Name: Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-14T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 9 s
Description: Scopri l'assaggio di micro-neutralizzazione per caratterizzare i virus influenzali circolanti e quantificare l'attività anticorpale. Questo metodo ad alto rendimento utilizza uno scanner flatbed per analisi quantitative sensibili.

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Gli autori ringraziano il Dr. M. Matrosovich per aver fornito le linee cellulari madri MDCK e MDCK-SIAT1 e Roche Pharmaceuticals per aver fornito l'oseltamivir carbossilato. Apprezziamo anche la dottoressa Anne Weston per i preziosi suggerimenti sul manoscritto. Questo studio si è basato sulla preziosa collaborazione dei Centri Nazionali Influenzali dell'OMS e dei CC dell'OMS all'interno del GISRS dell'OMS, che hanno fornito i virus influenzali utilizzati. Questo lavoro è stato finanziato dal Medical Research Council attraverso il Programma U117512723.

NOTA: Il livello di biosicurezza (BSL) per il seguente protocollo è BSL 2 per i virus dell&#39;influenza stagionale e BSL 3+ per i potenziali virus influenzali pandemici. titolazione virale è richiesto in anticipo di un esperimento di neutralizzazione per decidere la concentrazione virale del controllo virale (VC). 1. Virus Titolazione NOTA: A seconda del numero di virus e il numero di duplicati, una piastra ben può essere impostato con i seguenti flessibilità: (1) La diluizione virale può essere disposti sia lungo le righe o colonne (Figura 1). Ogni virus dovrebbe occupare una riga / colonna separata. (2) L&#39;incremento di diluizione virale è flessibile, ma dovrebbe iniziare con la più alta concentrazione virale nell&#39;angolo in alto a sinistra. (3) Non vi è alcun limite al numero di duplicati. NOTA: Madin Darby rene canino (MDCK) e MDCK-SIAT1 cellule (SIAT) sono stati gentilmente forniti dal Dr. M. Matrosovich, Marburg, Germolti 10. cellule SIAT sono cellule MDCK stabilmente trasfettate con il CMP-N-acetylneuraminate umana: gene beta-galattoside α-2,6-sialyltransferase per una maggiore espressione di acido sialico (SA) oligosaccaridi α2-6Gal-terminati. <ol><li> Cellule aliquote sufficienti MDCK o cellule MDCK-SIAT 8 in piastre da 96 pozzetti (200 pl / pozzetto). Incubare le cellule a 37 ° C con 5% di CO 2 per 2 o 3 giorni per raggiungere la confluenza. Propagare le cellule in DMEM supplementato con 10% inattivato al calore siero fetale di vitello (FCS) e antibiotici (100 U / ml di penicillina e 100 ug / ml di streptomicina). Incubare le cellule SIAT a 37 ° C con 5% di CO 2 e 1 mg / ml G418 solfato. NOTA: Il fattore di diluizione dipende esperienza e la linea cellulare utilizzato. Il monostrato cellulare deve essere confluenti (cioè, senza parete cellulare o lo schema visibili cellule MDCK e un layout fitto per le cellule MDCK-SIAT1) al momento dell&#39;inoculazione virus. Esempi di diluizioni basano susubcultura dei flaconi confluenti di cellule MDCK o MDCK-SIAT1 sono riportati nella tabella 1. </li><li> Lavare le cellule 3 volte con 200 ml di terreno di coltura dei virus (VGM) per pozzetto. Sterilizzare la rondella targa alveolare con il 70% EtOH per 30 minuti, e poi sciacquare in sterili PBS (PBS) o VGM prima del lavaggio. </li><li> Aspirare il VGM e subito aggiungere 50 ml di VGM in ogni pozzetto. </li><li> Aggiungere 900 pl di VGM a ciascuno dei 6 tubi sterili (o meno, a seconda del numero di virus di prova e duplicati). Dispensare 100 ml di virus nel primo tubo, mescolare bene, e in serie diluire, cambiando le punte tra ogni diluizione. Ripetere l&#39;operazione per ogni virus da titolare. NOTA: Questo darà diluizioni di virus di 10 -1 a 10 -6. </li><li> Aggiungere 50 ml di ciascuna diluizione virus, partendo dalla diluizione massima (1 x 10 -5 in figura 1), nei pozzetti duplicati (colonne 9 e 10 in figura 1) di un 96-pozzetti. </li><li> Posizionare la piastra a 37 ° C per 2-3 ore per consentire al virus di infettare le cellule. NOTA: A incubazione da 2 a 3 ore è necessario per assicurare che i virus del inoculo hanno abbastanza tempo per raggiungere il monostrato. </li><li> Preparare la sovrapposizione (10 ml / piastra) NOTA: La sovrapposizione è costituito da 5 ml di 2x DMEM, tripsina (2 mg / ml concentrazione finale), 20 ml di 1 mg / ml di borsa, e 5 ml di cascami di cotone di cellulosa (vedere l&#39;elenco dei materiali). </li><li> Rimuovere l&#39;inoculo. </li><li> Aggiungere la sovrapposizione (200 ml per ogni pozzetto). Incubare per una notte a 37 ° C, indisturbato. NOTA: Il germogliamento virus avviene dopo circa 4 ore, quindi è importante che la piastra non è disturbata dopo questo tempo. </li><li> Aspirare la sovrapposizione dai pozzi. </li><li> Aggiungere ghiacciata 4% paraformaldeide in PBS A (200 pl / pozzetto). Metterli a 4 ° C per 30 minuti oa temperatura ambiente per 20 min. NOTA: PBS A è naturale pH PBS con 10 gof NaCl, 0,25 g di KCl, 1.437 g di Na 2 HPO 4, 0,25 g di KH 2 PO 4 e 1 L di acqua distillata (vedere l&#39;elenco dei materiali). NOTA: Paraformaldeide è nocivo se inalato e può provocare ustioni in caso di ingestione. C&#39;è anche una limitata evidenza di effetti cancerogeni, e può causare sensibilizzazione dopo contatto con la pelle. </li><li> Aspirare il paraformaldeide e lavare due volte le piastre con PBS A (200 pl / pozzetto). </li><li> Conservare le piastre in PBS A a 4 ° C per un uso futuro, o continuare con i seguenti passaggi. </li><li> Aggiungere buffer di permeabilizzazione (100 l / pozzetto). Lasciare a temperatura ambiente per 30 min. </li><li> Lavare piatto due volte con PBS A (200 pl / pozzetto). </li><li> Aggiungere 50 ml di il primo anticorpo, Mab topo contro l&#39;influenza di tipo A (1: 1.000 in ELISA buffer), per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora (o 4 ° C durante la notte), con agitazione. </li><li> Lavare 3 volte in 100 ml di tampone di lavaggio (0,05% Tween 80 in PBS A, v / v) pER bene. Incubare a temperatura ambiente per 5 min tra un lavaggio. In alternativa, lavare 3 volte senza incubazione con 300 pl per pozzetto. </li><li> Aggiungere 50 ml di secondo anticorpo, capra anti-topo IgG (H + L) coniugato HRP (1: 1.000 in ELISA Buffer), per pozzetto. Incubare a temperatura ambiente per 1 ora, con agitazione. </li><li> Lavare 3 volte come descritto al punto 1.17. </li><li> Aggiungere il substrato (50 ul / pozzetto). Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti o fino a quando lo sviluppo di un colore blu è chiaramente visibile. </li><li> Per arrestare la reazione, lavare la piastra due volte con 200 ml di acqua distillata per pozzetto, incubare a temperatura ambiente per 2 -3 min tra i lavaggi. </li><li> Asciugare la piastra e conservarla in un luogo buio (ad esempio, avvolgerla in un foglio di alluminio). </li></ol> 2. Titolazione quantificazione <ol><li> Posizionare una piastra bene nella zona di scansione di uno scanner, come mostrato in Figura 2a. Utilizzare il limite di posizione a forma di L pergarantire una posizione ottimale e ripetibile imaging. NOTA: E &#39;possibile immagine di due pozzetti in una sola scansione. </li><li> Scansione di un&#39;immagine. NOTA: Le impostazioni sono riportate in Tabella 2. </li><li> Eseguire il software &quot;Wellplate Reader&quot; per calcolare la concentrazione di virus richiesta (Figura 3). <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Carica immagine&quot; per caricare un&#39;immagine. Far scorrere la barra rossa nella istogramma della scheda &quot;soglia globale&quot; per regolare la soglia di campionamento. Fare clic sul pulsante &quot;Aggiorna&quot; per esaminare l&#39;effetto sull&#39;immagine. </li><li> Barrare la casella &quot;Calcola neutralizzazione / Titolazione&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Sampling&quot; per quantificare la ICP. Fare clic sul pulsante &quot;Salva&quot; per salvare i risultati del campionamento quando richiesto. NOTA: Dopo il processo di campionamento, una nuova finestra chiamata &quot;neutralizzazione e titolazione di calcolo&quot; viene visualizzato automaticamente se la casella &quot;Calcola neutralizzazione / titolazione&quot; sia selezionata. </li><li>Caricare o inserire la definizione della mappa ben piatto. Indicare la soglia (ad esempio, 30%) in &quot;Titolazione: Virus Popolazione Ottimale (%)&quot;. Selezionare la scheda &quot;titolazione di processo&quot; per calcolare i risultati di titolazione. Controllare i risultati della titolazione. Fare clic sul pulsante &quot;Salva e chiudi&quot; per salvare i risultati della titolazione. NOTA: Vedere supplementare S1 per istruzioni più dettagliate sul software. Una copia del software su misura è disponibile su richiesta. NOTA: In genere, il miglior diluizioni di virus per le placche di riduzione Tenore circa 50% (20-85%) ICP di cellule totali all&#39;interno di ogni ben 11. </li></ol></li></ol> 3. neutralizzazione del virus NOTA: Calcolare il numero di piastre necessarie per il saggio di neutralizzazione. Ogni piastra può ospitare un virus e un numero di antisieri. NOTA: A seconda del numero di antisieri e il numero di duplicati, una piastra ben può essere impostato con the seguente flessibilità: (1) La diluizione del siero possono essere disposti lungo riga o una colonna (Figura 4). Ogni siero deve occupare una riga o colonna separata. (2) L&#39;incremento di diluizione del siero è flessibile, ma dovrebbe iniziare con la più alta concentrazione sierica nell&#39;angolo superiore sinistro di una piastra. (3) Il numero di duplicati bilancia il numero di antisieri. Più duplicati possono aiutare a smussare le variazioni sperimentali. (4) Il numero di VC e il numero del controllo cellulare (CC) duplicati sono flessibili, ma devono anche essere in righe o colonne separate. Si prevede che il numero di duplicati VC è significativamente maggiore di quello degli antisieri. <ol><li> Preparare il monostrato cellulare, come nei passaggi 1.1-1.3, 2 o 3 giorni di anticipo. </li><li> Aggiungere 50 ml di VGM a ciascun pozzetto della piastra. </li><li> Utilizzare le colonne 11 e 12 per VC e CC, rispettivamente. Aggiungere 50 ml aliquote di 01:20 enzima recettore-distruzione (RDE) siero -treated alla prima riga (A) di Columns 1-10. NOTA: Per ogni combinazione di virus e siero, il test viene eseguito in duplicato, così uno piastra può, ad esempio, contenere un virus testato contro cinque antisieri. </li><li> Eseguire 2-diluizioni seriali con il trasferimento di 50 ml da Riga A remare H (Colonne 1-10 in figura 4) e scartando 50 ml da Riga H. </li><li> Aggiungere 50 ml di diluente in ciascun pozzetto della colonna CC (colonna 12 in figura 4). </li><li> Aggiungere 50 ml di virus in ciascun pozzetto della piastra, tranne per la colonna CC (Colonne 1-11, righe AH in figura 4). </li><li> Incubare a 37 ° C per 2-3 ore. Rimuovere l&#39;inoculo. Aggiungere la sovrapposizione (200 ml) in ciascun pozzetto. Incubare durante la notte a 37 ° C, indisturbato. Fissare e macchiare le piastre come per la titolazione del virus (passi 1,11-1,22). </li></ol> 4. neutralizzazione Quantificazione <ol><li> Posizionare una piastra bene nella zona di scansione di uno scanner, come mostrato in Figure 2a. Utilizzare il limite di posizione a forma di L per garantire una posizione ottimale e ripetibile imaging. NOTA: E &#39;possibile immagine di due pozzetti in una sola scansione. </li><li> Eseguire la scansione del piatto, come descritto al punto 2.2. </li><li> Eseguire il software &quot;Wellplate Reader&quot; per calcolare i titoli virali richiesti (Figura 3, punto 2.3). <ol><li> Fare clic sul pulsante &quot;Carica immagine&quot; per caricare un&#39;immagine. Far scorrere la barra rossa in &quot;soglia globale&quot; per regolare la soglia di campionamento. Fare clic sul pulsante &quot;Aggiorna&quot; per esaminare l&#39;effetto. </li><li> Barrare la casella &quot;Calcola neutralizzazione / Titolazione&quot;. Fare clic sul pulsante &quot;Sampling&quot; per quantificare la ICP. Fare clic sul pulsante &quot;Salva&quot; per salvare i risultati del campionamento quando richiesto. NOTA: Dopo il processo di campionamento, una nuova finestra chiamata &quot;neutralizzazione e titolazione di calcolo&quot; viene visualizzato automaticamente se la casella &quot;Calcola neutralizzazione / titolazione&quot; sia selezionata. </li><li> Carico o ingresso pozzo-pMappa in ritardo. Indicare la soglia (ad esempio, 50%) in &quot;Neutralizzazione: Infection deduzione (%).&quot; </li><li> Selezionare &quot;processo di neutralizzazione&quot; per calcolare i titoli. Controllare i titoli e fare clic sul pulsante &quot;Salva e chiudi&quot; per salvare i risultati di neutralizzazione. NOTA: neutralizzazione viene riportato come il reciproco della diluizione massima del siero con la riduzione predefinito ICP (ad esempio 50% o 80%) contro il VC (la media di colonna 11 in figura 4). Una riduzione ICP 50% è stato utilizzato negli Risultati rappresentativi. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

In questo studio, abbiamo descritto un test MN di imaging-based per quantificare i veri rapporti tra antigeniche dei virus. Rispetto ad altri saggi placca di riduzione, il metodo sottolinea misurando la ICP di un&#39;intera bene, garantendo la completa copertura della popolazione infettivo. L&#39;indipendenza di formazione della placca allarga anche l&#39;applicazione del test di virus che possono formare piccole placche prevalentemente invisibili o che può gestire solo infezione singola cellula. Pertanto, l&#39;analisi è in grado di esaminare più virus e gli effetti di una più ampia gamma di anticorpi diversi da HI, e aiuta a riflettere in modo più completo le somiglianze antigeniche o differenze tra virus 12. Ad esempio, quando oseltamivir carbossilato è incluso, il saggio MN è meno influenzata da NA-legame dipendente, riflettendo le differenze antigeniche più accurato. Durante lo sviluppo del test, grandi sforzi sono stati fatti per migliorare la consistenza esperimento, velocità e rilevamentosensibilità, anche a controllare i virus di ingresso attraverso la titolazione quantificato, immagini in alta produttività con uno scanner piano, e l&#39;implementazione di una piattaforma di elaborazione dei dati di facile utilizzo. I risultati sono stati generalmente in linea con e confermato quelli di HI. In particolare, i risultati hanno inoltre rivelato differenze antigeniche tra varianti deriva antigenica dei recenti virus di tipo A e di vaccini B, così come i cambiamenti antigenici causati da cambiamenti di cultura-selezionato o sporadici, come ad esempio la sostituzione G155E in HA1 di alcuni (H1N1) virus pdm09 A 12. Il protocollo ha trovato il tipo di virus o sottotipo con la selezione di linee cellulari che hanno dato l&#39;infezione più forte, che ha notevolmente migliorato il segnale di imaging. variazione sperimentale è stata lisciata con la progettazione di duplicati che bilanciato con il numero di antisieri testato. Incertezze possono anche venire dalla qualità delle immagini, che è principalmente influenzata dal dispositivo di imaging. Un colore flatbed scanner decente può significantly migliorare il contrasto dell&#39;immagine e ridurre il rumore. La quantità di virus in ingresso nella neutralizzazione deve essere determinata quantitativamente in anticipo dal corrispondente titolazione mentre i virus ancora mantengono uno stato simile. Durante la neutralizzazione, la risposta antisiero un&#39;infezione è normalizzata contro la differenza tra il virus di riferimento (VC) e il livello di fondo (CC). Misure accurate di VC e CC sono essenziali per un esperimento di neutralizzazione. Più duplicati sono raccomandati (otto duplicati sono stati utilizzati nelle Rappresentante dei risultati). Infine, la comprensione del software è di vitale importanza per il successo di un esperimento. Il software è stato testato per la caratterizzazione del virus di routine nella Influenza Centro OMS, Regno Unito per più di due anni. Istruzioni dettagliate per affrontare varie situazioni è previsto nella S1 supplementare. Questo test MN è adatta per applicazioni in cui i campioni coprono un extremely ampio campo di vista, ma solo richiedono Resolution Imaging moderata. Il basso costo e la configurazione semplice rendono il sistema facilmente disponibile alla maggior parte dei laboratori di virologia. La variazione misurazioni dello stesso campione era inferiore al 3%, che definisce circa l&#39;incertezza introdotta durante la scansione 11. Tale riproducibilità è sufficiente in molti studi virologici e può essere ulteriormente ridotto media immagini da più scansioni. In conclusione, questo studio dimostra un test MN robusto che può essere utilizzato di routine nello studio antigenica e per sostenere i dati HI in analisi dettagliate delle attualmente in circolazione virus influenzali, in particolare per la selezione biennale dei virus per l&#39;inclusione in vaccini antinfluenzali umani.

