Name: Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-26T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 35 s
Description: Impara l'iniezione nella vena porta epatica per studiare le metastasi del cancro al seno nel fegato murino. Questo metodo consente di analizzare le fasi avanzate della cascata metastatica in vivo.

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Gli autori ringraziano Alexandra Quackenbush per l'assistenza alle procedure chirurgiche durante le riprese del protocollo video, Hadley Holden per il supporto istologico, Sonali Jindal per l'input sulla patologia tumorale ed epatica durante lo sviluppo del metodo e Breanna Caruso per la revisione critica del manoscritto. Le cellule tumorali mammarie D2A1 e D2.OR sono state un dono della dottoressa Ann Chambers, le cellule tumorali D2A1-GFP sono state un dono del dottor Jeffrey Green e le cellule tumorali 4T1 sono state un dono della dottoressa Heide Ford. Per l'imaging è stato utilizzato il nucleo di microscopia ottica avanzata OHSU presso lo Jungers Center. Il lavoro incluso in questo manoscritto include finanziamenti da NIH/NCI NRSA F31CA186524 (a ETG) e NIH/NCI 5R01CA169175 (a PS).

Tutte le procedure di animali in questo articolo sono stati esaminati e approvati dal Oregon Health &amp; Science University Institutional Animal Care e del Comitato Usa. 1. Preparazione della zona e strumenti chirurgici <ol><li> Preparate le forbici, pinze, e emostatico in autoclave a 124 ° C per 30 minuti, 1 - 2 giorni prima ambulatori programmati. Garantire l&#39;accesso alla biancheria da letto autoclavato o sterili, gabbie, e cibo per il recupero post-chirurgico. </li><li> Preparare una zona chirurgica asettica, preferibilmente in una cappa a flusso laminare. <ol><li> Pulire tutte le superfici della zona chirurgica con 10% di candeggina, compreso il rilievo di riscaldamento, fonte di luce, tubi anestesia e cono, e qualsiasi altra parte della suite chirurgica che sarà in prossimità della procedura chirurgica mentre viene eseguita . </li><li> Nell&#39;area chirurgica asettica, posizionare il rilievo di riscaldamento puliti con garza sterile, fonte di luce, tubi di anestesia e nosecone, siringhe da insulina, 1 ml siringhe, bupivacaina, lacrime artificiali, soluzione salina sterile, 2 x 2 &quot;spugne di garza sterile, 4 x 4&quot; garza sterile, tagliati garza emostatica in 0,5-1 cm 2 pezzi, forbici, pinze, emostatico, 4-0 punti di sutura Vicryl con l&#39;ago cono, e 50 ml 2% clorexidina gluconato in un contenitore autoclave. </li><li> Assicurarsi che ci sia spazio in questo spazio per le cellule tumorali preparati memorizzati su ghiaccio. </li><li> In panchina adiacente all&#39;area chirurgica, preparare l&#39;area di recupero con una seconda piastra elettrica e gabbie pulite con biancheria da letto sterile. NOTA: Questa zona può anche oggetti di casa, come uno sterilizzatore tallone. </li></ol></li></ol> 2. Portal Vein Injection <ol><li> Un&#39;ora prima delle iniezioni pianificate, trattare Balb / c topi di sesso femminile di età compresa tra 8 - 15 settimane con 100 ml di 0,015 mg / ml buprenorfina, per via sottocutanea, per la gestione del dolore. NOTA: Questo protocollo iniezione può essere applicato a qualsiasi ceppo di topo femmina o maschio a qualsiasi età, utilizzando l&#39;appropriatolinee cellulari di modifica del ceppo. </li><li> Preparare le cellule tumorali per iniezione basati su protocolli per la linea cellulare o tumore espianto di scelta. Testare tutte le linee cellulari tumorali prima della somministrazione per la presenza di patogeni murini per ridurre il rischio di introdurre tali patogeni nella colonia animale. <ol><li> Per le linee cellulari tumorali Balb / c singenici tra cui D2A1, D2.OR, e le cellule tumorali 4T1, le cellule disgelo in una piastra di coltura tissutale 10 cm 3 giorni prima dell&#39;iniezione in modo tale che le seguenti cellule giorno sono a ~ 90 - 100% di confluenza. </li><li> Lavare le cellule disgelo cellule tumorali dopo 1 giorno, una volta con 1x tampone fosfato salino (PBS) e trypsinize cellule confluenti tumorali utilizzando 2 ml di 0,05% tripsina a 37 ° C per 5 min. Aggiungere 8 ml di completo supporti (DMEM alto glucosio, 10% di siero bovino fetale, 2 mM L-glutammina, penicillina e 1x / streptomicina) ed il passaggio 01:10 in un fresco 10 centimetri piatto con 10 ml di completo media. </li><li> Il giorno delle iniezioni, lavare le cellule una volta con PBS 1x e trypsinize come descritto sopra. </li><li> Risospendere le cellule trypsinized in 8 ml di completo supporto centrifugare per 5 min a 1500 xg, rimuovere il supporto e risospendere in 5 ml di PBS 1X. </li><li> Contare le cellule su un emocitometro utilizzando esclusione trypan blu per la valutazione vitalità. Risospendere le cellule per l&#39;iniezione in 1x PBS ad una concentrazione predeterminata e volume. NOTA: 5 - 10 ml è raccomandato come volumi di iniezione più piccole evitare inutili danni al fegato. </li><li> Mantenere le cellule in ghiaccio per la durata delle iniezioni. A seguito del completamento delle iniezioni, restituire un campione di cellule al laboratorio e posto nella cultura in completa dei media per 1 giorno a garantire la redditività. </li></ol></li><li> Posizionare il mouse in anestesia: 2 - 2,5% isoflurano (2-cloro-2- (difluorometossi) -1,1,1-trifluoro-etano) erogata in ossigeno. Mantenere la temperatura corporea con il pad di riscaldamento. Garantire la completa anestesia valutando per una reazione ad un pizzico dito del piede, e poi mantenere anestheSIA a 2 - 2,5% isoflurano. NOTA: E &#39;importante monitorare gli animali tasso di respirazione e regolare la portata isoflurano di conseguenza tutta la procedura. </li><li> Mettere una piccola quantità di lacrime artificiali o veterinario pomata sopra ogni occhio per evitare un eccessivo essiccamento degli occhi durante la procedura chirurgica. </li><li> Posizionare il mouse in posizione supina, sul dorso con l&#39;addome esposto. </li><li> Rimuovere capelli sul lato sinistro ventrale del roditore dal secondo spazio costola fino al 4 ° inguinale capezzolo ghiandola mammaria pulendo la zona con depilatoria chimica. Lasciare che il depilatoria a sedere per 1-2 minuti e poi rimuovere completamente con garza e H 2 O. Questo passaggio può essere fatto 1 - 2 giorni in anticipo per risparmiare tempo se numerosi interventi chirurgici sono in programma. </li><li> Prendere una 2 x 2 &quot;garza sterile (imbevuta di 2% clorexidina) e pulire il mouse sul sito di depilazione. Sterilizzare l&#39;area intera circostante, compresa la coda, per minimizzare cont battericaamminazione di strumenti. </li><li> Pulire il sito di rimozione dei capelli e la zona circostante verso il basso con un tampone di alcool prep. </li><li> Ripetere 2% clorexidina e passaggi alcool ancora una volta e finire con un clorexidina finale pulire giù per un totale di tre 2% clorexidina e due lavaggi alcol prep pad. Non la clorexidina finale pulire in modo tale che la sostanza chimica non è gocciolante attorno al sito chirurgico per evitare di clorexidina sugli organi interni. NOTA: Applicazione di grandi quantità di clorexidina e alcool alla pelle e pellicce circostante può provocare un calo significativo della temperatura corporea. Non pulire con eccesso di volume durante le fasi di 2.7-2.9. Mantenere la temperatura corporea con una piastra elettrica. </li><li> Utilizzando guanti sterili e un bisturi sterilizzato con lama sterile, fare una singola incisione 1 pollice nella pelle tra i piani mediani e sagittale sul lato sinistro del mouse, partendo appena sotto le costole e termina appena sopra il piano della quarta inguinale mammaria capezzolo della ghiandola. </li><li> Utilizzando forbici e pinze in autoclave o tallone sterilizzati, fare una simile 1 pollice incisione nel peritoneo. Evitare di tagliare nel cuscinetto di grasso mammaria e garantire di non tagliare l&#39;intestino, fegato, o il