Name: Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni In Situ Proximity Assay legatura in cellule fissate (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 34 s
Description: Scopri come visualizzare e quantificare le interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri in cellule fissate utilizzando l'in situ proximity ligation assay. Questo metodo offre alta sensibilità per studiare i complessi proteici all'interfaccia delle membrane.

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Ringraziamo tutte le persone nel nostro laboratorio che hanno contribuito a ottimizzare e validare il protocollo. Questo lavoro è stato sostenuto da INSERM e l&#39;agenzia nazionale di ricerca (ANR-09-JCJC-0116 E ANR-11-BSV1-033-02). ET è stato sostenuto durante il suo dottorato di ricerca da un assegno di ricerca dal Ministero francese dell&#39;istruzione superiore e della ricerca.

1. preparazione di soluzioni <ol><li> Preparare 10% di formaldeide in PBS (bassa percentuale di sale) diluendo 5.5 ml di formaldeide al 37% in 14,5 ml di PBS. Preparare 1 M glicina, pH 8,0, sciogliendo 3,8 g di glicina in 50 ml di PBS; diluire questa soluzione per ottenere 100 mM glicina in PBS 1x. </li><li> Preparare 0,1% Triton-X100 in 1x PBS. Preparare 20x Saline sodio citrato (SSC) utilizzando 3,0 M di cloruro sodico e 0,30 M citrato trisodico preparato in un buffer di acqua deionizzata a pH 7,0 a 25 ° C. Diluire questo buffer a 1x e 0,01X con acqua deionizzata. </li></ol> 2. Fissazione delle cellule NOTA: Abbiamo usato la linea cellulare epatocarcinoma Huh7 in questo studio, ma questo metodo è applicabile ad altre culture di cellule aderenti. <ol><li> cellule piastra Huh7 (coltivate in DMEM 1 g / L di glucosio, supplementato con 10% siero fetale bovino e 0,01% di penicillina-streptomicina magazzino) a 150.000 cellule per non patinata piatto fondo di vetro da 35 mm. Quando si lavora su cellule primarieculture, utilizzano piatti collagene rivestite. </li><li> Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura. Lavare le cellule con 1 ml di PBS e aspirare. Fissare le cellule aggiungendo 1 ml di formaldeide al 10% e incubare per 10 min a temperatura ambiente (RT) sotto agitazione. </li><li> Arrestare la reazione con 1 ml di 1 M glicina e mescolare rotazione. Rimuovere la soluzione di reazione di arresto e lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS 1x; Agitare dalla rotazione e aspirare. Aggiungere 1 ml di 100 mM glicina alle cellule e incubare per 15 minuti a RT sotto agitazione, e poi aspirare. NOTA: Il protocollo può essere fermato qui e la seguente procedura può essere rimandata ad un altro giorno. In tal caso, aggiungere 1 ml di 100 mM glicina e mantenere a 4 ° C, se necessario. </li></ol> 3. permeabilizzazione delle cellule <ol><li> Aggiungere 1 ml di 0,1% Triton-X100 in 1x PBS, incubare per 15 minuti a RT sotto agitazione, e poi aspirare. Questo tempo di incubazione potrebbe essere aumentato fino a 15 - 20 minuti quando si lavora su cultur cellula primariaes (ad esempio, gli epatociti topi primaria). Lavare le cellule con l&#39;aggiunta di 1 ml di PBS 1x; aspirare. </li></ol> 4. Blocco <ol><li> Aggiungere 40 ml di soluzione bloccante a ciascun campione (fornito dal kit); questo volume può essere aumentato per coprire il campione. Incubare le stoviglie