Micro-neutralizzazione (MN) saggi sono utilizzati in virologia per la determinazione quantitativa di anticorpi neutralizzanti e di attività antivirale. Come alternativa di inibizione emoagglutinazione (HI) saggi, saggi MN in grado di superare gli effetti non antigeniche influenzati dai cambiamenti di affinità di recettoriale in virus influenzali, che possono complicare l&#39;interpretazione dei risultati HI 1,2,3. Fino a poco tempo, la maggior parte dei saggi di MN sono stati basati su effetti citopatico (CPE) o metodica immunoenzimatica (ELISA) 4,5. Saggi MN basate sulla riduzione della messa a fuoco e la placca sono stati sviluppati nel 1990 6,7,8. saggi di riduzione delle placche si basano sul conteggio targhe visibili da quantificare infettività. Tuttavia, conta visive coprono solo grandi placche che sono risolvibile occhi umani, anche se la maggior parte delle placche sono piccole e invisibili per molti virus che circolano correnti. Questa copertura incompleta può causare variazioni significative tra gli esaminatori e tra gli esperimenti, che porta a Irisultati ncomparable. È anche possibile utilizzare il metodo quando alcuni virus mostrano infezione abortiva di singole cellule o molto piccole placche. La risoluzione poveri conteggio può essere migliorata con l&#39;introduzione di un protocollo di imaging basata. Con i progressi della tecnologia, la microscopia ottica e high-throughput lettori ben piastre in grado di fornire i mezzi precisi per contare le cellule infette 9. Sotto un microscopio trans-illuminato, cellule infettate taggati con alcuni marcatori possono essere visualizzati con il loro assorbimento o fluorescenza contrasto con risoluzione sub-cellulare. Un campione può essere quindi analizzato sullo schermo del computer. Sfortunatamente, a causa della limitazione del campo di vista, più di cento immagini affiancate necessari per coprire un singolo pozzo. Analizzando una piastra con 96 pozzetti richiederebbe l&#39;immagine e l&#39;elaborazione di circa diecimila immagini. Tale processo laborioso è lunga e costosa, e la risoluzione acquisita è nei generil inutili per la caratterizzazione di routine delle infezioni virali. Laboratori con un budget limitato possono trovare che l&#39;approccio costruito intorno uno scanner piano prevede un costo-efficacia, high-throughput alternativa. In questo articolo, descriviamo un test MN riduzione delle placche perfezionato che è adatto per la caratterizzazione antigenica di un gran numero di virus e per misurare quantitativamente attività antivirali e anticorpi di neutralizzazione. Il test ha diversi vantaggi: in primo luogo, si tratta di un test di imaging-based che è in grado di misurare infezioni da virus a livello cellulare, indipendentemente dalle dimensioni della placca. Contando la popolazione cellulare infettata totale (ICP) all&#39;interno di un pozzo aumenta notevolmente la sensibilità di rilevamento, rendendo possibile caratterizzare i virus a bassa infettività. In secondo luogo, una titolazione quantitativa più accurata è introdotto prima della neutralizzazione per determinare la quantità di virus in ingresso. Il virus di ingresso quantitativa riduce significativamente il variazione tra i diversi esperimenti e rende i risultati più comparabili tra laboratori. In terzo luogo, titoli di neutralizzazione possono essere determinati direttamente analizzando le immagini, rendendo la quantificazione rapida e user-friendly. Infine, il protocollo prevede un costo-efficacia e high-throughput alternativa con la risoluzione e la precisione richiesta. La quantificazione è basata su uno scanner piano e software di elaborazione dati libera. L&#39;intero setup ha un ingombro ridotto ed è implementabile nella maggior parte dei laboratori. Il protocollo presentato in questo documento si compone di quattro fasi principali, tra cui titolazione del virus, la titolazione quantificazione, neutralizzazione del virus, e la neutralizzazione quantificazione. Virus titolazione è un esperimento preparazione che determina la quantità di virus in ingresso da utilizzare in neutralizzazione. Durante una titolazione, un numero di concentrazioni virali sono applicati ai monostrati di cellule in una piastra da 96 pozzetti. Le cellule infette sono poi quantificati nella sezione 2. La diluizione viralezione che produce il 20% -85% ICP viene a sua volta applicato come virus di ingresso alla neutralizzazione corrispondente sezione 3. I titoli del protocollo di neutralizzazione vengono quantificati utilizzando la sezione 4. Gli esperimenti che hanno seguito i protocolli di cui sopra sono presentati nelle Rappresentante dei risultati. Il test è stato testato a fondo nel corso degli ultimi due anni con la maggior parte degli attuali virus influenzali circolanti, come A (H1N1) pdm09, A (H3N2), e virus B. I risultati della caratterizzazione virus dell&#39;influenza sono stati inclusi nelle relazioni per la riunione di consultazione dell&#39;OMS che ha dato dei consigli su vaccini antinfluenzali per l&#39;uso nel sud del mondo nel 2016 e nell&#39;emisfero settentrionale nel 2016-2017.

