Spaziale e temporale Analisi di attiva ERK nel C. elegans Linea germinale

L'obiettivo generale di questo esperimento è quello di analizzare i livelli attivi di ERK in vivo nelle gonadi di C. elegans. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della segnalazione ERK e delle cellule germinali, come gli effetti dei trattamenti farmacologici o le perturbazioni geniche sulla via RAS-ERK e quindi sullo sviluppo delle cellule germinali. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il modello e la potenza del segnale ERK possono essere quantificati in vivo.

Raccogli da 100 a 150 vermi allo stadio di sviluppo desiderato e raccoglili in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri contenente 100 microlitri di tampone M9. Quindi, riempire la provetta da microcentrifuga con altri 900 microlitri di tampone M9 e centrifugarla a 1000 volte g per un minuto a temperatura ambiente. Sotto un microscopio da dissezione, rimuovere delicatamente 900 microlitri del tampone M9.

Quindi ripetere il lavaggio altre due volte per rimuovere la maggior parte dei batteri attaccati. Successivamente, utilizzando una punta per micropipetta da 200 microlitri con un foro largo, trasferire i vermi in 100 microlitri di tampone M9 su un piatto di vetro a fondo piatto. Quindi, aggiungere da uno a tre microlitri di Levamisolo 0,1 molare al piatto e agitarlo delicatamente.

Ora, collega due aghi calibro 25 a due siringhe per creare uno strumento di dissezione per ogni mano. Sotto un microscopio da dissezione, posiziona ogni ago sotto e sopra ogni verme e fai un taglio sottile su ogni verme vicino al secondo bulbo faringeo, usando un movimento simile a una forbice. Taglia tutti gli animali almeno una volta, tutti entro cinque minuti, affinché il Levamisolo rimanga efficace.

È molto importante che la dissezione degli animali nella capsula sia completata in meno di cinque minuti. Nel caso in cui una gonade estrusa non sia visibile, basta saltare quell'animale. Qui sono visibili le gonadi estruse corrette.

Al termine della dissezione, sotto una cappa aspirante aggiungere due millilitri di paraformaldeide al 3% direttamente sulla capsula di vetro dell'orologio e coprirla con Parafilm. Quindi, attendi dieci minuti. Quindi, utilizzando una pipetta Pasteur in vetro da nove pollici, aggiungere tre millilitri di PBS-T al vetro dell'orologio e mescolare la soluzione utilizzando la pipetta.

Quindi, utilizzando una nuova pipetta di vetro, aspirare i cinque millilitri di liquido contenenti i vermi e trasferirli in una nuova provetta conica di vetro da cinque millilitri. Quindi, centrifugare la provetta per 30 secondi in una centrifuga clinica a 1000 g. Ora, sotto un microscopio da dissezione, rimuovere e scartare il surnatante senza disturbare i tessuti sezionati.

Quindi, utilizzando aliquote da cinque millilitri di PBS-T, ripetere la fase di lavaggio altre due volte e terminare con i vermi in un piccolo volume di soluzione. Quindi, utilizzando una pipetta di vetro, aggiungere due millilitri di metanolo al 100% e mescolare delicatamente i fazzoletti aspirandoli su e giù con una pipetta Pasteur fresca. Ora, incubare la provetta a 20 gradi Celsius negativi per almeno un'ora.

Dopo il trattamento con metanolo, eseguire tre lavaggi PBS-T e terminare con circa 500 microlitri di PBS-T. Ora, utilizzando una pipetta Pasteur fresca, trasferisci i fazzoletti in un nuovo tubo di vetro da un millilitro e lasciali depositare per gravità. Dopo cinque-10 minuti, utilizzare una pipetta nuova e l'aiuto di un microscopio per rimuovere la maggior parte del lavaggio dal tubo senza disturbare i tessuti.

Per iniziare il blocco, aggiungi 100 microlitri di siero di capra normale al 30%, che è il tampone bloccante. Quindi, coprite il tubo con Parafilm e lasciatelo riposare a temperatura ambiente per un'ora. Dopo un'ora, utilizzando un microscopio, rimuovere quanto più liquido possibile con una nuova pipetta.

Successivamente, preparare 100 microlitri di anticorpo MAPKYT diluiti a uno su 400 in 30% NGS e aggiungerli ai tessuti. Quindi, sigillare la provetta con Parafilm e incubarla per una notte a quattro gradi Celsius. Il giorno successivo, scaldare i tubi a temperatura ambiente e aggiungere 800 microlitri di PBS-T.

Quindi, aspirare il campione in una pipetta di vetro fresca e rilasciarlo delicatamente per ottenere una sospensione uniforme. Una volta che i fazzoletti si sono depositati sul fondo, rimuovere con cura il surnatante e ripetere il lavaggio per un totale di tre volte, utilizzando sempre una pipetta nuova e mai utilizzando un vortice. L'anticorpo secondario viene applicato proprio come il primario, viene solo presa in considerazione la necessità di mantenere i tessuti al buio da qui in avanti fino a quando non possono essere visualizzati.

Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, aggiungere 800 microlitri della soluzione DAPI diluita ai tessuti una volta rimosso l'ultimo lavaggio. Coprire l'imboccatura della provetta con Parafilm e incubarla a temperatura ambiente per 20 minuti. Successivamente, al microscopio da dissezione, rimuovere la maggior quantità possibile di soluzione DAPI con una nuova pipetta.

Dopo aver rimosso l'ultima macchia o lavato, aggiungere una goccia di soluzione di montaggio ai tubi. Ora, preparare un vetrino di montaggio con un tampone di agarosio. Aggiungere una goccia di agarosio fuso al 2% a un vetrino pulito e posizionare rapidamente un secondo vetrino pulito perpendicolarmente e sopra l'agarosio.

Infine, rimuovere molto delicatamente il vetrino superiore del microscopio. Ora, trasferisci gli animali sezionati sul tampone e rimuovi tutto il liquido in eccesso dal tampone con l'aiuto di un microscopio. Infine, applicare un vetrino coprioggetti da 24 x 50 millimetri senza formare bolle d'aria.

Una volta applicato il vetrino coprioggetto, non applicare alcuna pressione aggiuntiva. Questo spesso si traduce in una perdita di segnale. Immagini rappresentative di animali ermafroditi adulti wild type hanno rivelato che la forma attiva difosforilata di ERK è tipicamente visualizzata nella regione del pachitene medio, nella Zona 1 e negli ovociti più maturi della Zona 2.

Le perturbazioni in questo modello di attivazione riflettono i cambiamenti nella via di segnalazione. Le linee germinali femminili non specificano gli spermatozoi e quindi non mostrano l'attivazione di ERK nella Zona 2, con solo un'attivazione debole nella Zona 1. Una volta padroneggiata, questa tecnica può richiedere al massimo due giorni, con il primo giorno che richiede il maggior tempo, con un'ora, se eseguita correttamente.

Seguendo questa procedura, altri metodi come l'RNA fish possono essere utilizzati per quantificare le cose, come il livello di trascrizione dell'RNA, oltre alle informazioni sull'abbondanza delle proteine. Dopo il suo sviluppo nel 1995, questa tecnica ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dello sviluppo delle cellule germinali per misurare i livelli di abbondanza delle proteine in vivo e seguire la morfologia cromosomica in C. elegans.