per 30 min a 37 ° C in una camera umida. </li><li> Toccare la soluzione di saturazione fuori dei piatti. Cercare di ottenere uguali volumi residui per ogni diapositiva, come questo influirà la riproducibilità. Non lasciare i campioni a secco! </li></ol> 5. Anticorpi primari <ol><li> Diluire gli anticorpi primari in 1x PBS e aggiungere la soluzione ai piatti (anticorpi del mouse VDAC1: 1/100, IP3R1 anticorpi di coniglio: 1/500). In alternativa, GRP75 o CypD anticorpi (entrambi anticorpi murini usati a 1/500) possono essere utilizzati al posto di VDAC1. </li><li> Incubare per una notte in una camera umida a 4 ° C. Lavare le diapositive due volte utilizzando Tris Buffered Saline con lo 0,01% di Tween (TBS-T). </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 6. Di prossimità Ligation Assay Sonde <ol><li> Prossimità sonde saggio legatura sono forniti dal kit. Scegliere sonde secondo le specie di anticorpi primari. </li><li> Preparare le due sonde di prossimità test legatura 1: 5 nel diluente. Lasciare il composto a riposare per 20 minuti a temperatura ambiente. Aggiungere la soluzione della sonda test di prossimità legatura diluito. Incubare i piatti in una camera umida preriscaldato per 1 ora a 37 ° C. Lavare i piatti due volte con TBS-T. </li></ol> 7. legatura <ol><li> Utilizzare il reagente di rilevamento in situ Texas kit di rosso. </li><li> Diluire la legatura magazzino 5x (fornito dal kit) 1: 5 in acqua ad alta purezza e mescolare bene. Diluire ligasi nella soluzione 1x legatura (fornito dal kit) 1:40 e vortex. Attendere aggiungere ligasi solo immediatamente prima oltre ai campioni. </li><li> Aggiungere questa soluzione per ogni campione (40 microlitri per piatti con fondo di vetro da 35 mm) e incubare i vetrini in una umidità cham preriscaldatober per 30 min a 37 ° C. Lavare le diapositive due volte con TBS-T. </li></ol> 8. Amplificazione Nota: Fare attenzione reagenti sensibili alla luce,. <ol><li> Diluire il magazzino 5x amplificazione (fornito dal kit) 1: 5 in acqua ad alta purezza. Rimuovere la polimerasi dal congelatore utilizzando il blocco di congelamento (-20 ° C). Diluire la polimerasi (fornito dal kit) 1:80 nella soluzione di amplificazione 1x e vortex. Aggiungere la polimerasi subito prima di utilizzare la miscela. </li><li> Aggiungere questa soluzione per ogni campione (40 microlitri per piatti con fondo di vetro da 35 mm). Incubare i vetrini in una camera umida preriscaldata per 100 minuti a 37 ° C. Toccare la soluzione di amplificazione-polimerasi fuori delle diapositive. </li></ol> 9. lavaggio finale <ol><li> Lavare i vetrini in tampone di lavaggio 1x SSC per 2 minuti. Lavare le diapositive 0,01X tampone di lavaggio SSC per 2 minuti. Lasciate che l&#39;asciugatura delle stoviglie a RT al buio. </li></ol> 10. Preparazione per l&#39;imaging <ol&gt; <li> Montare le diapositive utilizzando un volume minimo di mezzo di montaggio contenente DAPI (acquosa e non solidificare), assicurando che bolle d&#39;aria rimangano intrappolati sotto il vetrino. Smalto per unghie può essere utilizzato per sigillare i bordi. Attendere circa 15 minuti prima di analizzare con una fluorescenza o microscopio confocale (eccitazione: 594 nm, emissione: 624 nm, ingrandimento: 63X). </li><li> Dopo l&#39;imaging, conservare i campioni a -20 ° C al buio. </li></ol>

