Progettazione e Realizzazione di un Illuminating automatizzato, Coltura, e di campionamento per microbica optogenetic Applicazioni

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di assemblare un recipiente di coltura continuo, in cui la risposta all'illuminazione dei microbi optogenetici può essere misurata con un microscopio automaticamente in tempo reale e per più giorni. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nella biologia cellulare e nell'ingegneria metabolica, come ad esempio il modo in cui l'espressione genica dinamica può suscitare risposte che differiscono dall'espressione genica statica. Il vantaggio principale di questo metodo è che la coltura continua consente di raccogliere le misurazioni per più giorni.

Per iniziare, saldare la linea di terra, la linea dati e la linea di tensione positiva del termometro digitale al circuito stampato. Tagliare un pin da un'intestazione femmina a tre pin e tagliare i due pin rimanenti. Saldare questo nella coppia di fori etichettati R2 e collegare i due pin saldati inserendo un resistore da 4,7 kiloohm nell'intestazione del pin.

Quindi collegare i componenti rimanenti al circuito stampato. Sovrapporre il circuito stampato al microcontrollore. Configurare l'involucro a prova di luce e installare tutto il software come descritto nel protocollo di testo allegato.

Innanzitutto, posiziona l'estremità lunga della porta in alluminio attraverso la guarnizione nel recipiente di coltura e avvita il tappo. Coprire un'uscita corta della porta in alluminio con un tubo in silicone di medio diametro. Collegare l'estremità del distillatore inserendo un luer lock femmina, quindi collegando un luer lock maschio plug

Questa presa è supplementare e non verrà utilizzata. Collegare due segmenti corti di tubo in silicone di medio diametro con luer lock maschio e femmina. Quindi collegare un'estremità a una presa corta in alluminio e collegare l'estremità del distillatore.

Il recipiente verrà inoculato attraverso questo tubo. Quindi, collegare due tubi medi alle estremità del tubo peristaltico di medio diametro e dei connettori. Collegare un'estremità a una porta corta in alluminio e collegare l'altra.

Successivamente, questo verrà collegato al pallone multimediale. Collegare un tubo in silicone di medio diametro alla porta in alluminio più lunga. Il tubo deve essere sufficientemente lungo da raggiungere il pallone del supporto.

Collegare un altro segmento corto lungo alcuni centimetri fino all'estremità, quindi inserirlo nel tappo di gomma sul pallone dei supporti. Clamp il tubo. Una volta successivamente sbloccata, questa connessione consente di miscelare, aerare e mantenere la coltura a una pressione positiva dalle bolle in entrata.

Inserire un tubo di medio diametro abbastanza lungo da raggiungere il fondo del pallone nel tappo attraverso il quale verrà trasferito il fluido. Collegare un altro tubo di medio diametro a questo, quindi un tubo di diametro largo all'estremità. Collegare l'estremità del distillatore.

Riempire il terzo foro del tappo con un segmento corto di tubo di medio diametro, collegato ad altri due segmenti di tubo di medio diametro e tappato all'estremità del distillatore. Questo sarà collegato a una pompa a vuoto e successivamente a una pompa dell'acquario. Inserire un luer lock maschio in un segmento di tubo in silicone di diametro stretto, quindi inserire saldamente il tubo in PTFE.

Quindi collegare un luer lock femmina a un tubo di medio diametro. Infilare il blocco femmina lungo il tubo in PTFE per collegare i blocchi e l'altro a una porta corta in alluminio. Assicurarsi che il tubo in PTFE all'interno del recipiente di coltura penzoli sotto il secondo tubo di alluminio più lungo e sopra il fondo.

Tagliare secondo necessità. I terreni verranno campionati da qui al canale di imaging e il tubo stretto riduce al minimo il volume intermedio. Quindi, collegare il tubo stretto in silicone esposto al tubo peristaltico stretto e ai connettori.

A questo collegare tre segmenti di tubo di diametro stretto e due segmenti di tubo in PTFE, alternandoli. Collegarlo al pallone dell'effluente, tramite un tubo di medio diametro. Quindi collegare un'estremità di un tubo in silicone di medio diametro al secondo tubo più lungo della porta in alluminio nell'altra estremità del pallone dell'effluente.

Questo tubo di alluminio imposta il volume della coltura e la coltura in eccesso trabocca nel contenitore dell'effluente. Avvolgere i coperchi del pallone con un foglio di alluminio, quindi sterilizzare in autoclave l'assemblaggio per 30 minuti a 121 gradi Celsius e 15 PSI. Collegare il filtro sottovuoto a una bottiglia da 100 millilitri.

Rimuovere il coperchio del capezzolo, quindi rimuovere il tappo bianco dal capezzolo del filtro del vuoto con una pinzetta sterile. Collegare l'ampio tubo in silicone al capezzolo, l'altro tubo libero del pallone a una pompa per vuoto e assicurarsi che il terzo tubo che collega il pallone al recipiente di coltura sia bloccato. Riempire il filtro con il fluido, accendere la pompa del vuoto, quindi filtrare il resto del supporto.

