Un protocollo per l'utilizzo di trasferimento di energia per risonanza (FRET) biosensori -force per misurare le forze meccaniche in tutto il complesso LINC nucleare

L'obiettivo generale di questa procedura è determinare le forze sul linker del citoscheletro nucleoscheletrico, o complesso LINC, attraverso la microscopia FRET in cellule viventi tramite un biosensore progettato per la proteina del complesso LINC, nesprin-2G. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della meccanotrasduzione, come le forze esercitate sulle proteine nel nucleo delle cellule viventi e come queste forze cambiano in condizioni variabili. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua capacità di misurare livelli molto piccoli di forza su proteine e cellule viventi.

In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà a catturare le immagini. Ottimizzare la potenza e il guadagno del laser del microscopio per ricevere un buon segnale tra tutti i gruppi sperimentali è difficile. Per iniziare, è possibile far crescere le cellule blastiche in fibra NIH 3T3 a una confluenza compresa tra il 70% e il 90% in una piastra di coltura cellulare a sei pozzetti in un incubatore per colture cellulari standard con regolazione della temperatura e della CO2.

In una cappa per colture cellulari, rimuovere il terreno e sciacquare ogni pozzetto con circa 1 millilitro di un terreno cellulare sierico ridotto. Aggiungere 800 microlitri di terreno cellulare sierologico ridotto a ciascun pozzetto e posizionare la camera a sei pozzetti nell'incubatore. Quindi, pipettare 700 microlitri di terreno cellulare sierologico ridotto in una provetta da 1,5 millilitri etichettata L con 35 microlitri di soluzione trasportatrice di lipidi per formare la miscela lipo.

Miscelare la sospensione mediante pipettaggio. Quindi, pipettare 100 microlitri del terreno cellulare sierico ridotto in ciascuna delle sei provette da 1,5 millilitri etichettate da una a sei. Pipettare il DNA plasmatico per il sensore di tensione nesprin, il controllo della forza zero senza testa nesprin, mTFP1 e venus in tubi da uno a sei, come descritto nel protocollo di testo.

Non riutilizzare i puntali delle pipette durante il pipettaggio di diversi tipi di DNA. Quindi, pipettare 100 microlitri della miscela lipo dalla provetta L in ciascuna provetta etichettata e miscelare mediante pipettaggio ripetuto, utilizzando una pipetta pulita per ciascuna provetta. Incubare la sospensione per 10-20 minuti.

Quindi, aggiungere 200 microlitri da ciascuna provetta etichettata in un pozzetto della camera a sei pozzetti preparata contenente le cellule. Etichettare la parte superiore di ogni pozzetto con l'aggiunta del DNA corrispondente. Quindi, posizionare la camera a sei pozzetti in un incubatore per quattro o sei ore.

Dopo l'incubazione, aspirare il terreno e aggiungere uno o due millilitri di terreno cellulare sierologico ridotto per risciacquare. Aspirare il terreno sierocellulare ridotto e aggiungere due millilitri di tripsina a ciascun pozzetto prima di posizionare il piatto a sei pozzetti nell'incubatore per 5-15 minuti. Mentre le cellule si staccano nell'incubatore, rivestire sei piastre di visualizzazione con fondo di vetro con uno strato di fibronectina a una concentrazione di 20 microgrammi per millilitro disciolto in soluzione salina tamponata con fosfato.

Lasciare che le piastre ricoprano la superficie della cappa per colture cellulari. Neutralizzare la tripsina aggiungendo due millilitri di DMEM una volta che le cellule si sono staccate. Quindi, trasferire il contenuto di ciascun pozzetto in una provetta da centrifuga da 15 millilitri etichettata e centrifugare a 90 volte g per cinque minuti in una centrifuga a rotore oscillante.

Aspirare il surnatante e risospendere ogni pellet cellulare in 1.000 microlitri di DMEM utilizzando una pipetta. Aspirare la miscela di fibronectina dalle piastre di vetro e pipettare 1.000 microlitri di ciascuna sospensione cellulare sulle stoviglie. Dopo che le cellule si sono depositate sul fondo dei piatti di vetro, aggiungi un altro millilitro di terreno in ciascun pozzetto.

Lasciare che le cellule si attacchino ed esprimano il sensore nell'incubatore cellulare per almeno 18-24 ore. Per verificare l'efficienza della trasfezione, utilizzare un microscopio a fluorescenza dotato di una frequenza di eccitazione vicina a 462 nanometri per mTFP1 o 525 nanometri per venere. Utilizzare un filtro di emissione centrato vicino a 492 nanometri per mTFP1 o 525 nanometri per venere.

