Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni In Situ Proximity Assay legatura in cellule fissate
10 dicembre 2016
Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.
L'obiettivo generale di questo esperimento è visualizzare e quantificare le interazioni dei mitocondri del reticolo endoplasmatico utilizzando un saggio di legatura di prossimità in situ in cellule fisse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico per analizzare meglio le interazioni dei mitocondri ER in cellule fissate utilizzando una semplice tecnica di immunofluorescenza. Speriamo di suggerire nuove strategie di trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo visualizzare e quantificare le interazioni dei mitocondri ER in cellule fissate e questa tecnica può essere applicata alle biopsie tissutali dei pazienti incluse in paraffina. Utilizzando il saggio di legatura di prossimità in situ dimostrato in questo video, un anticorpo primario di topo diretto contro VDAC1 alla membrana mitocondriale esterna e un anticorpo primario di coniglio diretto contro IP3R1 alla membrana del reticolo endoplasmatico si combinano con i loro epitopi in prossimità dell'interfaccia della membrana mitocondriale associata. Vengono aggiunte sonde di legatura di prossimità che hanno code terminali di DNA attaccate e che sono dirette contro IgG di topo e coniglio e possono formare modelli per la legatura di oligo connettori e possono essere amplificate e visualizzate utilizzando oligonucleotidi rossi del Texas. In accordo con la distanza tra le due membrane degli organelli, all'interfaccia della membrana associata ai mitocondri. Per fissare e bloccare le cellule per il saggio di legatura di prossimità in situ, piastrate le cellule H7 umane a 150.000 cellule per piastra con fondo di vetro non codificato da 35 mm. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e utilizzare 1 mL di PBS per lavare le cellule. Quindi, aspirare il tampone e aggiungere 1 mL di formaldeide al dieci percento. Incubare le piastre a temperatura ambiente agitando per 10 minuti per fissare le cellule. Per fermare la reazione, aggiungere 1 mL di glicina 1 M e mescolare le piastre a rotazione. Rimuovere la soluzione di glicina e aggiungere 1 mL di 1XPBS. Quindi, agitare brevemente le piastre e aspirare il tampone. Quindi, aggiungi 1 ml di glicina 100 mM alle cellule. Incubare le piastre a temperatura ambiente agitando per 15 minuti. Dopo aver aspirato la soluzione, permeabilizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tritone-X100 allo 0,1% in PBS. E ripeti l'incubazione. Aspirare il detersivo e aggiungere 1 ml di PBS per lavare le cellule. Dopo aver rimosso il tampone, aggiungere 40 microlitri di soluzione bloccante a ciascuna piastra di cellule e incubare i campioni in una camera umida a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi picchiettare la soluzione bloccante dalle stoviglie, cercando di ottenere volumi residui uguali di tampone per ogni vetrino senza lasciare che i vetrini si asciughino. Per eseguire il saggio di legatura di prossimità, utilizzare PBS per diluire gli anticorpi primari. Vorticare e aggiungere la soluzione ai piatti. Incubare i campioni a 4
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Panoramica
Questo articolo presenta una procedura per visualizzare e quantificare le interazioni tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri in cellule fissate con elevata sensibilità. Il metodo utilizza un saggio di legatura in situ ottimizzato per indirizzare complessi proteici specifici all'interfaccia della membrana associata ai mitocondri.
Componenti Chiave dello Studio
Area della Scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Chimica biologica
Sfondo
- Il reticolo endoplasmatico e i mitocondri svolgono ruoli fondamentali nel metabolismo cellulare.
- Comprendere le loro interazioni è essenziale per chiarire le funzioni cellulari.
- Il saggio di legatura per prossimità fornisce un metodo sensibile per lo studio delle interazioni proteiche.
- Questo studio si concentra su un complesso proteico specifico coinvolto in queste interazioni.
Scopo dello studio
- Sviluppare un metodo per visualizzare le interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri.
- Quantificare queste interazioni con elevata sensibilità.
- Migliorare la comprensione del metabolismo cellulare e della trasduzione del segnale.
Metodi Utilizzati
- Assay di legatura per prossimità in situ
- Indirizzamento del recettore dell'inositolo 1,4,5-trifosfato
- Partecipazione della proteina regolata dal glucosio 75
- Analisi del complesso del canale anionico dipendente dal voltaggio e della ciclofilina D
Risultati principali
- Visualizzazione riuscita delle interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri.
- Quantificazione dei complessi proteici all'interfaccia della membrana.
- Dimostrazione di un'elevata sensibilità nel rilevamento delle interazioni.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato consente lo studio dettagliato delle interazioni cellulari.