diaframma. </li><li> Inserire un &quot;garza 4 x 4 imbevuto in soluzione fisiologica sterile sul lato sinistro del mouse, in cui è stata fatta l&#39;incisione, in modo tale che gli organi interni possono essere immessi sul garze e non entrano in contatto con la pelle circostante o area chirurgica. </li><li> Preparare le cellule tumorali pipettando su e giù più volte come le cellule tumorali si depositerà durante la preparazione del mouse. Preparare un 25 microlitri rimovibile ago della siringa e l&#39;ago 32-gauge con le cellule tumorali. Premere sulla siringa fino cellule tumorali sono sulla punta dell&#39;ago e lo stantuffo è al volume adeguato di iniezione; evitare l&#39;iniezione di bolle d&#39;aria. </li><li> Pulire l&#39;esterno dell&#39;ago con un tampone di alcool sterile per eliminare cellule tumorali esterni. Usare cautela per evitare punture. </li><li> Tenere il sid medianae dell&#39;incisione, compresa la pelle e fodera peritoneale, da parte con le pinze e utilizzare un tampone di cotone sterile per tirare con attenzione i grandi e piccoli intestini fuori, mettendoli sulla garza sterile imbevuta di soluzione salina sterile. Estrarre grandi e piccoli intestini fino a quando la vena porta viene visualizzato. </li><li> Coprire gli organi interni della soluzione salina garza imbevuta di mantenere l&#39;umidità interna e la sterilità. </li><li> Avere un assistente, indossando anche guanti sterili, tenere gli intestini avvolti nella soluzione salina garza imbevuta leggermente fuori del modo con un cotone sterile punta tampone per rivelare appieno la vena porta. Inoltre, può essere necessario utilizzare all&#39;emostato o pinze autoclavato per tenere il tessuto parte sul lato mediano del incisione. </li><li> Inserire l&#39;ago caricato con cellule tumorali ~ 3 - 5 mm nella vena porta ~ 10 mm sotto il fegato con un angolo &lt;5 ° alla vena, con smusso rivolto verso l&#39;alto. Iniettare lentamente il volume completo contenente le cellule tumorali. Permettere al sangue di fluire oltre l&#39;ago head per alcuni secondi per evitare il riflusso di cellule tumorali di vena. Ridurre il movimento dell&#39;ago nella vena durante l&#39;iniezione. Anche in questo caso, fare attenzione per evitare punture. NOTA: Visualizzazione della vena porta avviene senza ingrandimento, tuttavia un microscopio stereo può essere utilizzato se si preferisce. </li><li> Rimuovere l&#39;ago e contemporaneamente mettendo un cotton-fioc sterili sulla vena con la pressione. Con l&#39;assistente ancora in mano l&#39;intestino da parte mettere un pezzo di 0,5-1 cm 2 emostatico garza sul sito di iniezione in vena. NOTA: polvere Hemostatic è stato anche tentato per questo passo nel protocollo, ma non è stato efficace nel fermare la perdita di sangue venoso dopo l&#39;iniezione. </li><li> Tenere la garza emostatico al sito di iniezione con una pressione da una sterile, cotton-fioc per 5 min. </li><li> Valutare chiusura della vena sollevando attentamente la garza emostatica, se i bastoncini garza al tessuto circostante, una piccola quantità di sterile soluzione salina può essere utilizzato per assorbire e sollevare la garza. </li><li> Se si verifica perdita di sangue in questo momento, posizionare un pezzo aggiuntivo di garza emostatica al sito con pressione per altri 5 min. Quando il flusso di sangue è completamente cessata, rimuovere la garza dal mouse. NOTA: La perdita di sangue durante la procedura chirurgica deve essere attentamente valutato e se il volume totale consentita la perdita di sangue è raggiunto o superato (basato su procedure operative standard normativi per commissioni di revisione istituzionali del sperimentatore) il mouse deve essere eutanasia mentre sotto anestesia da perfusione cardiaca. </li><li> Una volta che il sito di iniezione è considerato integro, senza il sangue dal sito di iniezione, posizionare gli organi interni delicatamente nella cavità addominale. </li><li> Suturare il rivestimento peritoneale e quindi la pelle con sterile sutura 4-0 Vicryl e ago cono utilizzando un semplice modello continuo o interrotto di sutura. Tipicamente, chiudendo l&#39;incisione richiede 10-15 suture. </li><li> Iniettare 100 ml di bupivacaine (5 mg / ml) lungo il sito di incisione per la gestione del dolore locale utilizzando una siringa da insulina. Iniettare 0,5 ml di soluzione fisiologica sterile per via sottocutanea con una siringa da 1 ml con ago 26-gauge per l&#39;idratazione. Ambulatori impiegano 15 - 25 minuti per completare. </li><li> Per mantenere condizioni di sterilità durante l&#39;intervento chirurgico, in modo che tutti gli strumenti ei materiali che entrano in contatto con il mouse, tra cui le mani guantate, vengono pulite adeguatamente prima del contatto. Dove possibile uso di materiali sterili e guanti, o minimamente utilizzano una soluzione di etanolo al 70% o soluzione di candeggina al 10% per pulire. </li><li> Se più interventi chirurgici sono previsti per una singola sessione di rifare l&#39;area chirurgica iniziale con drappeggio fresco sterili, siringhe da insulina, 1 ml siringhe, soluzione fisiologica sterile, &quot;spugne sterili garza, 4 x 4&quot; 2 x 2 garza sterile, garza emostatica tagliato a 0,5 - 1 cm 2 pezzi, 4-0 punti di sutura Vicryl con ago cono, e il 2% clorexidina. Bead-sterilizzare le forbici, pinze, e emostatico in mezzo ambulatori e consentireraffreddare adeguatamente prima del riutilizzo. </li></ol> 3. Recupero, Monitoraggio del roditore salute e analisi end-point <ol><li> Dopo l&#39;intervento chirurgico è completa, di mantenere topi su una piastra elettrica per il recupero in libera biancheria da letto-, gabbie da un minimo di 20 min. I topi di solito prendere 2 - 4 minuti a svegliarsi dall&#39;anestesia. </li><li> Non restituire un animale che ha subito un intervento chirurgico per la convivenza con altri animali fino a quando non ha pienamente recuperato da anestesia. Non lasciare un animale incustodito mentre si sta riprendendo coscienza e monitorare fino a quando l&#39;animale ha riacquistato la capacità di mantenersi in decubito sternale. </li><li> Dare topi 0,05-0,1 mg / kg di buprenorfina per la gestione del dolore ogni 6-12 ore dopo l&#39;intervento, per un massimo di 72 ore. </li><li> Controllare suture quotidianamente per garantire che rimangono intatti durante la guarigione. Nel caso in cui le suture venire annullata, posizionare il mouse in anestesia, rimuovere punti di sutura rimanenti, e sostituire. In caso di infezione o inflammzione consultare il personale veterinario. NOTA: infezione o infiammazione non è stato riscontrato con questo protocollo. </li><li> Per gli studi di metastasi, di eseguire controlli sanitari ogni giorno fino a quando sono stati osservati segni esteriori della malattia metastatica compresi, ma non limitati a:&gt; peso del 10% di perdita / guadagno, scruffiness, perdita di attenzione a un ambiente, addominali edema / ascite, occhi chiari e le orecchie, o una posizione ricurva. NOTA: controlli sanitari quotidiani sono particolarmente importanti quando si sviluppa il modello per l&#39;uso con una nuova linea di cellule o la concentrazione delle cellule fino a quando la linea temporale di metastasi è ben compreso. </li><li> Alla studio end-point, eutanasia topi da CO 2 inalazione seguita da dislocazione cervicale. NOTA: I metodi alternativi di eutanasia approvato dal comitato di sorveglianza degli investigatori può essere utilizzato, tra cui la perfusione con PBS 1x mentre sotto anestesia. Perfusione del fegato viene eseguita cannulating la vena porta, snipping la vena cava inferiore e spingendo 1x PBS thruvida la vascolarizzazione fegato ad una velocità di 4 ml / min per 1 - 2 minuti per rimuovere il sangue e leucociti circolanti. NOTA: A seconda del punto finale per lo studio, la linea cellulare, e la concentrazione utilizzata, palese metastasi epatiche può o non può essere evidente a necroscopia. Le lesioni micrometastasi possono essere rivelati