<table><tbody><tr><td>VGM</td><td>Sigma</td><td>D6429, P0781</td><td>500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb</td></tr><tr><td>PBS A</td><td></td><td></td><td>Nature pH Soluzione salina tamponata con fosfato: NaCl 10&nbsp; g, KCl 0,25&nbsp; g, Na2HPO4 1.437 g, KH2PO4 0.25 g e Dist. Acqua 1 L.</td></tr><tr><td>Avicell</td><td>FMC</td><td>RC-581F</td><td>2,4 g in 100 ml di acqua distillata sciolta agitando su un agitatore magnetico per 1 ora. Sterilizzare in autoclave.</td></tr><tr><td>2x DMEM</td><td>Gibco&nbsp;</td><td>21935-028</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina</td><td>Sigma</td><td>T1426</td><td></td></tr><tr><td>Overlay (10 ml/piastra):</td><td></td><td></td><td>5 ml 2x DMEM, Tripsina 2&nbsp; &mu; g/ml concentrazione finale, Avicell 5&nbsp; ml</td></tr><tr><td>Triton X- 100e</td><td>Sigma&nbsp;</td><td>T8787</td><td>Tampone di permeabilizzazione: 0,2% in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Tween 80</td><td>Sigma</td><td>P5188</td><td>Wash Buffer: 0,05% Tween 80 in PBS A (v/v)</td></tr><tr><td>Siero di cavallo</td><td>PAA Labs Ltd</td><td>B15-021</td><td>ELISA Buffer: 10% in PBS A (v/v) + 0,1% Tween 80</td></tr><tr><td>MAb di topo contro l'influenza di tipo A</td><td>Biorad</td><td>MCA 400</td><td>1st Anticorpo: 1:1.000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP coniugato</td><td>Biorad</td><td>172-1011</td><td>2nd Anticorpo: 1:1.000 in ELISA Buffer</td></tr><tr><td>True Blu perossidasi</td><td>substrato KPL&nbsp;</td><td>50-78-02</td><td>Substrato: True blue +0,03% H2O2g (1:1.000 di soluzione al 30%)</td></tr><tr><td>Piastre per microtitolazione a fondo piatto a 96 pozzetti</td><td>Costar&nbsp;</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Rondella e collettore per piastre a parete multipla a 8 canali</td><td>Sigma</td><td>M2656</td><td></td></tr><tr><td>Perfection Plate Scanner</td><td>Epson</td><td>V750 Pro</td><td>Il software di imaging può essere scaricato gratuitamente da <a href="http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Downloads">http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&amp; infoType=Downloads</a>.</td></tr><tr><td>Ambiente operativo software: LabVIEW</td><td>National Instruments Corporation</td><td>Window based with NI Vision builder</td><td>Versione: LabVIEW2012 o superiore</td></tr></tbody></table>

ottimizzazione di un quantitative micro-neutralizzazione assay

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

Il test di micro-neutralizzazione (MN) è una tecnica standard per misurare l'infettività del virus dell'influenza e l'inibizione della replicazione del virus. In questo studio, presentiamo il protocollo di un test MN basato sull'imaging per quantificare le vere relazioni antigeniche tra i virus. A differenza dei tipici saggi di riduzione della placca che si basano su placche visibili, questo test quantifica l'intera popolazione cellulare infetta di ciascun pozzetto. Il protocollo abbina il tipo o sottotipo di virus con la selezione delle linee cellulari per ottenere la massima infettività, migliorando il contrasto del campione durante l'imaging e l'elaborazione delle immagini. L'introduzione della titolazione quantitativa definisce la quantità di virus in ingresso per la neutralizzazione e consente di confrontare i risultati di diversi esperimenti. La configurazione dell'imaging con uno scanner piano e un software scaricabile gratuitamente rende l'approccio ad alta produttività, economico, facile da usare e facile da implementare nella maggior parte dei laboratori. Il nostro studio dimostra che il test MN migliorato funziona bene con gli attuali virus circolanti dell'influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2) e B, senza essere significativamente influenzato dalle sostituzioni aminoacidiche nella neuraminidasi (NA) dei virus A(H3N2). È particolarmente utile per la caratterizzazione di virus che crescono fino a un basso titolo di HA e/o subiscono un'infezione abortiva con conseguente incapacità di formare placche nelle cellule in coltura.