Circa 18-24 ore dopo aver completato la trasfezione, utilizzare un microscopio a fluorescenza invertita per esaminare l'efficienza della trasfezione confrontando il numero di cellule fluorescenti con il numero totale di cellule in vista. Se non è possibile eseguire l'imaging delle cellule vive entro 48 ore dalla trasfezione, fissare le cellule in paraformaldeide al 4% per cinque minuti. Lasciare che le cellule esprimano il sensore per 24-48 ore prima del fissaggio.

Conservare le celle in PBS e visualizzarle dopo 48 ore. In una cappa per colture cellulari, sostituire il terreno cellulare con un terreno di imaging integrato con siero bovino fetale al 10%. Posizionare le piastre di visualizzazione in un tavolino per microscopio confocale a temperatura controllata.

Posizionare la piastra di visualizzazione in vetro con celle trasfettate mTFP1 sull'obiettivo dell'olio con un ingrandimento di 60X con un'apertura numerica di 1,4. Localizzare le cellule che esprimono mTFP1 in modalità fluorescente a campo largo. Con una cella fluorescente nel campo visivo, selezionare la modalità di rilevamento spettrale e acquisire l'immagine spettrale.

Includi tutte le frequenze oltre i 458 nanometri utilizzando incrementi di 10 nanometri. Selezionare una regione fluorescente luminosa sulla cella. Aggiungi la media del ROI fluorescente come intensità normalizzata al database spettrale facendo clic su Salva spettri nel database.

Ottimizza la potenza e il guadagno del laser in modo tale da ottenere un buon rapporto segnale/rumore. Le impostazioni variano a seconda dell'apparecchiatura. Ripeti il processo per le cellule che esprimono Venere e rimani in modalità spettrale.

Utilizzare una frequenza di eccitazione di 488 nanometri invece di 458 nanometri. Regolare le impostazioni di potenza secondo necessità, ma non modificare le frequenze di emissione. Seleziona un ROI fluorescente luminoso di circa un raggio di 20 pixel.

Aggiungi la media del ROI fluorescente come intensità normalizzata al database spettrale, facendo clic su Salva spettri nel database. Per acquisire le immagini non mixate, prima cambia la modalità di acquisizione su unmixing spettrale. Aggiungi le impronte spettrali di venere e mTFP1 ai canali di non miscelazione.

Riportare il laser di eccitazione su una sorgente di argon a 458 nanometri. Posizionare il piatto di visualizzazione del sensore di tensione Nesprin sopra l'obiettivo dell'olio 60X. Dopo aver messo a fuoco una cella fluorescente con un'espressione sufficientemente luminosa, regolare il guadagno e la potenza del laser per ottimizzare il rapporto segnale/rumore.

Cattura un minimo di 15-20 immagini di celle del sensore di tensione di nesprin con luminosità relativamente simile ed evita un'eccessiva saturazione dei pixel. Ripetere il processo di acquisizione delle immagini con le cellule nesprin senza testa utilizzando parametri di imaging identici. Qui viene mostrata un'immagine rappresentativa ingrandita 10X di fibroblasti 3T3 trasfettati con sensore di tensione nesprin utilizzando un vettore mediato dai lipidi.

In genere, solo una frazione di cellule viene trasfettata in un dato campo visivo. Qui è mostrata una coppia rappresentativa di due nuclei 3T3 che esprimono nesprin-TS nei canali spettralmente non miscelati di Venere e mTFP. Un'immagine a colori unita dei due canali viene mostrata nel pannello all'estrema destra.

Ecco un campione rappresentativo di nuclei mascherati di nesprin-TS da cellule MDCK ad espressione stabile su substrati patterned e unpatterned. Le immagini del rapporto sono definite come il rapporto tra il canale di Venere diviso per il canale mTFP e possono essere utilizzate per effettuare confronti quantitativi relativi delle forze. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in circa otto ore se eseguita correttamente.

Durante il tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di etichettare attentamente le provette di DNA durante la trasfezione e di mantenere costanti i parametri di imaging durante l'acquisizione delle immagini dei risultati spettrali. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come trasfettare le cellule con il sensore di tensione nesprin e acquisire immagini risolte spettralmente nell'indice FRET del computer correlato alla forza sul sensore di tensione. Sebbene in questo caso venga utilizzato un sensore FRET per la nesprina, può essere applicato anche ad altre proteine della cellula in cui si desidera misurare la forza.