con l&#39;analisi istologica del fegato. Gli endpoint variano in base al disegno dello studio. </li><li> Estrarre il fegato con le forbici e pinze rimuovendo prima la colecisti, poi tagliare la vena cava inferiore superiore al fegato. Tagliare la vena cava, vena porta e dell&#39;arteria epatica inferiore al fegato. </li><li> Rimuovere il fegato intero delicatamente e lavare 5x in 1x PBS. </li><li> Separare il fegato in a sinistra, a destra lobi, mediana, e caudato. </li><li> fegato correzione formalina nel 10% formalina tamponata neutra per 48 ore agitando a temperatura ambiente. Processo tessuti attraverso una serie di alcoli in crescente concentrazione e xilene; paraffina incorporare il tessuto fisso 71 </sup&gt;. NOTA: In alternativa, il fegato può essere a scatto congelato inserendo tessuti in un cryomold con temperatura di taglio ottimale (OCT) formula e congelamento su pellets di ghiaccio secco sommerso in 95% di etanolo. <ol><li> Utilizzando un microtomo, tagliato in blocco tessuti inclusi in paraffina in modo tale che una dimensione di match-capo del tessuto è rivelato. </li><li> Tagliare cinque sezioni seriali di 4 micron, questo costituisce il primo livello per l&#39;analisi. </li><li> Tagliare 250 micron di tessuto, gettare queste sezioni nei rifiuti. </li><li> A 250 micron tagliare un secondo livello di cinque sezioni seriali 4 micron. </li><li> Ripetere se necessario per sezione attraverso tutto il fegato. Ematossilina e eosina la prima sezione di ogni livello per valutare per le metastasi 72. NOTA: per tessuti a scatto congelato utilizzare un criostato per tagliare sezioni. NOTA: Il rilevamento di malattie micrometastatica richiederà colorazione specifica delle cellule tumorali. </li></ol></li><li> Rimuovere i topi da studio, se non vi è la crescita del tumore al dell&#39;incisione sedersie, come questo indica una perdita di cellule tumorali nella cavità peritoneale dopo l&#39;iniezione. NOTA: Questo problema non è stato osservato. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare e dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti.

Il portale topo modello di iniezione vena Balb / c consente lo studio delle lesioni tumorali mammarie nel fegato in assenza di confusione metastasi multi-organo e in un host completo immunitario competente. Il nostro protocollo è un avanzamento di procedure chirurgiche precedentemente pubblicati che consentono l&#39;accesso alla vena porta per l&#39;iniezione di cellule tumorali direttamente nel fegato 16,55,56. Un avanzamento abbiamo fatto è di ridurre significativamente il numero di cellule tumorali iniettate da ≥ 1 x 10 5 cellule / iniezione 16,55,56 fino a ≤ 10.000 cellule tumorali / iniezione. Abbiamo inoltre ampliato il modello per lo studio delle metastasi del cancro al seno al fegato. Usando questo protocollo, due linee cellulari di cancro mammario con potenziale metastatico sviluppare metastasi epatiche con una latenza più breve di una linea di cellule tumore mammario più di riposo. Inoltre, in momenti iniziali, le cellule tumorali sono distribuiti in tutto il parenchima epatico come gruppi singoli o piccoli unici ceLLS dopo l&#39;iniezione delle cellule tumorali. Il modello è pronta ad affrontare le questioni di efficienza metastatico tra cui stravaso cellule tumorali, la sopravvivenza delle cellule, dormienza, e la proliferazione - tutti i fenotipi che contribuiscono allo sviluppo della malattia metastatica micro-metastatico e palese nel fegato. È importante considerare numerosi aspetti del protocollo di iniezione vena prima di iniziare studi. decidere con attenzione su linee cellulari, la concentrazione cellulare, il numero totale di cellule, e end-point di interesse sulla base di studi esplorativi più piccoli è altamente raccomandato. Inoltre, l&#39;utilizzo di host competenti immunitarie e linee cellulari singenici è della massima importanza per comprendere le interazioni cellula ospite-tumorali. Il mouse di nuova concezione &quot;testa incandescente&quot; che esprime eGFP e luciferasi dalla ghiandola pituitaria anteriore è uno strumento importante per eliminare le risposte di accoglienza per esogeno eGFP e luciferasi, proteine spesso utilizzati per codificare le linee mammaria tumorali 75 </sup&gt;. L&#39;uso del mouse &quot;testa incandescente&quot; e singenici contrassegnata con le cellule tumorali faciliteranno una facile identificazione delle cellule disseminate singole e focolai micrometastatica dalla IHC senza la preoccupazione di risposte infiammatorie a eGFP o luciferasi. Allo stesso modo, scegliendo con cura le strategie di gestione del dolore per garantire anti minimo o impatto pro-tumorale dal regime di trattamento farmacologico è fortemente raccomandato. passaggi critici in questo protocollo sono il mantenimento di condizioni di sterilità durante interventi chirurgici al fine di garantire che l&#39;infezione non si verifica, in modo da confondere alcun risultato. E &#39;anche importante che l&#39;ago sia correttamente posizionato nella vena porta di garantire che le cellule tumorali sono consegnati al fegato. Praticare il protocollo con coloranti come l&#39;India inchiostro aiuterà con questo problema. la crescita del tumore al sito di incisione della pelle è il migliore indicatore che si è verificato il posizionamento dell&#39;ago improprio. Infine, è fondamentale che la perdita di sangue dalla vena porta è adeguatamente controllato e cessa completamente prima suturing l&#39;animale. L&#39;uso di garza emostatica diminuisce notevolmente il rischio di perdita di sangue incontrollata dalla vena porta dopo l&#39;iniezione. Nelle nostre mani, la mortalità correlata procedurale a causa della perdita di sangue dalla vena dopo iniezione è stato ridotto dal 30% al 2% dei topi con l&#39;uso di garza emostatica. È importante notare che il modello iniezione vena non replica il pieno cascata metastatica, ma è limitata allo studio di stravaso cellule tumorali, tumore interazioni cellula-nicchia seguente stravaso e la crescita tumorale. I modelli che replicano con precisione il pieno a cascata metastatica al fegato, come ad esempio si verifica nei pazienti, sono urgentemente necessari. Un&#39;ulteriore limitazione del modello di iniezione vena porta è che si confonde con l&#39;impatto della chirurgia sull&#39;host, con la guarigione delle ferite noti per influenzare la progressione della malattia 76,77. Il modello di iniezione vena porta rappresenta un miglioramento su altre iniezionemodelli per studiare metastasi epatiche, tra cui intracardiaca e modelli intrasplenico. In particolare, il modello di iniezione vena consente lo studio di una gamma più ampia di progressione della malattia rispetto al modello intracardiaco, che è spesso limitata dalla metastasi concomitanti in altri tessuti. Inoltre, il modello vena porta non è complicato dalla rimozione della milza, come avviene nel modello intrasplenico. Il modello di iniezione vena può rivelarsi uno strumento utile per lo studio di metastasi epatiche in generale. metastasi epatiche è il sito più frequente di metastasi in adenocarcinomi complessiva, con tassi particolarmente elevati nel cancro pancreatico (85% delle metastasi sono al fegato), del colon e adenocarcinomi rettali (&gt; 70%), così come lo stomaco e dell&#39;esofago (&gt; 30 %) 1. Sebbene i modelli tumorali primarie spontanee e ortotopici di adenocarcinomi pancreatici e del colon più facilmente metastasi al fegato 78,79, il modello di iniezione vena porta può prove utile per comprendere il processo metastatico di questi tumori come la consegna controllata di cellule tumorali consente valutazioni biochimici, molecolari e istologiche in determinati momenti dopo l&#39;arrivo delle cellule tumorali. In sintesi, il modello iniezione vena porta rappresenta un miglioramento importante modelli metastasi epatiche disponibili per il cancro al seno, e può essere applicata anche al campo di metastasi epatiche in generale.

