Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

L'obiettivo generale di questo test di micro-neutralizzazione è quello di caratterizzare tutti i tipi di virus influenzali attualmente circolanti e l'attività degli anticorpi e le misurazioni antivirali in modo quantitativo, ad alto rendimento e altamente sensibile. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della virologia, come la caratterizzazione antigenica dei virus influenzali, la neutralizzazione quantitativa degli anticorpi e le attività antivirali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che caratterizza l'intera popolazione cellulare infetta, comprese le placche visibili e invisibili e le infezioni a singola cellula.

Il test di micro-neutralizzazione sarà dimostrato dal Dr.Yipu Lin, vicedirettore del Centro di collaborazione dell'OMS per l'influenza a Londra. Il livello di biosicurezza, o BSL, per il seguente protocollo è BSL 2 per i virus dell'influenza stagionale e BSL 3+ per i potenziali virus dell'influenza pandemica. Per iniziare, aliquotare un numero sufficiente di cellule in piastre a 96 pozzetti.

Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e al 5% di CO2 per due o tre giorni per raggiungere la confluenza. Utilizzando il 70% di etanolo, sterilizzare una lavatrice per piastre a più pozzetti e utilizzare PBS o VGM per risciacquarla. Quindi, utilizzare 200 microlitri di terreno di coltura virale, o VGM, per lavare le cellule confluenti.

Aspirare il VGM dalle celle e aggiungere immediatamente 50 microlitri di VGM a ciascun pozzetto. Quindi, aggiungere 900 microlitri di VGM a ciascuna delle sei provette sterili. Quindi, pipettare 100 microlitri di virus nella prima provetta e mescolare bene.

Preparare diluizioni seriali del virus iniziando con la prima provetta, cambiando i puntali tra una diluizione e l'altra. Aggiungere 50 microlitri di ciascuna diluizione del virus iniziando con la diluizione più alta per duplicare i pozzetti di una piastra a 96 pozzetti. Quindi, posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per due o tre ore per consentire al virus di infettare le cellule.

Dopo aver preparato la sovrapposizione secondo il protocollo di testo, rimuovere l'inoculo dai pozzetti. Quindi, aggiungi 200 microlitri di rivestimento a ciascun pozzetto e incuba a 37 gradi Celsius per una notte indisturbato. Aggiungere 200 microlitri di PFA ghiacciato al 4% in PBS A ai pozzetti e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti o a temperatura ambiente per 20 minuti.

Dopo l'incubazione, aspirare il PFA e utilizzare 200 microlitri per pozzetto di PBS A per lavare la piastra due volte. Aggiungere 100 microlitri di tampone di permeabilizzazione alla piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Quindi, usa PBS A per lavare la piastra due volte.

Successivamente, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di un anticorpo monoclonale di topo contro l'influenza di tipo A ai pozzetti e incubare a temperatura ambiente agitando per un'ora. Dopo l'incubazione, utilizzare 300 microlitri di tampone di lavaggio per lavare il pozzetto tre volte. Quindi, aggiungere 50 microlitri di un anticorpo secondario di capra coniugato HRP ai campioni e incubare a temperatura ambiente per un'ora.

Dopo aver lavato i pozzetti tre volte come prima, aggiungere 50 microlitri di substrato per pozzetto e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti o fino a quando lo sviluppo di un colore blu è chiaramente visibile. Per fermare la reazione, utilizzare 200 microlitri di acqua distillata per lavare due volte i pozzetti. Quindi, dopo aver asciugato la piastra all'aria, conservarla in un luogo buio.

Posizionare una piastra a pozzetti nell'area di scansione di uno scanner piano, utilizzando il limite di posizione a forma di L per garantire una posizione di imaging ottimale e ripetibile. Scansionare la lastra utilizzando le impostazioni mostrate qui. Quindi, eseguire il software di lettura delle piastre a pozzetti per calcolare la concentrazione di virus richiesta facendo clic sul pulsante Carica immagine per caricare un'immagine.