<ol><li>Bravo-Sagua, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Organelle+communication%3A+signaling+crossroads+between+homeostasis+and+disease%5BTitle%5D)+AND+%22The+international+journal+of+biochemistry+%26+cell+biology%22%5BJournal%5D)">Organelle communication: signaling crossroads between homeostasis and disease.</a> The international journal of biochemistry & cell biology. 50, 55-59 (2014).</li>
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<li>Soderberg, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+individual+endogenous+protein+complexes+in+situ+by+proximity+ligation%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+methods%22%5BJournal%5D)">Direct observation of individual endogenous protein complexes in situ by proximity ligation.</a> Nature methods. 3, 995-1000 (2006).</li>
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</ol>

Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Nel complesso, i nostri studi indicano che il saggio di legatura di prossimità in situ è davvero una strategia rilevante per seguire e quantificare le interazioni endogene ER-mitocondri in cellule fisse, senza la necessità di utilizzare fluorofori specifici per organelli o proteine fluorescenti. L'uso specifico degli anticorpi VDAC1/IP3R1 è stato adattato per studiare le interazioni ER-mitocondri nelle cellule HuH7. Tuttavia, possono essere utilizzate isoforme alternative di VDAC e IP3R, a seconda del tipo di ce...

Mitocondri e reticolo endoplasmatico (ER) non sono organelli indipendenti nella cellula, ma interagiscono strutturalmente e funzionalmente a siti di contatto definite membrane reticolo endoplasmatico mitocondri-associato (MAM). Infatti, DAM corrispondono alle regioni in cui le membrane del ER e mitocondri sono strettamente apposto, permettendo interazioni tra proteine ​​da entrambi i lati. Ciò nonostante, le membrane di questi organelli non si fondono in queste regioni, in modo da mantenere le loro entità separate. I DAM svolgono un ruolo cruciale nel calcio (Ca 2+) e il trasferimento dei fosfolipidi da ER a mitocondri, impattando il metabolismo energetico e la sopravvivenza delle cellule 1-3. L&#39;associazione tra ER e mitocondri è stato visualizzato nel 1970 con microscopia elettronica. Da allora, la trasmissione microscopia elettronica 4,5, elettroni tomografia 6,7 o immuno-localizzazione di ER e specifici mitocondri fluoroforos / proteine fluorescenti 8 sono stati classicamente utilizzati per studiare le interazioni ER-mitocondri. Un altro strumento utile per l&#39;analisi di MAM si basa sull&#39;uso di frazionamento subcellulare. Esso permette di isolare frazioni MAM mediante ultracentrifugazione differenziale accoppiato ad un gradiente Percoll 9. Tuttavia, il prodotto finale contiene frazioni arricchite MAM, anziché frazioni pure. Complessivamente, queste strategie non sono particolarmente sensibili e / o quantitativo, e non sono facilmente suscettibili di grande screening. In alternativa, utilizzando approcci genetici fluorescenti linker inter-organelli droga-inducibile sono emerse, ma non consentire l&#39;analisi delle interazioni organelli ai livelli di espressione delle proteine endogene 10. Sulla base di scoperta di Szabadkai del complesso IP3R / GRP75 / VDAC al MAM 11, abbiamo sviluppato un metodo quantitativo per analizzare le interazioni ER-mitocondri. Abbiamo usato il ligati in situ di prossimitàil test di rilevare e quantificare le interazioni tra VDAC1 e IP3R1, due proteine organello-superficiali coinvolti nella -channeling complesso Ca 2+ all&#39;interfaccia MAM in cellule fisse 12. Brevemente, abbiamo sondato VDAC1 alla membrana esterna mitocondriale (topo anti-VDAC1 anticorpo primario) e IP3R1 sulla membrana ER (coniglio anti-IP3R1 anticorpo primario) (figura 1, pannello A). Quindi, secondo il test, abbiamo aggiunto sia anti-topo e IgG anti-coniglio (sonde saggio mouse e vicinanza coniglio legatura), che sono coniugato a estensioni oligonucleotidi complementari. Se le due proteine sono mirati ad una distanza inferiore a 40 nm, gli oligonucleotidi possono ibridare con oligonucleotidi connettore successivamente aggiunti per consentire la formazione di un modello circolare DNA (figura 1, pannello B). Questa molecola di DNA circolare è legatura ed amplificato, creando un prodotto singolo filamento DNA covalentemente attaccata ad una delle sonde di prossimità (figura 1, pannello c) </strong&gt;. Poiché la distanza tra ER e mitocondri all&#39;interfaccia MAM varia da 10 nm a 25 nm 6, vicinanza legatura ed amplificazione può essere fatto, portando a successiva rivelazione causa della ibridazione della Texas oligonucleotidi rossi marcati sonde (Figura 1, pannello d ). Ogni punto rappresenta fluorescente interazioni tra VDAC1 / IP3R1, permettendo così la quantificazione delle interazioni in situ ER-mitocondri nelle singole celle. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54899/54899fig1.jpg" /> Figura 1: Schema Illustrazione del rilevamento delle interazioni reticolo endoplasmatico-mitocondri in situ prossimità legatura Assay. a) Un anticorpo mouse principale diretto contro VDAC1 e un anticorpo di coniglio diretto contro primaria IP3R1 possono legarsi ai loro epitopi in prossimità all&#39;interfaccia MAM, b) aggiunta di una coppia di sonde legatura di prossimitàdiretto contro mouse e IgG di coniglio. Queste sonde hanno attaccato filamenti di DNA che possono formare modelli per la legatura di oligonucleotidi connettore. c) Il filamento di DNA circolare formata dopo la legatura può essere amplificato e d) visualizzati mediante microscopia a fluorescenza dot utilizzando oligonucleotidi Texas red-marcato. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54899/54899fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> Simile in esperimenti di analisi in situ prossimità legatura possono essere eseguite con la coppia GRP75 / IP3R1 di anticorpi, così come cyclophilin D (CypD) / anticorpi IP3R1, se si considera che CypD ha dimostrato di interagire con il complesso IP3R / GRP75 / VDAC all&#39;interfaccia MAM 12-14.