Seguendo le procedure di cui sopra, vi presentiamo alcuni risultati di recenti esperimenti caratterizzazione antigenica. La messa a punto di titolazione è stato progettato per esaminare otto virus in ingresso, con doppi duplicati per ogni diluizione. Le diluizioni virali sono stati testati tra 1,0 x 10 -1 e 1,0 x 1,0 -6 per coprire le variazioni tra i virus. I virus di prova erano dal sottotipo H3N2, tra cui A / Camerun / 15V-3538/2015, A / Vladivostok / 36/2015, A / Mosca / 103/2015, A / Tomsk / 5/2015 /, A / Mosca / 101 / 2015, A / Mosca / 100/2015, A / Mosca / 133/2015, e A / Bratislava / 437/2015. I risultati della titolazione sono illustrati nella Figura 5. Figura 5d mostra la diminuzione del PIC con l&#39;aumento della diluizione virus. Le curve sono state normalizzate contro i PIC dello stesso virus che ha dato infezioni in tutte le celle all&#39;interno di un pozzetto 12 (definiti come ICP saturazione). Se la ICP non ha raggiunto la saturazione con l&#39;hiconcentrazione di virus Ghest, la media ICP da duplicati corrispondenti è stato utilizzato invece (A / Mosca / 103/2015 figura 5d). Le diluizioni di virus che hanno prodotto il 30% di saturazione ICP sono stati scelti come la diluizione del virus ingresso per la neutralizzazione (Tabella 3). La neutralizzazione l&#39;obiettivo di avere un ingresso di virus contro cinque antisieri, con doppio duplicati su ogni piatto. Il virus di riferimento indicato è H3N2 A / Stoccolma / 63/2015. I cinque antisieri sono A / HK 4801/14 Egg F12 / 15, A / HK 7295/14 MDCK F02 / 15, A / Sud Africa r2665 / 15 SIAT F50 / 15, A / Swiss 9.715.923 tredicesimi SIAT NIBF F18 / 15, e A / olandese 525/14 SIAT F23 / 15. I risultati di neutralizzazione vengono illustrati nella Figura 6. Figura 6d mostra il progresso dell&#39;infezione con l&#39;aumento della diluizione del siero. Nella frazione normalizzata positiva sull&#39;asse verticale rappresenta il rapporto PIC dalla risposta antisieri corrispondenti contro la media ICPdel virus di riferimento 12. Lo sfondo ICP dai controlli di cellule non infette è stata sottratta durante la normalizzazione. I titoli di neutralizzazione sono stati determinati come reciproci dei diluizione di antisiero corrispondenti alla riduzione ICP% 50 (Tabella 4). L&#39;interpolazione lineare è stato utilizzato per stimare i titoli rientranti tra due diluizioni di siero adiacenti. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig1.jpg" /> Figura 1: Esempio di una configurazione ben piatto in un esperimento di virus titolazione. virus di prova vengono assegnati a righe separate (da A a H). Le colonne sono progettati per diverse diluizioni virali (1 a 12). Due colonne sono stati usati come duplicati per ogni diluizione virale. Barra di scala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Figura 2: Schema di un sistema di scansione del campione. (A) Una piastra a 96 pozzetti sulla posizione di imaging di uno scanner piano (ripubblicato da riferimento 11 con il permesso di Elsevier), e (b) dimensioni del limite di posizione L-forma mostrata in (a). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig3.jpg" /> Figura 3: Schema desktop del software quantificazione &quot;Wellplate Reader&quot;. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> </p&gt; <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig4.jpg" /> Figura 4: Esempio di una configurazione a micropiastre in un esperimento di neutralizzazione. Ogni antisiero è assegnato a due colonne con i duplicati (da 1 a 10). Le righe sono progettati per diverse diluizioni di siero (da A a H). Il controllo del virus prende Colonna 11, con otto duplicati (A11 a H11). Il controllo cella è nella colonna 12, con otto duplicati (A12 a H12). Barra di scala = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig5.jpg" /> Figura 5: risultati di un esperimento di titolazione. (A) Il setup ben piatto, (b) la scansione ben piatto di immagine, (c) Illustrazionedel, quantificato, popolazione di cellule infettate da virus-colore-codificati, e (d) normalizzati popolazioni di cellule infettate da virus contro diluizioni di virus. 30% ICP è stato usato come soglia. Le barre di errore in (d), sono deviazioni standard (SD) delle duplicazioni del campione (± 1 SD). Barre di scala in (b) e (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 6" src="/files/ftp_upload/54897/54897fig6.jpg" /> Figura 6: I risultati di un esperimento di neutralizzazione. (A) Il setup ben piatto, (b) immagine ben piatto, (c) illustrazione della, popolazione di cellule infette da virus quantificato, e (d) normalizzata popolazione cellulare infettato da virus contro la diluizione del siero digitalizzata. Il VI di ingressorus (VC) è A / Stoccolma / 63/2015. 50% ICP stato utilizzato per calcolare i titoli. Le barre di errore in (d), sono deviazioni standard (SD) delle duplicazioni del campione (± 1 SD). Barre di scala in (b) e (c) = 10 mm. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/54897fig6large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> S1 supplementare: <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54897/Supplementary_S1.pdf" target="_blank">Fare clic qui per scaricare questo file.</a> <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="3"> diluizione tipica </td></tr><tr><td></td><td> cellule MDCK </td><td> Cellule MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 giorni </td><td> 1: 5 (1 + 4) </td><td> 1:10 (1 + 9) </td></tr><tr><td> 3 giorni </td&gt; <td> 1:10 (1 + 9) </td><td> 1:20 (1 + 19) </td></tr><tr><td colspan="3"> Numero tipico di cellule per ml </td></tr><tr><td></td><td> cellule MDCK </td><td> Cellule MDCK-SIAT1 </td></tr><tr><td> 2 giorni </td><td> 2 x 10 5 </td><td> 1 x 10 5 </td></tr><tr><td> 3 giorni </td><td> 1 x 10 5 </td><td> 5 x 10 4 </td></tr></tbody></table> Tabella 1: diluizioni tipici di una subcultura di fiaschi confluenti di cellule MDCK o MDCK-SIAT1. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Modalità </td><td> Modo professionale </td></tr><tr><td> tipo di documento </td><td> Film (con Film Guide Turistiche) </td></tr><tr><td> Tipo Esposizione automatica </td><td> Foto </td></tr><tr><td> SonoTipo di età </td><td> 24-bit di colore </td></tr><tr><td> Risoluzione </td><td> 1.200 dpi </td></tr><tr><td> Formato immagine salvata </td><td> TIFF </td></tr></tbody></table> Tabella 2: configurazione tipica di uno scanner piano. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Riga </td><td> Virus </td><td> diluizione raccomandata </td></tr><tr><td> UN </td><td> A / Cameron / 15V-3538/2016 </td><td> 1,0 x 10 -2 </td></tr><tr><td> B </td><td> A / Vladivostok / 36/2015 </td><td> 1,0 x 10 -3 </td></tr><tr><td> C </td><td> A / Mosca / 103/2015 </td><td> 1,1 x 10 -1 </td></tr><tr><td> D </td><td> A / Tomsk / 5/2015 </td><td> 5.9 x 10 -1 </td></tr><tr><td> E </td><td> A / Mosca / 101/2015 </td><td> 8,3 x 10 -1 </td></tr><tr><td> F </td><td> A / Mosca / 100/2015 </td><td> 1,4 x 10 -2 </td></tr><tr><td> sol </td><td> A / Mosca / 133/2015 </td><td> 1,3 x 10 -2 </td></tr><tr><td> H </td><td> A / Bratislava / 437/2015 </td><td> 1,3 x 10 -4 </td></tr></tbody></table> Tabella 3: diluizioni virali calcolati da una popolazione pari al 30% ICP. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Colonna </td><td> Antisera </td><td> titolo consigliato </td></tr><tr><td> 1 - 2 </td><td> A / HK4801 / 2014 </td><td> 110 </td></tr><tr><td> 3 - 4 </td><td> A / HK7295 / 2014 </td><td> 213.3 </td></tr><tr><td&gt; 5 - 6 </td><td> A / Sud Africa / r2665 / 2015 </td><td> 2.155,8 </td></tr><tr><td> 7 - 8 </td><td> A / Svizzera / 9715293/2013 </td><td> 89.4 </td></tr><tr><td> 9 - 10 </td><td> A / Netherlands / 525/2014 </td><td> 78.6 </td></tr></tbody></table> Tabella 4: I titoli a 50% ICP di A / Stoccolma / 63/2015 contro antisieri.

Questo studio descrive un di imaging basata su test di micro-neutralizzazione per analizzare le relazioni antigeniche tra virus. Il protocollo impiega uno scanner piano ed ha quattro fasi, tra cui la titolazione, la titolazione quantificazione, neutralizzazione, e la neutralizzazione quantificazione. Il test funziona bene con corrente circolante pdm09 influenza A (H1N1), A (H3N2), e virus B.

Ottimizzazione di un Quantitative Micro-neutralizzazione Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

L'obiettivo generale di questo saggio di micro-neutralizzazione è caratterizzare tutti i tipi di virus influenzali attualmente in circolazione e l'attività di anticorpi e misurazioni antivirali in modo quantitativo, ad alto rendimento e altamente sensibile. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo della virologia, come la caratterizzazione antigenica dei virus influenzali, la neutralizzazione quantitativa degli anticorpi e le attività antivirali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che permette di caratterizzare l'intera popolazione di cellule infette, inclusi placche visibili e invisibili, nonché infezioni a livello di singola cellula.L'assay di micro-neutralizzazione sarà dimostrato dal dottor Yipu Lin, direttore aggiunto del Centro Collaborativo dell'OMS per l'Influenza di Londra. Il livello di sicurezza biologica, o BSL, per il seguente protocollo è BSL 2 per i virus influenzali stagionali e BSL 3+ per i virus influenzali con potenziale pandemico. Per iniziare, aliquotare un numero sufficiente di cellule in piastre a 96 pozzetti.Incubare le cellule a 37 gradi Celsius e 5%CO2 per due o tre giorni fino al raggiungimento della confluenza. Sterilizzare un lavatore di piastre multipozzetto con etanolo al 70% e risciacquarlo con PBS o mezzo di crescita per virus (VGM). Successivamente, utilizzare 200 microlitri di mezzo di crescita per virus, o VGM, per lavare le cellule confluenti.Aspirare il mezzo di crescita virale dalle cellule e aggiungere immediatamente 50 microlitri di mezzo di crescita virale in ciascun pozzetto. Successivamente, aggiungere 900 microlitri di mezzo di crescita virale in ciascuna delle sei provette sterili. Quindi, pipettare 100 microlitri di virus nella prima provetta e mescolare accuratamente.Preparare diluizioni seriali del virus a partire dal primo tubo, cambiando le punte tra ogni diluizione. Aggiungere 50 microlitri di ciascuna diluizione del virus, iniziando dalla diluizione più alta, in pozzetti duplicati di una piastra a 96 pozzetti. Successivamente, posizionare la piastra a 37 gradi Celsius per due o tre ore per consentire al virus di infettare le cellule.Dopo aver preparato il sovraspalmato seguendo il protocollo descritto nel testo, rimuovere l'inoculo dalle pozzette. Quindi aggiungere 200 microlitri di sovraspalmato in ogni pozzetta e incubare a 37 gradi Celsius durante la notte senza disturbarle. Aggiungere 200 microlitri di PFA al 4% ghiacciato in PBS A nelle pozzette e incubare a quattro gradi Celsius per 30 minuti oppure a temperatura ambiente per 20 minuti.Al termine dell'incubazione, aspirare la PFA e utilizzare 200 microlitri per pozzetto di PBS A per lavare la piastra due volte. Aggiungere 100 microlitri di buffer di permeabilizzazione alla piastra e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Successivamente, lavare la piastra due