio conservato presso ...

Descriviamo un framework che incorpora un'analisi biochimica e computazionale diretta per guidare la caratterizzazione e la cristallizzazione di grandi domini coiled-coil. Questo framework può essere adattato per le proteine globulari o esteso per incorporare una varietà di tecniche ad alto rendimento.

La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

Obtaining crystals for structure determination can be a difficult and time consuming proposition for any protein. Coiled-coil proteins and domains are ...

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare e testare rapidamente i possibili confini di dominio all'interno di grandi proteine a spirale per migliorare la probabilità di trovare un frammento intrinseco che cristallizzerà. Questo metodo può aiutare i ricercatori a semplificare il processo di cristallizzazione per le grandi proteine a spirale, che possono essere notoriamente difficili da cristallizzare. Il vantaggio di questa tecnica è che integra metodi sperimentali e computazionali per identificare e selezionare rapidamente i probabili candidati alla cristallizzazione, migliorando così le loro possibilità di successo.A dimostrare questa tecnica saranno Jenna Zalewski, una studentessa laureata nel mio laboratorio, e Keith O'Conor, un ricercatore universitario nel mio laboratorio. Per iniziare, combina l'output di strumenti basati sul Web consolidati per generare previsioni dei possibili confini del dominio a spirale come descritto nel protocollo di testo. Dopo aver generato i plasmidi di espressione e testato i loro livelli di espressione come descritto nel testo, iniziare la purificazione di ogni ceppo che ha espresso con successo la proteina marcata con Ruby.Per lisare le cellule, prima risospendere ogni pellet cellulare scongelato in 1,5 millilitri di tampone di lisi che è stato integrato con inibitori della proteasi. Aggiungere 30 microlitri di lisozima a una concentrazione di 10 milligrammi per millilitro e incubare a temperatura ambiente per 20 minuti, quindi sonicare, seguendo le istruzioni per lo strumento in uso. Centrifugare il campione in una centrifuga da tavolo per 30 minuti a 14.000 volte G in materiale insolubile in pellet o celle non lassizzate.Conservare sia il surnatante che il pellet per la successiva analisi tramite SDS-PAGE. Per eseguire la purificazione dell'affinità del nichel, incubare prima 100 microlitri di perle di nichel NTA, prelavate in tampone di lisi con il lisato solubile per cinque-10 minuti. Capovolgere la sospensione più volte per mescolare le perline.Centrifugare il campione a 800 volte G per 30 secondi in una centrifuga da tavolo per pellettare le perle. Successivamente lavando il pellet da tre a cinque volte con un tampone di lisi per eliminare i contaminanti non specifici. Infine, eluire la proteina di fusione Ruby dalle perle con tampone di lisi, integrato con un molare imidazolo.Utilizzare uno spettrofotometro impostato a 280 nanometri per misurare la concentrazione della proteina di fusione Ruby, quindi valutare l'omogeneità del campione caricando da uno a cinque microgrammi di proteina di fusione su un gel PAGE nativo. Far funzionare il gel PAGE nativo al 10% a quattro gradi Celsius per 140 minuti a 175 volt. Immagine della PAGE nativa utilizzando un imager attrezzato per visualizzare la fluorescenza, osservando dove migra la fusione con tag Ruby in questo saggio.Eseguire una proteolisi limitata per identificare domini ripiegati in modo stabile incubando prima 95 microlitri di fusione Ruby-Shroom SD2 con cinque microlitri di 0,025 Subtilisin A.Campionare la reazione in punti temporali di zero, 0,5, due, cinque, 15, 60 e 120 minuti, rimuovendo 10 microlitri dalla reazione per ogni punto temporale e visualizzando l'andamento della reazione tramite SDS-PAGE utilizzando un gel di acrilammide al 15%. Colora il gel con il blu di Coomassie per valutare se è possibile identificare una specie resistente alla proteasi. Integrare i dati dell'efficienza di purificazione, del comportamento in PAGE nativo e della proteolisi limitata sulle proteine di fusione mRuby2-Shroom parzialmente purificate in una valutazione completa del comportamento complessivo di queste proteine in soluzione.Eseguire espressioni su larga scala con colture da due litri di mRuby2-Shroom SD2 con l'obiettivo di ottenere da cinque a 20 milligrammi di campione completamente purificato. Dopo la crescita cellulare, pellettare le cellule mediante centrifugazione a 8.000 volte G per 10 minuti. Il pellet di cella risultante può essere conservato a meno 80 gradi Celsius fino al momento del bisogno.Quindi, risospendere il pellet in circa otto millilitri di tampone di lisi per grammo di pellet di cella congelata. Lisi le cellule risospese utilizzando un omogeneizzatore. Dopo la lisi cellulare, pellettare i detriti cellulari mediante centrifugazione a 30.000 volte G per 30 minuti.Successivamente, legare in batch la frazione solubile utilizzando 10 millilitri di resina di nichel NTA prelavata. Versare la sospensione di perle in un'appropriata colonna a gravità e lasciare defluire le proteine non legate, quindi lavare la resina da tre a cinque volte con 40 millilitri di tampone di lisi, seguito da un lavaggio con tampone di lisi integrato con un molare di cloruro di sodio. Eseguire un lavaggio finale della resina con 40 millilitri di tampone di lisi integrato con 80 millimolari di imidazolo.Eluire la proteina di fusione Rubino-Fungo con 40 millilitri di tampone di lisi contenente un molare di imidazolo. Frazionare manualmente la proteina eluita in