<table><tbody><tr><td>Formaldeide</td><td>Sigma</td><td>F-8775</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Sigma</td><td>G-8898</td><td></td></tr><tr><td>Triton</td><td>Sigma</td><td>T8532</td><td></td></tr><tr><td>35 mm Piastre di coltura con fondo in vetro</td><td>MatTeK corporation</td><td>P35G-0-14-C</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione bloccante</td><td>Sigma</td><td>DUO-92004 o DUO-92002</td><td>fornita nelle sonde Duolink PLA, anticorpo Sigma</td></tr><tr><td>VDAC1</td><td>Abcam</td><td>ab14734</td><td></td></tr><tr><td>IP3R1-H80 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc28614</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo CypD</td><td>Abcam</td><td>ab110324</td><td></td></tr><tr><td>Grp75 anticorpo</td><td>Santa Cruz</td><td>sc13967</td><td></td></tr><tr><td>TBS 10x</td><td>euromedex</td><td>ET220</td><td>Diluire per ottenere 1x</td></tr><tr><td>Tween 100x</td><td>euromedex</td><td>2001-B</td><td>diluire in TBS per ottenere 0,01%</td></tr><tr><td>Sonde PLA Topo MINUS</td><td></td><td>Sigma DUO-92004</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td>PLA Sonde Rabbit PLUS</td><td>Sigma</td><td>DUO-92002</td><td>Duolink, Reagenti di rilevamento Sigma</td></tr><tr><td>Duolink rosso</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Duolink,</td></tr><tr><td>Soluzione di legatura</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Sigma</td></tr><tr><td>Ligasi</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Soluzione di</td></tr><tr><td>amplificazione</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Sigma</td></tr><tr><td>Polimerasi</td><td>Sigma</td><td>DUO-92008</td><td>Parte dei reagenti di rilevamento Duolink rosso, Supporto di montaggio Sigma</td></tr><tr><td>Duolink</td><td>Sigma</td><td>DUO80102</td><td>Duolink, Sigma</td></tr><tr><td colspan="4">Softwares</td></tr><tr><td>BlobFinder</td><td></td><td></td><td>è un software distribuito gratuitamente in grado di eseguire calcoli sulle cellule da immagini di microscopia a fluorescenza. Questo software può essere scaricato gratuitamente dal Centro per l'analisi delle immagini dell'Università di Uppsala, che ha sviluppato il software e il lavoro è stato supportato dal progetto europeo ENLIGHT del 6° PQ e da Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm</td></tr><tr><td>software</td><td></td><td></td> ImageJ <td>Può essere scaricato gratuitamente da: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html</td></tr></tbody></table>

studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; in situ</em&gt; proximity assay legatura in cellule fissate

Study of Endoplasmic Reticulum and Mitochondria Interactions by In Situ Proximity Ligation Assay in Fixed Cells