Breast Cancer metastasi al fegato Il fegato è un luogo comune di metastasi del cancro al seno, insieme a ossa e polmoni 1-3. Metastasi epatiche nei pazienti con cancro al seno è un fattore prognostico indipendente per i risultati molto povere di 4,5, come la sopravvivenza mediana dei pazienti con carcinoma mammario con metastasi epatiche range da 4,8 a 15 mesi 6-9. Al contrario, i pazienti con cancro mammario con polmone o metastasi ossee hanno tassi di sopravvivenza mediana di 9 a 27,4 mesi 8,9 e 16,3 a 56 mesi 8,10-12, rispettivamente. La metastasi è un processo a più fasi, denominato la cascata metastatica, che inizia con la diffusione delle cellule tumorali nel tumore primario e termina con la mortalità paziente per la semina e la conseguenza di cellule tumorali circolanti all&#39;interno di un organo lontana 13-15. modelli di roditori di metastasi hanno rivelato che la cascata metastatica è notevolmente inefficiente, con solo lo 0,02 - 10%di cellule tumorali circolanti che istituisce la metastasi palese 16,17. Un serio ostacolo di inefficienza metastatico è dettata dai microambienti tissutali unici nei siti secondari, chiamati nicchie metastatici 18, mettendo in evidenza l&#39;importanza di comprendere le metastasi site-specific. La nicchia metastatica è univoco per il sito di recidiva, ed è, in parte, caratterizzata dalla deposizione di distinte proteine della matrice extracellulare 19,20, infiltrazione di diverse popolazioni cellulari immunitario 21-23, e omeostasi tissutale alterato compresa la produzione disregolata di numerose citochine, chemochine, fattori di crescita e 15,18,24,25. Così, una comprensione della specifica nicchia metastatica tessuto precede una comprensione di come indirizzare malattia metastatica. Tuttavia, i modelli robusti di metastasi epatiche sono carenti. Inoltre, i modelli migliorati di metastasi epatiche saranno essenziali per identificare nuovi target e trattamenti efficaci per pazienti con cancro mammario wimetastasi epatiche esimo. I modelli per studiare il cancro al seno metastasi al fegato Fondata Attualmente i modelli disponibili per lo studio delle metastasi del cancro al seno al fegato includere xenotrapianti di cellule di cancro umane in topi immunocompromessi. Questi modelli utilizzano in genere linee cellulari ben studiate umane di cancro al seno, come MCF-7 e MDA-MB-231 e nudo, Rag1 - / -, o immuni SCID compromesso host murini 26-29. Modelli di xenotrapianto offrono il vantaggio di coinvolgere linee cellulari tumorali umane derivate, tuttavia, data l&#39;apprezzamento recente per le cellule immunitarie in metastasi 30-32 e nella resistenza terapeutica 33-35, lo studio delle metastasi in un host completo immunitario competente è di primaria importanza. I modelli per lo studio del cancro al seno metastasi al fegato nel sistema immunitario host competenti includono l&#39;iniezione ortotopico di cellule tumorali singenici (ad esempio, 4T1 e linee cellulari D2A1) nel cuscinetto di grasso mammaria, con o senza chirurgiaresezione del tumore primario e successiva valutazione delle metastasi 36-38. Da segnalare, il tasso di metastasi epatiche da modelli di trapianto ortotopico è molto bassa o inesistente rispetto ad altri siti metastatici, come polmone 39,40, o si verifica dopo metastasi polmonari è stabilito, complicando lo studio delle metastasi epatiche specifiche 37,39 . espianti tumore dal modelli di cancro al seno spontanee geneticamente modificati possono essere ri-iniettato nei cuscinetti adiposi mammarie di host ingenuo cellule tumorali singenici. Ad esempio, è stato recentemente riportato che i tumori spontanei da K14 Cre ECAD f / f P53 f / topi F, che modello invasivo carcinoma mammario lobulare, sviluppano tumori quando iniettate in ortotopicamente host di tipo selvatico. Dopo la resezione chirurgica di questi tumori una volta che raggiungono 15 millimetri 2, il 18% dei topi progredito di metastasi epatiche 40,41. Un terzo approccio a modello utilizza metastasi al fegatometastasi spontanea in topi geneticamente ingegnerizzati. Fino ad oggi, i rapporti di modelli murini spontanei di cancro al seno metastasi che prontamente diffuso al fegato sono infrequenti. Le eccezioni includono l&#39;H19-IGF2, la p53 fp / fp MMTV-Cre Wap-Cre, e il K14 Cre ECAD f / f P53 f / f modelli murini geneticamente modificati, in cui metastasi epatiche si sviluppa in una bassa percentuale di topi 38,41- 43. Così, mentre i modelli di topo geneticamente facilitare lo studio di tutte le fasi della cascata metastatica, fornendo modelli potenti e clinicamente rilevanti, si sono limitati a causa di bassi tassi di metastasi epatiche 38. Diversi modelli metastasi bypassare i passi iniziali della cascata metastatica, tra cui la diffusione delle cellule tumorali dal tumore primario e intravasation. Questi modelli permettono indagine sulle fasi successive della cascata metastatica, da stravaso di stabilimento di tumori nei siti secondari. il intModello iniezione racardiac batte cellule tumorali nel ventricolo sinistro, che distribuisce le cellule tumorali nel sistema circolatorio tramite l&#39;aorta. iniezione intracardiaca richiede l&#39;ecografia guidata per immagini del sito di iniezione o di altre modalità di imaging come la bioluminescenza della luciferasi tagged cellule per confermare iniezione di successo. Iniezione delle cellule tumorali attraverso il ventricolo sinistro può causare ossa, cervello, polmone, e / o di metastasi epatiche, tra gli altri organi 44-48. A causa di metastasi multi-organo, questi topi hanno bisogno spesso di essere eutanasia prima dello sviluppo di metastasi epatiche palese, negando la possibilità di indagare a fondo la crescita metastatica nel fegato. Un approccio alternativo che riduce al minimo in modo significativo lo sviluppo di multi-sito di metastasi è il modello di iniezione intrasplenico. Iniezione intrasplenico fornisce cellule tumorali attraverso la vena splenica che si unisce con la vena mesenterica superiore a diventare la vena porta 49,50. Gli animali possono essere monitorati per outgrowth di lesioni metastatiche nel fegato perché la formazione di metastasi in altri siti è raro, e come risultato, la salute generale dell&#39;animale viene mantenuta 49,50. Tuttavia, è importante notare che il modello intrasplenico richiede splenectomia evitare tumori splenici 49,50, una procedura che impatti funzione immunitaria. Ad esempio, infarto del danno da ischemia riperfusione è caratterizzata da infiltrazione di Ly6C + sottoinsiemi monociti che hanno origine dalla milza e sono responsabili della fagocitosi e l&#39;attività proteolitica durante la guarigione delle ferite a seguito di ischemia 51,52. Con la splenectomia, vi è una riduzione osservata nelle popolazioni monociti che aiutano nella guarigione delle ferite 52. Inoltre, la splenectomia ha dimostrato di ridurre la crescita del tumore primario e metastasi polmonari in un modello di tumore polmonare non a piccole cellule, in particolare attraverso la riduzione del numero di circolante e intra-tumorale CCR2 + CD11b + Ly6C + myelo monociticacellule id 53. Inoltre, la splenectomia dopo l&#39;iniezione intrasplenico delle cellule tumorali del colon portato a livelli ridotti di cellule natural killer anti-tumorali nei linfonodi mesenterici e elevata metastasi epatiche 54. In sintesi, questi risultati suggeriscono che la splenectomia compromette il ruolo del sistema immunitario con successive conseguenze per il