Studio del reticolo endoplasmatico e mitocondri interazioni In Situ Proximity Assay legatura in cellule fissate
10 dicembre 2016
Qui, descriviamo una procedura per visualizzare e quantificare con alta sensibilità le interazioni endogeni tra il reticolo endoplasmatico e mitocondri nelle cellule fissate. Il protocollo è dotato di un ottimizzato in test legatura situ prossimità targeting inositolo 1,4,5-trifosfato recettore / glucosio-regolata proteina 75 / D complesso canale anionico / cyclophilin voltaggio-dipendente all'interfaccia membrana mitocondriale associata.
L'obiettivo generale di questo esperimento è visualizzare e quantificare le interazioni dei mitocondri del reticolo endoplasmatico utilizzando un saggio di legatura di prossimità in situ in cellule fisse. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave in campo biomedico per analizzare meglio le interazioni dei mitocondri ER in cellule fissate utilizzando una semplice tecnica di immunofluorescenza. Speriamo di suggerire nuove strategie di trattamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che possiamo visualizzare e quantificare le interazioni dei mitocondri ER in cellule fissate e questa tecnica può essere applicata alle biopsie tissutali dei pazienti incluse in paraffina. Utilizzando il saggio di legatura di prossimità in situ dimostrato in questo video, un anticorpo primario di topo diretto contro VDAC1 alla membrana mitocondriale esterna e un anticorpo primario di coniglio diretto contro IP3R1 alla membrana del reticolo endoplasmatico si combinano con i loro epitopi in prossimità dell'interfaccia della membrana mitocondriale associata. Vengono aggiunte sonde di legatura di prossimità che hanno code terminali di DNA attaccate e che sono dirette contro IgG di topo e coniglio e possono formare modelli per la legatura di oligo connettori e possono essere amplificate e visualizzate utilizzando oligonucleotidi rossi del Texas. In accordo con la distanza tra le due membrane degli organelli, all'interfaccia della membrana associata ai mitocondri. Per fissare e bloccare le cellule per il saggio di legatura di prossimità in situ, piastrate le cellule H7 umane a 150.000 cellule per piastra con fondo di vetro non codificato da 35 mm. Il giorno successivo, rimuovere il terreno di coltura e utilizzare 1 mL di PBS per lavare le cellule. Quindi, aspirare il tampone e aggiungere 1 mL di formaldeide al dieci percento. Incubare le piastre a temperatura ambiente agitando per 10 minuti per fissare le cellule. Per fermare la reazione, aggiungere 1 mL di glicina 1 M e mescolare le piastre a rotazione. Rimuovere la soluzione di glicina e aggiungere 1 mL di 1XPBS. Quindi, agitare brevemente le piastre e aspirare il tampone. Quindi, aggiungi 1 ml di glicina 100 mM alle cellule. Incubare le piastre a temperatura ambiente agitando per 15 minuti. Dopo aver aspirato la soluzione, permeabilizzare le cellule aggiungendo 1 mL di tritone-X100 allo 0,1% in PBS. E ripeti l'incubazione. Aspirare il detersivo e aggiungere 1 ml di PBS per lavare le cellule. Dopo aver rimosso il tampone, aggiungere 40 microlitri di soluzione bloccante a ciascuna piastra di cellule e incubare i campioni in una camera umida a 37 gradi Celsius per 30 minuti. Quindi picchiettare la soluzione bloccante dalle stoviglie, cercando di ottenere volumi residui uguali di tampone per ogni vetrino senza lasciare che i vetrini si asciughino. Per eseguire il saggio di legatura di prossimità, utilizzare PBS per diluire gli anticorpi primari. Vorticare e aggiungere la soluzione ai piatti. Incubare i campioni a 4
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Panoramica
Questo articolo presenta una procedura per visualizzare e quantificare le interazioni tra il reticolo endoplasmatico e i mitocondri in cellule fisse con elevata sensibilità. Il metodo utilizza un saggio di legatura in prossimità ottimizzato in situ per mirare a complessi proteici specifici all'interfaccia della membrana associata ai mitocondri.