Le interazioni strutturali tra il reticolo endoplasmatico (ER) e le membrane mitocondriali, in domini noti come membrane associate ai mitocondri (MAM), sono hub cruciali per la segnalazione cellulare e il destino cellulare. In particolare, questi siti di contatto inter-organelli consentono il trasferimento di calcio dal reticolo endoplasmatico ai mitocondri attraverso il complesso di canalizzazione del calcio del canale anionico voltaggio-dipendente (VDAC)/proteina 75 regolata dal glucosio (GRP75)/recettore dell'inositolo 1,4,5-trifosfato (IP3R). Sebbene questo compartimento subcellulare sia oggetto di intense indagini sia in condizioni fisiologiche che patologiche, non esiste un metodo semplice e sensibile per quantificare la quantità endogena di contatto ER-mitocondri nelle cellule. Allo stesso modo, i MAM sono strutture altamente dinamiche e non esiste un approccio adatto per seguire le modifiche delle interazioni ER-mitocondri senza sovraespressione proteica. Qui, riportiamo un protocollo ottimizzato basato sull'uso di un saggio di legatura di prossimità in situ per visualizzare e quantificare le interazioni endogene ER-mitocondri in cellule fissate utilizzando la stretta vicinanza tra le proteine della membrana mitocondriale esterna (VDAC1) e della membrana ER (IP3R1) all'interfaccia MAM. Esperimenti simili di legatura di prossimità in situ possono essere eseguiti anche con le coppie di anticorpi GRP75/IP3R1 e ciclofilina D/IP3R1. Questo test offre numerosi vantaggi rispetto ad altre procedure di imaging, in quanto è altamente specifico, sensibile e adatto a test in più condizioni. Pertanto, l'uso di questo saggio di ligazione di prossimità in situ dovrebbe essere utile per comprendere meglio le regolazioni fisiologiche delle interazioni ER-mitocondri, nonché il loro ruolo in contesti patologici.

Sulla base della nostra esperienza con questo protocollo, possiamo tranquillamente consigliare questo metodo per la visualizzazione e la quantificazione delle interazioni ER-mitocondri nelle cellule fisse. Immagini rappresentative della legatura in prossimità interazioni ER-mitocondri situ test-visualizzato nella linea di cellule Huh7 epatocarcinoma, utilizzando diverse paia di anticorpi, sono mostrati. Come mostrato in figura 2 mediante microscopia a f...

Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all&#39;interfaccia membrana mitocondriale associata.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni<em&gt; In Situ</em&gt; Proximity Assay legatura in cellule fissate

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è visualizzare e quantificare le interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri utilizzando un saggio di legatura per prossimità in situ in cellule fissate. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo biomedico, consentendo un’analisi più accurata delle interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri in cellule fissate mediante una semplice tecnica di immunofluorescenza, suggerendo potenzialmente nuove strategie terapeutiche. Il principale vantaggio di questa tecnica è la possibilità di visualizzare e quantificare le interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri in cellule fissate, ed essa può essere applicata anche a biopsie di tessuti fissati in paraffina prelevati da pazienti. Utilizzando il saggio di legatura per prossimità in situ dimostrato in questo video, un anticorpo primario murino diretto contro VDAC1 sulla membrana mitocondriale esterna e un anticorpo primario coniglio diretto contro IP3R1 sulla membrana del reticolo endoplasmatico si legano ai rispettivi epitopi in prossimità all'interfaccia della membrana associata ai mitocondri. Vengono quindi aggiunti sonde di legatura per p

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Qui si descrive un metodo per visualizzare reticolo endoplasmatico associate mRNA in cellule di mammifero coltura tissutale. Questa tecnica comporta la permeabilizzazione selettiva della membrana plasmatica con digitonina di rimuovere contenuto citoplasmatico seguite da...

Visualizzazione di mRNA reticolo endoplasmatico localizzate in cellule di mammifero

Descriviamo gli approcci di imaging usiamo per indagare la distribuzione e la mobilità delle proteine ​​fluorescenti trasfettate residenti nel reticolo endoplasmatico (ER) mediante la microscopia confocale di cellule viventi. Abbiamo anche ultrastrutturalmente di analizzare l'effetto della loro espressione sulla architettura di questo comparto subcellulare.