destino della cellula metastatica. Portal Vein Modello Iniezione di fegato metastasi Per studiare il cancro al seno metastasi al fegato in un host completo immunitario competente, in condizioni in cui i topi non sono compromesse a causa di metastasi multi-organo, un modello di iniezione vena porta è stato sviluppato. Modelli ad iniezione intraportale sono stati utilizzati in precedenza per studiare metastasi del fegato di colorettale 55,56 e melanoma 16 linee di cellule; Qui si descrive l&#39;applicazione dell&#39;iniezione intraportale per modellare singenici mammaria metastasi delle cellule tumorali. Questo modello può essere utilizzato per studiarele fasi successive della cascata metastatica, tra cui il cancro al seno stravaso delle cellule e la semina, le decisioni sul destino delle cellule tumorali per quanto riguarda la morte / proliferazione / dormienza, e escrescenza in lesioni evidenti. In questo modello, linee cellulari tumorali mammarie singenici vengono iniettati attraverso la vena porta di topi femmine Balb / c immunocompetenti, un metodo che fornisce le cellule tumorali in primo luogo e direttamente al fegato senza rimozione della milza. Per sviluppare questo modello, l&#39;uso di quattro linee di cellule tumorali mammarie che variano nella loro capacità metastatica dal basso verso l&#39;alto sono stati impiegati: D2.OR, D2A1, e 4T1, e hanno impiegato D2A1 con i tag proteina fluorescente verde (GFP-D2A1) per indagare in anticipo il tempo-punti dopo l&#39;iniezione delle cellule tumorali. 4T1 è una linea di cellule altamente metastatico derivato dal 410.4 tumore che spontaneamente sorto in un mouse 36,37 MMTV + Balb / c femminile e metastatizza ai polmoni, fegato, cervello e ossa da pad grasso mammario tumori primari 39,57,58. cellule tumorali D2A1 were anche in origine deriva da un tumore mammario spontanea provenienti da uno / c ospite Balb dopo il trapianto di cellule D2 iperplastici nodulo alveolari, e si conferma essere metastatico dal tumore primario al polmone 59,60. Cellule tumorali D2.OR sono una linea sorella non metastatico alla linea D2A1 e, sebbene sfuggire il tumore primario e arrivano a siti secondari, raramente stabiliscono metastasi a distanza 60,61. Inoltre, è importante evitare l&#39;uso di farmaci di gestione del dolore comunemente impiegati compresi i farmaci non steroidei anti-infiammatori (FANS) durante o dopo l&#39;intervento chirurgico. FANS hanno attività antitumorale in alcuni tipi di cancro al seno 62-65, e alcune classi di FANS aumentano il rischio di epatotossicità 66,67, compromettendo potenzialmente lo studio delle metastasi del fegato e la nicchia metastatico del fegato. Inoltre, gli studi suggeriscono che i FANS influenzano direttamente il microambiente del tessuto, riducendo ext pro-metastaticoproteine della matrice racellular tenascin-C 68 e collagene fibrillare 62,65. In alternativa, l&#39;uso di un derivato oppiaceo, buprenorfina, è stato utilizzato per la sua efficacia nel trattamento del dolore roditore 69 a causa della mancanza di prove che gli oppioidi hanno attività antitumorale 70. Questo modello di iniezione vena porta è stato ottimizzato per i piccoli volumi di iniezione di 5 - 10 ml al fine di evitare inutili danni al fegato. Il modello è stato ottimizzato per includere aghi con diametro minore (≥ 32 gauge) e l&#39;uso di garza emostatica immediatamente dopo l&#39;iniezione per ridurre al minimo la perdita di sangue durante la procedura. In contrasto con questi parametri di iniezione ottimizzata, il numero di cellule dovrebbero essere determinati su base individuale, in base al potenziale oncogeno della linea cellulare. Tuttavia, a partire da ≤ 10.000 cellule / iniezione per studi a lungo termine è raccomandato. Per gli endpoint più brevi (ad esempio, 24 ore dopo l&#39;iniezione) notevolmente più cellule tumorali (per esempio,1 x 10 5 - 1 x 10 6) può essere utilizzato se giustificato. In sintesi, il modello iniezione vena dettagliato qui rappresenta un utile strumento per lo studio delle metastasi del cancro al seno al fegato ed elude un certo numero di limitazioni di altri modelli metastasi epatiche. Questo modello facilita lo studio di stravaso di cellule tumorali, la semina, le decisioni destino primi di sopravvivenza, la proliferazione, e dormienza, e escrescenza metastatico in immunitarie host murini competenti.

<table><tbody><tr><td>Siringa da 1 ml con ago calibro 26</td><td>Siringa BD</td><td>309597</td><td>Per iniezione sottocutanea di buprenorfina; prestare attenzione, affilati</td></tr><tr><td>Tamponi per la preparazione dell'alcol</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-669-62</td><td>Per la pulizia dell'addome prima dell'incisione chirurgica</td></tr><tr><td>Spugne per tutti gli usi, sterili</td><td>Kendall</td><td>8044</td><td>4" x 4", utilizzare immerse in soluzione fisiologica sterile per mantenere l'intestino crasso e tenue protetto e idratato durante chirurgia</td></tr><tr><td>Lacrime artificiali</td><td>Rugby</td><td>370114</td><td>Olio minerale 15%, petrolato bianco 83%; utilizzare per proteggere gli occhi durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Buprenorfina HCl, 0,3 mg/ml</td><td>Mfg. di Reckitt Benckiser</td><td>NDC-12496-0757-1</td><td>Utilizzare a 0,05 - 0,1 mg/kg di peso corporeo, 1 - 2 volte al giorno per 72 ore, iniettato per via sottocutanea</td></tr><tr><td>Bupivacaina HCl, 0,5% (5 mg/ml)</td><td>Mfg. di Humira Inc</td><td>NDC-04091163-01</td><td>Utilizzare allo 0,5%, 1 volta subito dopo l'intervento chirurgico, 10 &mu; l iniettato per via sottocutanea nel sito di incisione&nbsp;</td></tr><tr><td>anticorpo anti-CD45</td><td>BD Pharmingen</td><td>550539</td><td>Utilizzare in immunofluorescenza multiplex per escludere i leucociti nell'identificazione di focolai metastatici</td></tr><tr><td>Celox&trade; Garza emostatica rapida</td><td>Medtrade Products Ltd.</td><td>FG08839011</td><td>Tagliare in pezzi da 5 mm&sup2;, utilizzare per fermare il flusso sanguigno fuori dalla vena porta con la pressione dopo l'iniezione</td></tr><tr><td>Depilatorio</td><td></td><td></td> chimico <td>Utilizzare per rimuovere i peli dall'area chirurgica; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Clorexidina, soluzione al 2%</td><td>Vet One</td><td>1CHL008</td><td>Prestare attenzione, non assumere clorexidina nelle mucose o nelle orecchie dell'anticorpo</td></tr><tr><td>anti-CK18</td> del topo <td>Abcam</td><td>ab53118</td><td>Utilizzo in immunofluorescenza multiplex per identificare focolai metastatici</td></tr><tr><td>Applicatori con punta in cotone, sterili</td><td>Fisher Scientific</td><td>23-400-114</td><td>Asta in legno da 6" DMEM 2 pz/busta</td></tr><tr>, <td>HyClone</td><td>ad alto</td> glucosio <td>SH30243.01</td><td>Base per terreni di coltura cellulare per l'uso con linee cellulari di tumore mammario D2A1, D2.OR e 4T1</td></tr><tr><td>Sterilizzatore</td><td></td><td></td> <td>a perline di vetro seccoUtilizzare tra gli interventi chirurgici per sterilizzare strumenti in acciaio inossidabile, prestare attenzione, estremamente caldo; </td></tr><tr><td>Etanolo multiplo, soluzione</td><td></td><td></td> al 70% <td>Usare cautela infiammabile; utilizzare per pulire l'area chirurgica secondo necessità; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Siero fetale</td><td>bovino HyClone</td><td>SH30071.03</td><td>Additivo per terreni di coltura cellulare da utilizzare con linee cellulari di tumore mammario