Componenti chiave dello studio
Area della scienza
- Biologia cellulare
- Neuroscienze
- Biochimica
Sfondo
- Il reticolo endoplasmatico e i mitocondri svolgono ruoli cruciali nel metabolismo cellulare.
- Comprendere le loro interazioni è essenziale per chiarire le funzioni cellulari.
- I saggi di legatura in prossimità forniscono un metodo sensibile per studiare le interazioni proteiche.
- Questo studio si concentra su un complesso proteico specifico coinvolto in queste interazioni.
Obiettivo dello studio
- Sviluppare un metodo per visualizzare le interazioni ER-mitocondri.
- Quantificare queste interazioni con elevata sensibilità.
- Migliorare la comprensione del metabolismo cellulare e della segnalazione.
Metodi utilizzati
- Saggio di legatura in prossimità in situ
- Mirato al recettore dell'inositolo 1,4,5-trifosfato
- Coinvolgimento della proteina regolata dal glucosio 75
- Analisi del complesso canale anionico voltaggio-dipendente e ciclofillina D
Risultati principali
- Viabilizzazione con successo delle interazioni ER-mitocondri.
- Quantificazione dei complessi proteici all'interfaccia della membrana.
- Dimostrazione di elevata sensibilità nel rilevare le interazioni.
Conclusioni
- Il protocollo sviluppato consente uno studio dettagliato delle interazioni cellulari.
- Le intuizioni acquisite possono contribuire alla comprensione dei processi metabolici.
- Questo metodo può essere applicato a varie aree di ricerca biologica.
Domande frequenti
Executive Industry Relevance
Quantifying endogenous ER-mitochondria interactions is critical for de-risking early discovery hypotheses related to cellular signaling and metabolic regulation. The in situ proximity ligation assay enables sensitive, multiplexed detection of organelle contact sites without protein overexpression, supporting predictive confidence in disease-relevant systems. This capability strengthens portfolio decisions at the intersection of target validation and mechanistic pathway analysis.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables direct visualization and quantification of ER-mitochondria contacts at the molecular level.
- Supports mechanistic de-risking by confirming endogenous protein proximity in fixed cells and tissue biopsies.
- Facilitates functional target validation for pathways involving calcium signaling and organelle crosstalk.
- Improves predictive confidence for advancing targets implicated in metabolic and signaling disorders.
Screening & Assay Development
- Provides a standardized, reproducible assay for quantifying protein-protein interactions at sub-organelle resolution.
- Enables multi-condition testing to assess the impact of compounds or genetic perturbations on ER-mitochondria contacts.
- Delivers quantitative outputs suitable for comparative analysis across experimental arms.
- Supports assay scalability and platform reuse for broader screening initiatives.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling analysis in patient-derived tissue biopsies.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation of organelle interaction targets.
- Supports risk-adjusted advancement by providing mechanistic evidence of pathway engagement.
Pipeline & Workflow Integration
This in situ proximity ligation assay bridges early discovery and preclinical research by enabling robust quantification of ER-mitochondria interactions in fixed cells and tissues.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification for organelle crosstalk mechanisms.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for compound or genetic screening campaigns.
- Analytics: Provides sensitive detection of protein proximity below 40 nm, enabling statistical comparison of interaction frequencies.
- Translational Research: Facilitates biomarker alignment and mechanistic validation in disease-relevant samples.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable platform for diverse protein interaction studies across multiple R&D programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes detection of endogenous protein interactions with high sensitivity and specificity.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions by providing robust mechanistic data early in the pipeline.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of targets with validated organelle interaction profiles.
Implementation Considerations
- Requires expertise in immunofluorescence and proximity ligation assay protocols.
- Needs access to high-quality antibodies and fluorescence imaging infrastructure.
- Demands cross-team standardization for reproducible quantification across studies.
- Adaptable to both cell lines and paraffin-embedded tissue biopsies for translational relevance.
- Limited to fixed samples; not suitable for live-cell dynamic interaction studies.