Visualizzazione del reticolo endoplasmatico sottodomini in cellule in coltura

Un metodo di microscopia luce correlativa (CLEM) viene applicato alle strutture intracellulari indotte da virus immagine tramite microscopia elettronica (EM) in cellule che sono già stati scelti da microscopia chiara (LM). LM ed EM sono combinati in un approccio di imaging ibrido per ottenere una visione integrata delle interazioni virus-ospite.

Microscopia a luce correlativa (CLEM) per il monitoraggio e la proteina virale di Imaging strutture in cellule di Cryo-immobilizzata associate

Presentiamo un protocollo per studiare la distribuzione di mitocondri e reticolo endoplasmico in intere cellule dopo la modificazione genetica utilizzando la microscopia elettronica di luce e volume correlata, tra cui l'ascorbate perossidasi 2 e la colorazione della perossidia di rafano, sezionamento seriale di cellule con e senza il gene bersaglio nella stessa sezione e imaging seriale tramite microscopia elettronica.

Mitocondri e reticulum imaging endoplasmico di microscopia elettronica di luce correlata e volume

Questo protocollo descrive il metodo cryoAPEX, in cui una proteina della membrana marcata APEX2 può essere localizzata mediante microscopia elettronica di trasmissione all'interno di ultrastruttura cellulare conservata in modo ottimale.

Il metodo CryoAPEX per l'analisi della microscopia elettronica della localizzazione delle proteine membrana all'interno delle cellule ultrastrutturalizzate

Un protocollo semplice e completo per acquisire dettagli tridimensionali dei siti di contatto della membrana tra organelli negli epatociti dal fegato o cellule in altri tessuti.

Caratterizzazione tridimensionale dei siti di contatto interorganelle negli epatociti mediante microscopia elettronica a sezione seriale

La necessità di nuovi approcci per studiare i siti di contatto di membrana (MCS) è cresciuta a causa del crescente interesse per lo studio di queste strutture cellulari e dei loro componenti. Qui, presentiamo un protocollo che integra tecnologie di microscopia precedentemente disponibili per identificare e quantificare i complessi proteici intra-organello e inter-organello che risiedono nelle MCS.

Visualizzazione e quantificazione delle interazioni proteiche endogene intra-organelli nei siti di contatto ER-mitocondri mediante saggi di legatura di prossimità

Qui, presentiamo un protocollo per la microscopia elettronico-leggera correlativa ottimizzata in sezione basata sulla marcatura endogena e fluorescente come strumento per studiare la localizzazione di proteine rare in relazione all'ultrastruttura cellulare. La potenza di questo approccio è dimostrata dalla localizzazione ultrastrutturale di LC3 endogena in cellule affamate senza trattamento con bafilomicina.

Localizzazione ultrastrutturale di LC3 endogena mediante microscopia elettronico-ottica correlativa in sezione

Abbiamo stabilito un saggio di riassemblaggio della luciferasi divisa per monitorare i contatti reticolo endoplasmatico-mitocondri nelle cellule vive. Utilizzando questo saggio, descriviamo un protocollo per misurare quantitativamente il livello di questi accoppiamenti inter-organelli in cellule HEK293T, in condizioni di trattamento chimico.

Saggio di riassemblaggio della split-luciferasi per misurare i contatti reticolo-mitocondri endoplasmatici in cellule vive

Questo protocollo descrive un meccanismo per l'utilizzo della microscopia ottica ed elettronica correlativa per visualizzare l'interazione di mitocondri e lisosomi marcati rispettivamente con mEosEM e APEX2.

Microscopia correlativa a luce ed elettronica a due colori per la visualizzazione delle interazioni tra mitocondri e lisosomi

Scopri come visualizzare e quantificare le interazioni tra reticolo endoplasmatico e mitocondri in cellule fissate utilizzando l'in situ proximity ligation assay. Questo metodo offre alta sensibilità per studiare i complessi proteici all'interfaccia delle membrane.

Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni

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