D2A1, D2.OR e 4T1, utilizzare al 10% in garza DMEM ad alto contenuto di glucosio</td></tr><tr><td>,</td><td>Kendall</td><td>2146</td> <td>sterile2" x 2", utilizzare immerso in una soluzione di clorexidina al 2% per la pulizia dell'addome prima dell'incisione chirurgica</td></tr><tr><td>anticorpi anti-proteina fluorescente verde</td><td>Laboratori</td><td>vettoriali BA0702</td><td>Utilizzare per colorare per GFP marcato D2A1 o altre linee cellulari di tumore mammario</td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM (100x)</td><td>Gibco</td><td>25030-081</td><td>Additivo per terreni di coltura cellulare da utilizzare con linee cellulari di tumore mammario D2A1, D2.OR e 4T1, utilizzare a 2 mM (1x) in DMEM Termoforo ad alto contenuto di glucosio</td></tr><tr><td>, x 2 - 3</td><td></td><td></td><td>Utilizzare per mantenere il calore corporeo durante l'intervento chirurgico e il recupero; più fornitori</td></tr><tr><td>Emocitometro</td><td>Hausser Scientific</td><td>1483</td><td>Per l'uso in colture cellulari per contare le cellule</td></tr><tr><td>Pinze</td><td></td><td></td> emostatiche <td>Acciaio inossidabile; più fornitori</td></tr><tr><td>anticorpo anti-Heppar-1</td><td>Dako</td><td>M7158</td><td>Uso in immunofluorescenza multiplex per escludere gli epatociti nell'identificazione di focolai metastatici</td></tr><tr><td>Siringa da insulina, 0,3 ml, 29 gauge</td><td>BD&nbsp; &nbsp;</td><td>324702 Per l'iniezione</td> di <td>bupivacaina nel sito di sutura; prestare attenzione, affilato</td></tr><tr><td>Isoflurano</td><td>Piramal</td><td>NDC-66794-017-25</td><td>Somministrato al 2,5%</td></tr> <tr><td>Vaporizzatore di isoflurano</td><td>VetEquip</td><td>911103</td><td>Prestare attenzione, vaporizza i gas anestetici Fonte</td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> di luce <td>Utilizzare per visualizzare il campo chirurgico; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Formalina tamponata neutra, 10%</td> <td>Anatech Ltd.</td><td>135</td><td>Uso cautela, tossico; uso come fissativo tissutale per gli endpoint di metastasi e valutazione del carico metastatico mediante istologia</td></tr><tr><td>Opal&trade; kit fIHC a 4 colori</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL794001KT</td><td>Utilizzare per l'immunofluorescenza multiplex di Heppar-1/CD45/CK18 per rilevare metastasi nel fegato murino</td></tr><tr><td>Forbici</td><td></td><td></td> operatorie <td>Acciaio inossidabile; usare cautela, affilato; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Penicillina/Streptomicina, 100x</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Additivo per terreni di coltura cellulare per l'uso con linee cellulari di tumore mammario D2A1, D2.OR e 4T1, utilizzare a 1x in DMEM soluzione</td></tr><tr><td>salina tamponata con fosfato ad alto glucosio</td><td></td><td></td><td>Utilizzare a 1x per la risospensione delle cellule tumorali prima dell'iniezione, più fornitori</td></tr><tr><td>Siringa ad ago rimovibile, 25 &mu; l, Modello 1702</td><td>Hamilton</td><td>7654-01</td><td>Per iniezione nella vena porta; prestare attenzione, in particolare quando si lavora con aghi caricati con cellule tumorali, affilati quando l'ago è attaccato</td></tr><tr><td>Manico</td><td></td><td></td> del bisturi <td>Acciaio inossidabile; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Lama del bisturi, #15</td><td></td><td></td><td>Acciaio al carbonio, sterile, misura 15; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Aghi rimovibili con mozzo piccolo, calibro 32</td><td>Hamilton</td><td>7803-04</td><td>Per iniezione nella vena porta, lunghezza 1", tipo di punta 4, 12&deg; angolare, possono essere utilizzati anche aghi riutilizzabili calibro da 33 a 34; prestare attenzione, in particolare quando si lavora con aghi caricati con cellule tumorali, affilati</td></tr><tr><td>Ipoclorito</td><td></td><td></td> di sodio <td>Usare cautela, corrosivo; utilizzare al 10% per disinfettare l'area di lavoro e le superfici, più fornitori</td></tr><tr><td>Soluzione salina sterile</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td>0,9% NaCl; in alternativa, può essere fatto in casa e filtrato sterile</td></tr><tr><td>Guanti chirurgici, Sterile</td><td></td><td></td><td>Fornitori multipli</td></tr><tr><td>Suture sterili</td><td>Ethicon</td><td>J310H</td><td>4-0 27" rivestito vicryl con ago in ethalloy conico da 22 mm 1/2c; utilizzare cautela, affilato</td></tr><tr><td>Macchina per anestesia portatile da tavolo</td><td>VetEquip</td><td>901801</td><td>Utilizzare con vaporizzatore isoflurano per anestesia del topo</td></tr><tr>Pinze <td></td><td></td> per<td>medicazione del pollice</td><td>Acciaio inossidabile, seghettato, smussato; fornitori multipli</td></tr><tr><td>Tende per asciugamani, sterili</td><td>Dynarex</td><td>4410</td><td>18" x 26", per coprire il termoforo e fornire uno spazio di lavoro sterile durante l'intervento chirurgico</td></tr><tr><td>Trypan Blue</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Per l'uso in colture cellulari per valutare la vitalità, utilizzare 1:1 con cellule in 1x PBS</td></tr><tr><td>Tripsina/EDTA, 0,05% (1x)</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>Uso in coltura cellulare per staccare le cellule tumorali dalle piastre di coltura tissutale</td></tr></tbody></table>

un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

A Portal Vein Injection Model to Study Liver Metastasis of Breast Cancer

Il cancro al seno è la principale causa di mortalità per cancro nelle donne in tutto il mondo. metastasi epatiche è coinvolto in rialzo del 30% dei casi con metastasi del cancro al seno, e si traduce in scarsi risultati con tassi di sopravvivenza mediana di soli 4,8-15 mesi. modelli di roditori attuali di metastasi del cancro al seno, tra cui primario xenotrapianto di cellule tumorali e modelli tumorali spontanei, raramente metastatizzano al fegato. modelli di iniezione intracardiaca intrasplenico e non provocano metastasi epatiche, ma questi modelli possono essere confusi da concomitante secondaria loco metastasi, o immunità compromessa a causa di rimozione della milza per evitare la crescita del tumore al sito di iniezione. Per affrontare la necessità di migliorare i modelli metastasi epatiche, un metodo di iniezione vena porta murino che fornisce le cellule tumorali in primo luogo e direttamente al fegato è stato sviluppato. Questo modello fornisce cellule tumorali al fegato senza complicazioni di metastasi simultanee in altri organi o rimozione della milza. l&#39;optimized protocollo vena porta impiega piccoli volumi di iniezione di 5 - 10 ml, ≥ 32 aghi calibro, e emostatico garza al sito di iniezione per il controllo per la perdita di sangue. La vena approccio iniezione portale in Balb / c femmine di topo utilizzando tre singenici linee tumorali mammarie di varia potenziale metastatico è stata testata; cellule di alta-metastatico 4T1, cellule D2A1 moderata-metastatici, e le cellule D2.OR bassa metastatico. Le concentrazioni di ≤ risultati 10.000 cellule / iniezione in una latenza di ~ 20 - 40 giorni per lo sviluppo di metastasi epatiche con il più alto metastatico 4T1 e D2A1 linee, e&gt; 55 giorni per la linea D2.OR meno aggressivo. Questo modello rappresenta un importante strumento per lo studio del cancro al seno metastasi al fegato, e può essere applicabile ad altri tumori che spesso metastatizzano al fegato tra cui colon-retto e adenocarcinomi pancreatici.