Clamp il tubo in silicone del fluido collegato al vuoto e spegnere la pompa del vuoto. Rimuovere i luer dal segmento intermedio del tubo in silicone del fluido collegato alla pompa del vuoto e inserire l'estremità blu di un filtro dell'aria sterile per siringa in questo tubo. Quindi bloccare l'ampio tubo in silicone e scollegare il luer maschio da esso.

Scollegare la spina dal luer femmina del tubo di ingresso del fluido del recipiente di coltura. Collegare questi luer per consentire il pompaggio dei fluidi nel recipiente di coltura. Quindi, rimuovere il filtro dalla bottiglia da 100 millilitri e collegare il tappo della bottiglia.

Utilizzare questo supporto per preparare una coltura iniziale. Posizionare il gruppo di coltura continua vicino a un microscopio con il pallone del terreno più alto del recipiente di coltura e il pallone dell'effluente più basso del recipiente di coltura per evitare il riflusso. Fissare saldamente i tappi di gomma sui supporti e sui palloni degli effluenti.

Quindi, scollegare le estremità del tubo in PTFE dallo stretto tubo in silicone che le collega e collegare queste estremità all'ingresso e all'uscita di un dispositivo microfluidico preparato. Quindi spingere il terreno nel recipiente di coltura, collegando l'estremità bianca del filtro dell'aria della siringa alla pompa dell'acquario. Quando il fluido raggiunge il livello della porta dell'effluente, avvolgere il tubo di ingresso del fluido e i connettori attorno alla pompa peristaltica lenta e lo stretto tubo di uscita del campione e i connettori attorno alla pompa peristaltica veloce.

Aerare il terreno sbloccando il tubo dell'aria tra il pallone e il recipiente di coltura. Quindi, fissare il termoforo e il termometro al recipiente di coltura in modo che la temperatura possa essere controllata. Avvolgere il tubo del substrato attorno al recipiente di coltura, in modo che il substrato in entrata sia alla stessa temperatura del recipiente.

Quindi inserire il recipiente di coltura nell'involucro di schiuma nera sopra la matrice LED e assicurarsi che i tubi non vengano schiacciati. Utilizzare il plug-in del controller del bioreattore per impostare la pompa del fluido lento per un decimo di ogni intervallo di 30 secondi. La portata sarà molto bassa, ma maggiore della velocità di evaporazione.

Clamp il tubo dell'aria in ingresso tra il pallone e il recipiente di coltura. Utilizzare una pipetta per inoculare il recipiente di coltura con un millilitro da una coltura starter. Quindi clamp l'estremità del distillatore di questo tubo e sganciare il tubo dell'aria.

Lascia che la cultura cresca da un giorno all'altro. Coprire l'involucro in modo che non entri luce. Il giorno successivo, utilizzare il plug-in del controller del bioreattore per impostare le pompe peristaltiche in modo che ruotino per una percentuale maggiore di tempo, corrispondente ai fluidi desiderati e alle portate di campionamento.

Lascia che la densità di coltura si equilibri durante la notte. Il giorno successivo riempi l'elenco delle posizioni di stadio e il micro manager con una serie di posizioni non sovrapposte in cui le cellule pompate nel canale microfluidico saranno sul piano focale. Quindi apri il plug-in del controller del bioreattore.

Selezionare l'andamento temporale della matrice LED desiderata, i canali di imaging e altre impostazioni sperimentali dai prompt, quindi iniziare a raccogliere i dati. Questo apparato è stato utilizzato per stimolare una coltura di saccharomyces cerevisiae, che esprime la proteina fluorescente gialla in risposta alla luce blu attraverso un sistema di trascrizione optogenetica inducibile. Sono state acquisite immagini di contrasto di base e fluorescenti del canale microfluidico.

I contorni delle cellule sono stati identificati dalle immagini a contrasto di fase, mappati sulle immagini fluorescenti e le immagini fluorescenti sono state registrate in tempo reale. La mappa di calore mostra la distribuzione della fluorescenza di una coltura dovuta alla produzione di proteine fluorescenti gialle dopo l'attivazione del sistema optogenetico. La fluorescenza di circa 170.000 cellule è stata analizzata da oltre 30.000 immagini, acquisite da 28 posizioni di stadio in 70 ore.

Durante questo studio, la coltura è stata esposta a varie intensità di luce blu per intervalli di sei ore, seguiti da sei ore di completa oscurità. Le cellule erano state esposte alla luce prima della prima misurazione, motivo per cui l'intensità della fluorescenza diminuisce durante il primo periodo di buio. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in otto ore, nel corso di tre giorni, se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di questa procedura, è molto importante utilizzare la tecnica sterile. Seguendo questa procedura, altri metodi, come il controllo del feedback in tempo reale, possono essere utilizzati per controllare la concentrazione delle proteine. Questa tecnica consentirà di studiare dinamicamente gli organismi con costrutti optogenetici, per periodi di tempo più lunghi, più a lungo di quanto sia possibile utilizzando piastre o colture batch.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come integrare un apparato di coltura continua, una luce e un microscopio, per stimolare e studiare i microbi optogenetici.