frazioni da quattro a 10 millilitri. Confermare le frazioni contenenti la proteina di fusione Ruby-Shroom utilizzando un gel SDS-PAGE al 10%.Aggiungere un milligrammo di proteasi TEV per ogni 25-50 milligrammi di proteina di fusione per rimuovere l'etichetta Ruby. Successivamente, dializzare le frazioni appropriate nel tampone di scissione TEV utilizzando un tubo per dialisi con cutoff molecolare da sei a otto kilodalton. Dializzare le proteine per una notte a temperatura ambiente mescolando lentamente.Dopo la dialisi, ripetere i passaggi di purificazione per affinità con il nichel. Il dominio Shroom-SD2 dovrebbe fluire attraverso la frazione non legata, mentre il tag Ruby rimane legato alla resina. Utilizzando un concentratore di centrifuga, concentrare le frazioni di picco a circa 10 milligrammi per millilitro, quindi eseguire la cromatografia ad esclusione dimensionale analizzando le frazioni di picco tramite un gel SDS-PAGE al 12%.Dopo aver raggruppato le frazioni di picco, dializzare la soluzione in tampone di cristallizzazione, quindi concentrare la proteina dializzata a 10 milligrammi per millilitro prima della cristallizzazione. Screening di una piccola serie di 12 condizioni per identificare una concentrazione proteica ottimale per le prove di cristallizzazione utilizzando vassoi di cristallizzazione a goccia da 24 pozzetti. Eseguire prove di cristallizzazione utilizzando il metodo della diffusione del vapore.Per prima cosa, pipettare 500 microlitri di ciascuna delle 12 condizioni in pozzetti separati. Su ogni piedistallo, fare delle gocce che contengano un microlitro di soluzione a pozzetti e un microlitro di campione proteico. Sigillare rapidamente il vassoio con nastro trasparente, quindi spostarlo in un ambiente adatto a temperatura controllata e privo di vibrazioni.Esamina le gocce nei vassoi nei prossimi tre giorni utilizzando un microscopio con un ingrandimento fino a 100X. Alla fine del periodo di tre giorni, segnare ogni goccia come priva di precipitazioni, precipitazioni leggere, precipitazioni abbondanti o cristalli. Una concentrazione proteica adeguata non dovrebbe contenere più di sei precipitazioni abbondanti.Utilizzando la concentrazione proteica determinata, è possibile eseguire lo screening di un'ampia gamma di schermi di cristallizzazione disponibili in commercio. L'uso di un robot per la manipolazione dei liquidi o la cristallizzazione velocizza notevolmente questo processo, riducendo al minimo l'errore nelle gocce. Richiede molte meno proteine, consentendo all'utente di esaminare più condizioni con un singolo campione.Migliorare le condizioni iniziali identificate dagli schermi larghi variando sistematicamente ciascuna delle variabili all'interno della goccia di cristallizzazione utilizzando vassoi di vagliatura a 24 pozzetti, come in precedenza. La proteolisi limitata viene utilizzata per identificare le regioni della proteina che potrebbero essere flessibili o comunque più accessibili alla proteasi. Di seguito è mostrato un modello di degradazione per un dominio SD2 che è proteoliticamente sensibile e un altro che è abbastanza stabile.Una proteolisi limitata è stata eseguita nel contesto delle proteine di fusione Ruby. In questo caso, la sequenza linker tra Ruby e il dominio SD2 è stata rapidamente scissa, come previsto, ma i frammenti di Ruby e SD2 risultanti sono rimasti sostanzialmente stabili. L'analisi da parte di PAGE nativo può rivelare rapidamente buoni candidati per la cristallizzazione.Quattro complessi Shroom-Rock con diverse batterie proteiche sono stati eseguiti su gel nativi di PAGE. Il complesso contenente le rocce da 834 a 913 ha avuto il miglior comportamento e si è cristallizzato prontamente, mentre gli altri si sono cristallizzati solo al momento della degradazione o non sono riusciti a cristallizzarsi completamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come sviluppare una serie di potenziali confini di dominio per la tua grande proteina a spirale e come utilizzare il sistema Ruby per identificare rapidamente e rapidamente i migliori candidati per la cristallizzazione.Sebbene la cristallografia rimanga un'attività che richiede molto tempo, l'utilizzo di questa tecnica concentrerà la ricerca di proteine che cristallizzeranno utilizzando saggi semplici per rimuovere i candidati scadenti, consentendoti di dedicare più tempo ai candidati con migliori prospettive di successo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di includere quante più informazioni possibili quando si selezionano i possibili confini del dominio. Le informazioni che scegli di selezionare quando utilizzi questa procedura varieranno per ogni proteina.Se possibile, dovrebbero essere eseguiti altri metodi, come saggi cellulari o biochimici, per garantire che i frammenti proteici in questione contengano ancora la funzione di interesse biologico. Sebbene questo metodo sia focalizzato sulle proteine coiled-coil, il quadro generale potrebbe essere facilmente adattato per quasi tutte le proteine. Non dimenticare che lavorare con determinati strumenti e reagenti biologici può essere pericoloso e che quando si esegue questa procedura è necessario seguire sempre precauzioni, come l'uso di guanti o l'uso di occhiali protettivi.

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La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine (Video) | JoVE Journal

La combinazione di Wet and Dry tecniche di laboratorio per guidare la cristallizzazione di grandi dimensioni avvolto a spirale contenenti proteine

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