Successivamente, nella scheda della soglia globale, far scorrere la barra rossa nell'istogramma per regolare la soglia di campionamento. Quindi, fai clic sul pulsante di aggiornamento per esaminare l'effetto su un'immagine. A questo punto, selezionare la casella Calcola neutralizzazione/titolazione.

Fare clic sul pulsante Campionamento per quantificare la popolazione di cellule infette, o ICP. Quindi, quando richiesto, fare clic sul pulsante Salva per salvare i risultati del campionamento. Per ottenere i risultati della titolazione, caricare o inserire la mappa di definizione della piastra a pozzetti.

In Titolazione:Popolazione virale ottimale indicare la soglia. Selezionare la scheda Processo di titolazione per calcolare i risultati della titolazione. Quindi, controllare i risultati della titolazione prima di fare clic sul pulsante Salva e chiudi per salvare i risultati.

Fare riferimento al supplemento S1 per istruzioni più dettagliate sul software. Per effettuare la neutralizzazione del virus, preparare il monostrato cellulare con due o tre giorni di anticipo. Quindi, aggiungere 50 microlitri di VGM in ogni pozzetto della piastra.

Utilizzare le colonne 11 e 12 rispettivamente per il controllo dei virus e il controllo delle cellule. Aggiungere aliquote da 50 microlitri di una diluizione su 20 di siero trattato con enzima che distrugge il recettore, o RDE, alla prima riga di colonne da uno a 10. Eseguire due diluizioni seriali trasferendo 50 microlitri dalla fila A alla fila H e scartando 50 microlitri dalla fila H.Quindi, aggiungere 50 microlitri di diluente a ciascun pozzetto della colonna di controllo cellulare.

Aggiungere 50 microlitri di virus in ciascun pozzetto della piastra, ad eccezione della colonna di controllo cellulare. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due o tre ore. Quindi, rimuovi l'inoculo e aggiungi la sovrapposizione a ciascun pozzetto.

Incubare la piastra per una notte a 37 gradi Celsius indisturbata. Quindi, fissa e macchia le piastre come mostrato in precedenza in questo video. Per quantificare la neutralizzazione, posizionare una piastra a pozzetti nell'area di scansione di uno scanner piano, come dimostrato in precedenza in questo video.

Scansiona la piastra ed esegui il software di lettura delle piastre a pozzetti per calcolare i titoli virali richiesti come prima. Dopo aver caricato o inserito la mappa della piastra del pozzetto, in Neutralizzazione:Deduzione infezione indicare la soglia. Quindi, selezionare Processo di neutralizzazione per calcolare i titoli.

Infine, controlla i titoli e fai clic sul pulsante Salva e chiudi per salvare i risultati della neutralizzazione. Di seguito sono riportati i risultati della titolazione di recenti esperimenti di caratterizzazione antigenica di otto virus in ingresso con diluizioni comprese tra 1,0 volte 10 per quello negativo e 1,0 volte 10 per il sei negativo. Il grafico illustra che gli ICP diminuiscono con l'aumento della diluizione del virus.

Le curve sono state normalizzate rispetto agli ICP degli stessi virus che hanno prodotto infezioni in tutte le cellule all'interno di un pozzetto. In questa tabella sono elencate le diluizioni del virus che hanno prodotto il 30% della saturazione dell'ICP che sono state scelte come diluizione del virus in ingresso per la neutralizzazione. Questa figura mostra i risultati di un esperimento di neutralizzazione utilizzando un virus in ingresso contro cinque antisieri.

Il grafico illustra il processo di infezione con l'aumento della diluizione del siero. La popolazione positiva normalizzata sull'asse verticale rappresenta il rapporto tra gli ICP della corrispondente risposta antisieristica e l'ICP medio del virus di riferimento. Infine, i titoli di neutralizzazione sono stati determinati come i reciproci delle diluizioni antisieriche corrispondenti alla riduzione del 50% dell'ICP.

Questo test si concentra sulla coerenza, la velocità e la sensibilità di rilevamento, compresa la titolazione quantitata dei virus in ingresso, l'imaging ad alto rendimento e l'elaborazione dei dati. È conveniente, facile da usare ed è stato utilizzato di routine negli studi antigenici virali.