Utilizzando canali lineari Agarose per studiare Drosophila Comportamento larvale Crawling

L'obiettivo generale di questa procedura è osservare lo stadio larvale di Drosophila strisciare in un canale di agarosio lineare per studiare lo sviluppo dei circuiti neurali. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della neuroetologia e della biologia dello sviluppo, come la comprensione dei codici neurali che generano modelli motori e l'identificazione dei processi genetici e cellulari chiave che utilizzano i circuiti neuronali per il controllo del movimento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che restringe il repertorio del comportamento larvale in modo che i ricercatori possano studiare in dettaglio un singolo modello multiplo.

A dimostrare la procedura sarà Zarion Marshall, un tecnico del mio laboratorio. Innanzitutto, è importante valutare la salute della larva. Tre o quattro giorni prima della registrazione, sostituire la piastra di raccolta della gabbia per adulti.

Procedi a farlo ogni giorno e alla stessa ora del giorno. Conta le uova e le larve appena schiuse sul piatto. Il numero previsto di uova è compreso tra 500 e 2.000.

Regola il numero di adulti nella gabbia secondo necessità. Esaminiamo la piastra 24 ore dopo per determinare se le larve sono sane. La maggior parte delle uova dovrebbe essersi schiusa in larve e le larve dovrebbero essersi insinuate nella pasta di lievito.

I segni di cattiva salute includono un gran numero di uova non schiuse, corpi larvali morti lontani dalla pasta di lievito e larve con macchie insolitamente scure nell'addome che è un indicatore di una reazione immunitaria. Se le larve sembrano malsane, cambiare la gabbia utilizzando piastre appena preparate e controllare il genotipo degli adulti. Per l'esperimento raccogliere larve di secondo stadio appena schiuse da piastre di uno o due giorni.

Tutte queste fasi possono essere utilizzate nell'analisi. Per questo protocollo, disporre di uno stampo di colata PDMS a canale lineare. Pulire lo stampo di colata con alcol isopropilico.

Una volta asciugato, riponete lo stampo in un coperchio di dieci centimetri o in un contenitore simile. Quindi riempire lo stampo con il tre percento di agarosio raffreddato a 55 gradi Celsius. Versare l'agarosio con cura per evitare di intrappolare bolle d'aria nello stampo.

Lo stampo deve essere appena coperto dall'agarosio. Una volta solidificati, rimuovere i canali di agarosio dallo stampo. Tagliare i bordi dei canali a forma di disco, quindi immergere i canali in acqua.

Possono essere conservati in acqua a quattro gradi Celsius per un massimo di sette giorni. Prima di utilizzare i canali, lasciarli riscaldare a temperatura ambiente. Seleziona un canale che corrisponda alla larghezza della larva.

I canali vanno da 100 a 300 micron di larghezza e sono tutti profondi 150 micron. Quindi utilizzare una lama di rasoio pulita per tagliare un singolo canale dal disco preparato. Con una pinza, trasferire il canale su un vetrino di vetro di dimensioni adeguate o su uno scivolo con il lato scanalato rivolto verso l'alto.

Quindi, usa una pinza fine per raccogliere delicatamente una larva senza schiacciarla. Anche un pennello a punta fine funziona bene. Se schiacciata, i riflessi del dolore come rotolare o curvarsi possono dominare il comportamento della larva nel canale.

Ora lava la larva immergendola brevemente in acqua, quindi posizionala nel canale tagliato stuzzicandola delicatamente in posizione. Una volta nel canale, regola l'orientamento della larva per rendere la struttura di interesse facile da fotografare. Quindi posizionare una o due gocce d'acqua alle due estremità del canale per riempire il canale con acqua.

Se rimangono intrappolate bolle d'aria, sollevare delicatamente i lati del canale per rimuoverle. Per regolare ulteriormente l'orientamento della larva, spingere delicatamente il canale per far rotolare la larva. La larva è ora pronta per essere fotografata.

Le larve nei canali lineari eseguono attacchi prolungati di strisciamento ritmico. Le sonde fluorescenti sono facilmente esaminabili. Ad esempio, le larve che esprimono GFP nei loro neuroni dal driver GAL4 mostrano cambiamenti dinamici nelle intensità fluorescenti emanate dal cordone nervoso durante il ciclo di scansione.

Il SNC si muove in avanti quasi contemporaneamente alla testa e alla coda larvali, quando un'onda di contrazione muscolare passa lungo l'asse del corpo, il SNC si muove dentro e fuori dal piano di messa a fuoco, causando il cambiamento della fluorescenza del cordone nervoso. I cambiamenti nella fluorescenza sono stati quantificati da tre passi di strisciamento per tre larve. La dinamica della fluorescenza del cordone nervoso durante il ciclo di falcata ha seguito uno schema riproducibile che potrebbe essere utilizzato per la fenotipizzazione.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una comprensione di come raccogliere le larve per il comportamento, preparare i canali dell'agarosio e caricare le larve nei canali per visualizzare il comportamento strisciante lineare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di maneggiare le larve con delicatezza.