- Le informazioni ottenute possono contribuire alla comprensione dei processi metabolici.
- Questo metodo può essere applicato a diverse aree della ricerca biologica.
Domande frequenti
Rilevanza Industriale del Progetto
La quantificazione delle interazioni endogene tra reticolo endoplasmatico e mitocondri è fondamentale per ridurre i rischi associati alle ipotesi iniziali della scoperta legate alla segnalazione cellulare e alla regolazione metabolica. Il saggio di legatura per prossimità in situ consente una rilevazione sensibile e multiplex dei siti di contatto tra organelli senza sovraespressione proteica, supportando una maggiore affidabilità predittiva nei sistemi pertinenti alle malattie. Questa capacità rafforza le decisioni strategiche nel punto di intersezione tra la validazione del bersaglio e l'analisi meccanicistica dei percorsi biologici.
Applicazioni Strategiche nella Ricerca e Sviluppo in Biopharma
Prima Fase della Scoperta e Validazione del Target
- Permette la visualizzazione diretta e la quantificazione dei contatti tra reticolo endoplasmatico e mitocondri a livello molecolare.
- Supporta la riduzione del rischio meccanicistica confermando la prossimità di proteine endogene in cellule fissate e biopsie di tessuto.
- Facilita la validazione funzionale delle proteine bersaglio in vie di segnalazione che coinvolgono il calcio e la comunicazione tra organelli.
- Migliora l'affidabilità predittiva per lo sviluppo di bersagli implicati in disturbi metabolici e di segnalazione.
Screening e sviluppo di saggi
- Fornisce un saggio standardizzato e riproducibile per la quantificazione delle interazioni proteina-proteina a risoluzione sub-organellare.
- Consente test multi-condizione per valutare l'impatto di composti o perturbazioni genetiche sui contatti tra reticolo endoplasmatico e mitocondri.
- Produce output quantitativi adatti all'analisi comparativa tra diversi bracci sperimentali.
- Supporta la scalabilità del saggio e il riutilizzo della piattaforma per iniziative di screening più ampie.
Ricerca Translazionale e Preclinica
- Si allinea a sistemi rilevanti per la malattia consentendo l'analisi in biopsie di tessuto derivate dal paziente.
- Mantiene la continuità traslazionale dalla scoperta alla validazione preclinica di bersagli nell'interazione tra organelli.
- Supporta un avanzamento adeguato al rischio fornendo evidenze meccanicistiche dell'attivazione del percorso.
Integrazione di Pipeline e Flusso di Lavoro
Questo saggio di legame per prossimità in situ collega la fase iniziale di scoperta alla ricerca preclinica, consentendo una quantificazione robusta delle interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri in cellule e tessuti fissati.
- Biologia della Scoperta: Supporta la verifica di ipotesi e la chiarificazione dei percorsi nei meccanismi di comunicazione tra organelli.
- Screening: Fornisce letture quantitative e riproducibili per campagne di screening di composti o genetici.
- Analisi: Consente un rilevamento sensibile della vicinanza proteica inferiore a 40 nm, permettendo il confronto statistico delle frequenze di interazione.
- Ricerca Translazionale: Facilita l'allineamento dei biomarcatori e la validazione meccanicistica in campioni rilevanti per le malattie.
- Riutilizzo Aziendale: Offre una piattaforma riutilizzabile per studi diversificati sulle interazioni proteiche in diversi programmi di R&S.
Impatto Operativo ed Aziendale
- Valore scientifico: Aumenta la fiducia predittiva e riduce l'ambiguità meccanicistica nella validazione del target.
- Valore operativo: Standardizza il rilevamento delle interazioni proteiche endogene con elevata sensibilità e specificità.
- Valore strategico: Permette decisioni più accurate di avanzamento o interruzione fornendo dati meccanicistici solidi fin dalle fasi iniziali del processo.
- Impatto sul portafoglio: Supporta la priorizzazione e l'avanzamento mirati dei target sulla base di profili di interazione con organelli validati.
Considerazioni sull'implementazione
- Richiede competenze nei protocolli di immunofluorescenza e saggio di legame per prossimità.
- Necessita di accesso ad anticorpi di alta qualità e a infrastrutture per l'immagine a fluorescenza.
- Richiede una standardizzazione tra gruppi di lavoro per una quantificazione riproducibile tra studi diversi.
- Adattabile sia a linee cellulari che a biopsie di tessuto in paraffina per una rilevanza traslazionale.
- Limitato a campioni fissati; non adatto allo studio di interazioni dinamiche in cellule vive.