volte con PBS A.Successivamente, aggiungere 50 microlitri per pozzetto di un anticorpo monoclonale murino contro l'influenza di tipo A nei pozzetti e incubare a temperatura ambiente con agitazione per un'ora. Al termine dell'incubazione, utilizzare 300 microlitri di soluzione di lavaggio per lavare il pozzetto tre volte. Quindi, aggiungere 50 microlitri di un anticorpo secondario caprino coniugato con HRP ai campioni e incubare a temperatura ambiente per un'ora.Dopo aver lavato le pozzette tre volte come in precedenza, aggiungere 50 microlitri di substrato per pozzetta e incubare a temperatura ambiente per 30 minuti o fino a quando lo sviluppo di un colore blu risulti chiaramente visibile. Per arrestare la reazione, lavare le pozzette due volte con 200 microlitri di acqua distillata. Successivamente, dopo aver fatto asciugare la piastra all'aria, conservarla in un luogo buio.Posizionare una piastra a pozzetti nell'area di scansione di uno scanner a piano, utilizzando il limite di posizionamento a forma di L per garantire una posizione di imaging ottimale e ripetibile. Scansionare la piastra utilizzando le impostazioni mostrate qui. Successivamente, eseguire il software del lettore di piastre a pozzetti per calcolare la concentrazione virale richiesta, facendo clic sul pulsante Carica immagine per caricare un'immagine.Successivamente, nella scheda soglia globale, spostare la barra rossa nell'istogramma per regolare la soglia di campionamento. Quindi, fare clic sul pulsante Aggiorna per esaminare l'effetto su un'immagine. Ora, selezionare la casella Calcola Neutralizzazione/Titolazione.Fare clic sul pulsante Campionamento per quantificare la popolazione di cellule infette, o ICP. Successivamente, quando richiesto, fare clic sul pulsante Salva per salvare i risultati del campionamento. Per ottenere i risultati della titolazione, caricare o inserire la mappa di definizione della piastra a pozzetti.In Titration:Popolazione virale ottimale indicare la soglia. Selezionare la scheda Processo di titolazione per calcolare i risultati della titolazione. Quindi, verificare i risultati della titolazione prima di fare clic sul pulsante Salva e chiudi per salvare i risultati.Consultare il supplemento S1 per istruzioni più dettagliate sul software. Per eseguire la neutralizzazione virale, preparare il monostrato cellulare due o tre giorni in anticipo. Quindi, aggiungere 50 microlitri di VGM in ogni pozzetto della piastra.Utilizzare la colonna 11 per il controllo del virus e la colonna 12 per il controllo cellulare, rispettivamente. Aggiungere aliquote da 50 microlitri di un siero diluito uno a 20 con enzima distruggente i recettori, o RDE, alla prima riga delle colonne da 1 a 10. Eseguire diluizioni seriali a due raddoppi trasferendo 50 microlitri dalla riga A alla riga H e scartando 50 microlitri dalla riga H. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di diluente in ciascun pozzetto della colonna di controllo cellulare.Aggiungere 50 microlitri del virus in ogni pozzetto della piastra, ad eccezione della colonna di controllo delle cellule. Incubare la piastra a 37 gradi Celsius per due o tre ore. Successivamente, rimuovere l'inoculo e aggiungere il rivestimento a ogni pozzetto.Incubare la piastra durante la notte a 37 gradi Celsius senza disturbarla. Successivamente, fissare e colorare le piastre come dimostrato precedentemente in questo video. Per quantificare la neutralizzazione, posizionare una piastra a pozzetti nell'area di scansione di uno scanner a piano piatto come mostrato in precedenza in questo video.Scansionare la piastra ed eseguire il software del lettore di piastre per calcolare i titoli virali richiesti come in precedenza. Dopo aver caricato o inserito la mappa della piastra, in Neutralizzazione:Deduzione dell'infezione indicare la soglia. Quindi, selezionare Elaborazione della neutralizzazione per calcolare i titoli.Infine, verificare i titoli e fare clic sul pulsante Salva e chiudi per salvare i risultati della neutralizzazione. Qui vengono mostrati i risultati della titolazione di recenti esperimenti di caratterizzazione antigenica di otto virus in ingresso con diluizioni comprese tra 1,0 × 10⁻¹ e 1,0 × 10⁻⁶. Il grafico illustra che i PIC diminuiscono con l'aumento della diluizione del virus.Le curve sono state normalizzate rispetto ai PIC degli stessi virus che hanno prodotto infezioni in tutte le cellule all'interno di un pozzetto. In questa tabella sono elencate le diluizioni del virus che hanno prodotto una saturazione del 30% dei PIC e che sono state scelte come diluizione del virus in ingresso per la neutralizzazione. Questa figura mostra i risultati di un esperimento di neutralizzazione utilizzando un virus in ingresso contro cinque antisieri.Il grafico illustra il processo di infezione con l'aumento della diluizione del siero. La popolazione positiva normalizzata sull'asse verticale rappresenta il rapporto tra le ICP della risposta agli antisieri corrispondenti e la media delle ICP del virus di riferimento. Infine, i titoli di neutralizzazione sono stati determinati come i reciproci delle diluizioni degli antisieri corrispondenti alla riduzione del 50% dell'ICP.Questo saggio si concentra sulla riproducibilit&agrave;, velocit&agrave; e sensibilit&agrave; di rilevamento, inclusa la titolazione quantitativa dei virus in ingresso, l'acquisizione di immagini ad alto rendimento e l'elaborazione dei dati. &Egrave; economico, di facile utilizzo ed &egrave; stato impiegato regolarmente negli studi antigenici virali.

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