Il modello di iniezione vena porta, in cui le cellule tumorali vengono consegnati direttamente al fegato tramite una procedura chirurgica, consente per l'iniezione delle cellule tumorali nella vena porta. In condizioni antisettiche, in un mouse anestetizzato, incisione chirurgica a ~ 1 pollice è realizzata sul lato sinistro del mouse tra i piani mediani e sagittale, partendo appena sopra il piano della quarta inguinale tettarella ghiandola mammaria e termina appena sotto le costole . I grandi e piccoli intestini sono delicatamente tirato attraverso l'incisione per fornire la visualizzazione della vena porta (Figura 1A). Accurata individuazione anatomica della vena porta e di successo iniezione intra-portale può essere confermata con la pratica del protocollo di iniezione con l'India inchiostro o un colorante simile. Iniezione corretto attraverso la vena porta comporterà l'inchiostro trasmesso immediatamente e specificamente al fegato, e non comporta spread china al polmone (Figure 1B). Inoltre, utilizzando le cellule tumorali mammarie D2A1 del mouse taggati con GFP, la dispersione delle cellule tumorali in tutto il fegato è evidente a novanta minuti dopo l'iniezione, confermando portale consegna iniezione vena al fegato (Figura 1C). A maggiore ingrandimento diventa evidente che a 90 min dopo l'iniezione, le cellule tumorali si trovano all'interno sinusoidi, così come all'interno del parenchima epatico in prossimità di triadi portali, dove il sangue vena entra nel fegato (Figura 1C). Questi dati suggeriscono che lo stravaso delle cellule tumorali attiva si sta verificando a iniezione cellula post-tumorale 90 min. Presi insieme, questi dati confermano che il modello iniezione vena porta trasporta il volume di iniezione direttamente al fegato, con le cellule tumorali inchiostro o dispersi nel fegato e non apprezzabile trasporto di volume di iniezione al polmone. Per valutare la robustezza del modello di iniezione vena porta, tre SEPARate linee di cellule tumorali mammarie del mouse singenici sono stati testati in adulti di sesso femminile topi BALB / c. Queste linee tumorali mammarie sono stati selezionati in base al loro comportamento caratterizzato modelli pad grasso mammario e comprendono la 4T1 linea molto aggressiva e metastatica delle cellule, la linea D2A1 metastatico meno aggressivo, e la linea D2.OR basso / non-metastatico 37,61,73 , 74. 2.000 e 10.000 cellule per iniezione sono stati testati con differenze notevoli nella tempo allo sviluppo di metastasi palese con queste concentrazioni di cellule basse. Per questi studi indicatori surrogati di metastasi sono stati usati come la mancanza di grooming, pallore, e perdita di peso per giustificare autopsia, su cui la presenza o assenza di metastasi epatiche sono stati confermati dalla valutazione visiva del fegato e altri organi per confermare la consegna intra-portal . Questi dati confermano precedenti relazioni che le linee di cellule 4T1 e D2A1 rappresentano linee di tumore mammario più aggressive, come si osservano tassi di sopravvivenza libera più breve metastasi rispetto ai topi iniettaticon la linea D2.OR meno aggressivo (Figura 2A). I topi iniettati con cellule 4T1 o D2A1 tumorali sviluppato metastasi epatiche palesi in ~ 30 - 40 giorni dopo l'iniezione, e un po 'di metastasi sviluppata già a 18 giorni dopo l'iniezione (Figura 2A), mentre solo un mouse iniettati con cellule D2.OR aveva sviluppato metastasi epatiche palesi, a fine studio, che è stato di 60 - 65 giorni iniezione cellula post-tumorale. Le metastasi sono stati successivamente confermati sezionando attraverso il fegato in 250 micron livelli e analizzare ematossilina e eosina (H &amp; E) sezioni colorate (Figura 2B-D). Oltre al rilevamento delle lesioni metastatiche evidenti nel fegato di topo, il modello vena porta può anche essere utilizzata per studiare gli eventi precedenti nella cascata metastatica incluso il rilevamento di cellule singole / gruppi di cellule dopo stravaso, e formazione di lesioni micro-metastatico. Multiplex immunofluorescenza-colorazione è stata utilizzataper rilevare 4T1, D2A1, e le cellule tumorali mammarie D2.OR nel fegato quando sono presenti come singole cellule o lesioni micro-metastasi, come H &amp; E non è sufficiente a confermare la presenza di piccole lesioni. La figura 3A mostra un fegato di topo Balb / c rappresentante con un foci micrometastatica putativo di cellule tumorali D2A1 che sono positivi per la epiteliale cheratina CK18, negativo per il marcatore CD45 pan-immuni, e negativo per il marcatore epatociti Heppar-1. Gli epatociti anche macchia positivo per CK18, che richiede l'uso di Heppar-1 in questo pannello colorazione. Una nota importante è che le cellule epiteliali del dotto biliare e progenitrici epatiche macchia positivo per CK18, che richiedono un'attenta discriminazione tra cellule tumorali e vie biliari, in particolare in sede di valutazione regioni periportali (Figura 3A). Un'alternativa al multiplex immunofluorescenza per identificare le cellule disseminate singole e foci micrometastasi è quello di utilizzare singenici linee tumorali mammarie taggati con maggiore verde fluorescenteproteine (eGFP) e / o luciferasi ed eseguire IHC per il tag (Figura 1C). A causa della immunogenicità di eGFP, luciferasi, e altre proteine, è indispensabile utilizzare modelli murini che sono controllo tolleranti a queste proteine, come il romanzo immunitario competente mouse "testa incandescente" che esprime eGFP e luciferasi nella ghiandola pituitaria anteriore 75. Per l'identificazione delle lesioni macrometastatic di linee singenici senza tag come la linea D2A1 tumore, la immunofluorescenza multiplex CK18 / Heppar-1 / CD45 è ideale (Figura 3B). <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig1.jpg"> Figura 1: Portal Vein Injection trasporta cellule tumorali direttamente al fegato. A) Portal iniezione vena; l'incisione viene fatta tra la mediana e sagittale sinistra, da sopra il piano della quarta inguinale tettarella ghiandola mammaria e termina appena sotto la rib gabbia. B) Balb / c fegato con iniezione PBS (a sinistra). Dopo l'iniezione di inchiostro India attraverso la vena porta, il fegato (al centro), ma non il polmone (a destra) prende l'inchiostro. C) immagini sezione sottile rappresentativi di cellule tumorali mammarie D2A1 topo contrassegnate con GFP in un / c fegato di topo Balb a 90 min dopo l'iniezione di 1 x 10 6 cellule tumorali attraverso la vena porta. I fegati sono stati fissati in formalina, inclusi in paraffina, sezionati, e colorati con anticorpo anti-GFP per il rilevamento delle cellule tumorali. Pannello superiore mostra le cellule tumorali marrone scuro macchiato (frecce) sparsi per il fegato, asterisco denota non specifica colorazione epatociti intorno vene centrali; barra della scala = 300 micron. pannelli inferiori mostrano immagini rappresentative di cellule tumorali a 90 minuti dopo l'iniezione ancora strettamente associato con vascolare; barra della scala = 50 micron. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <pclass fo: keep-together.within-page='"1"&gt;' alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig2.jpg"></pclass> Figura 2: conseguenza del mouse tumore mammario linee cellulari nel fegato seguito vena porta di iniezione. A) di Kaplan-Meier curva che mostra i tassi di sopravvivenza libera da metastasi nei topi iniettati con 2000-10000 cellule 4T1, D2A1, o D2.OR il mouse tumore mammario. I topi sono stati iniettati con cellule tumorali e monitorati per segni di metastasi, tra cui la mancanza di governare, occhi chiari, e variazioni di peso. Metastasi è stata confermata al momento della necroscopia e da H &amp; E su sezioni istologiche del fegato. N = 2 4T1 2.000 cellule; 2 4T1 10.000 cellule. N = 2 D2A1 2.000 cellule; 3 D2A1 10.000 cellule. N = 3 D2.OR 2.000 cellule; 3 D2.OR 10.000 cellule. Rappresentante H &amp; E le immagini di B) 4T1 lesioni a 21 giorni dopo l'iniezione di 10.000 cellule, C) lesioni D2A1 a 26 giorni dopo l'iniezione di 10.000 cellule tumorali, e D) lesioni D2.OR a59 giorni dopo l'iniezione di 10.000 cellule; barre di scala = 75 micron. Lesioni simili sono stati osservati quando 2.000 cellule 4T1 o D2A1 tumorali sono state iniettate. Non lesioni sono stati rilevati con 2.000 celle D2.OR. Nessuna evidenza di metastasi in altri organi o al sito di incisione chirurgica era evidente in qualsiasi mouse su questi studi. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54903/54903fig3.jpg"> Figura 3: Rilevamento di singole cellule e metastatici lesioni nel fegato mouse utilizzando Multiplex immunofluorescenza. A) multiplex immunofluorescenza Rappresentante delle cellule tumorali in D2A1 a / c fegato di topo Balb a 90 minuti dopo l'iniezione utilizzando il modello di iniezione vena porta. La colorazione è stata effettuata utilizzando un kit multiplex. Da sinistra a destra mostra DAPI; CD45 per contrassegnare leucociti; Heppar-1 MARk epatociti; e CK18 per marcare le cellule tumorali, epatociti, e dotto biliare epitelio. Immagine unita mostra un gruppo putativo di CK18 + Heppar-1 - cellule tumorali D2A1 strettamente legate con una triade portale - CD45. Freccia = cellule tumorali D2A1, asterisco = dotto biliare epitelio; barra della scala = 25 micron. B) Un rappresentante palese D2A1 lesione metastatica utilizzando lo stesso pannello di colorazione, come nelle cellule tumorali sono A. CK18 +, mentre gli epatociti adiacenti sono CK18 + Heppar-1 +; barra della scala = 25 micron. Le immagini sono state catturate su un microscopio con 20 x 0,8, 40 x 1,3, e 60 x 1.4 obiettivi e camera CCD, utilizzando il software microscopio. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54903/54903fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

È stata sviluppata una procedura chirurgica per fornire cellule tumorali mammarie al fegato murino tramite iniezione nella vena porta. Questo modello consente di studiare le fasi avanzate delle metastasi epatiche in un ospite completamente immune competente, tra cui lo stravaso delle cellule tumorali, la semina, la sopravvivenza e la crescita metastatica nel fegato.

Un modello di iniezione vena porta del fegato per studiare metastasi del cancro al seno

Breast cancer is the leading cause of cancer-related mortality in women worldwide. Liver metastasis is involved in upwards of 30% of cases with breast ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di fornire cellule tumorali direttamente al fegato murino per la modellazione sperimentale delle metastasi epatiche del cancro al seno. Questo metodo può essere utilizzato per studiare le fasi successive della cascata metastatica nel fegato murino. Comprese le decisioni sullo stravaso delle cellule del cancro al seno, la semina, la morte, la proliferazione e la dormienza, nonché la crescita.Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce le cellule tumorali direttamente al fegato senza la rimozione della milza o concomitanti metastasi multiorgano. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale, poiché l'iniezione della vena porta richiede manipolazioni precise che si basano sulla sorveglianza anatomica diretta. Ad assistermi in questa procedura ci sarà Alexandra Quackenbush, una studentessa laureata nel laboratorio di Pepershadine.Prima di iniziare la procedura, pulire tutte le superfici dell'area chirurgica con candeggina al 10%. Un'ora prima delle iniezioni, trattare topi femmina di età compresa tra 8 e 15 settimane con 100 microlitri di analgesia per via sottocutanea per la gestione del dolore. Applicare un unguento sugli occhi dell'animale.Quindi, posiziona i topi in posizione supina e conferma il livello appropriato di sedazione pizzicando le dita dei piedi. Successivamente, disinfettare le aree chirurgiche e circostanti dell'animale, compresa la coda, con tre salviette sterili alternate di clorexidina al 2% imbevute di garza e due salviette per tamponi imbevuti di alcol. Dopo l'ultima salvietta con clorexidina, utilizzare un bisturi sterile per praticare un'incisione di un pollice nella pelle tra il piano mediano e quello sagittale sul lato sinistro del topo, iniziando appena sotto le costole e terminando sopra il quarto capezzolo della ghiandola mammaria inguinale, seguito da un'incisione simile di un pollice attraverso il peritoneo.Ora pipettare più volte le cellule tumorali su e giù per risospendere la soluzione cellulare e caricare una siringa ad ago rimovibile da 25 microlitri, dotata di un ago calibro 32, con 10 microlitri di cellule. Premere lo stantuffo fino a quando le cellule non si trovano sulla punta dell'ago e lo stantuffo ha raggiunto il volume appropriato per l'iniezione. Pulire l'esterno dell'ago caricato con un tampone imbevuto di alcol sterile per rimuovere eventuali cellule tumorali esterne, facendo attenzione a evitare punture di ago.Quindi, tenendo la pelle e il rivestimento peritoneale del lato mediano dell'incisione con la pinza, utilizzare un batuffolo di cotone sterile per spostare con cura l'intestino crasso e tenue su una garza sterile, imbevuta di soluzione fisiologica sterile. Coprire gli organi interni con la garza imbevuta di soluzione salina per mantenere l'umidità interna e la sterilità. Quando la vena porta è visibile, chiedi a un assistente di tenere delicatamente l'intestino fuori mano per esporre la vena porta con un batuffolo di cotone sterile e inserire l'ago da tre a cinque millimetri nella vena porta, a circa 10 millimetri sotto il fegato, con un angolo inferiore a 5 gradi, con il lato smussato rivolto verso l'alto.Iniettare lentamente l'intero volume delle cellule tumorali, consentendo al sangue di fluire oltre la testa dell'ago per diversi secondi per evitare un riflusso delle cellule tumorali fuori dalla vena. Poiché la corretta visualizzazione, l'accesso e l'iniezione nella vena porta sono essenziali, prendersi il tempo necessario per assicurarsi che il posizionamento della vena porta, rispetto all'ago, sia soddisfacente prima di tentare l'iniezione. Quando tutte le cellule sono state iniettate, rimuovere l'ago e contemporaneamente applicare una leggera pressione sulla vena con un applicatore sterile con punta di cotone.Quindi utilizzare un nuovo applicatore sterile con punta di cotone per tenere un pezzo quadrato di garza emostatica da 0,5 a un centimetro sopra il sito di iniezione. Dopo cinque minuti, sollevare con cautela la garza per valutare la chiusura della vena. Quando il flusso sanguigno è cessato completamente, rimuovere la garza e riportare l'intestino nella cavità addominale.Utilizzando un semplice schema di sutura continua o interrotta, chiudere il rivestimento peritoneale con la sutura sterile a quattro zero vicryl e concimare. Dopo aver chiuso la pelle allo stesso modo, iniettare 100 microlitri di anestetico locale lungo il sito di incisione, seguito da un'erogazione sottocutanea di 0,5 millilitri di soluzione fisiologica sterile. L'accurata identificazione anatomica della vena porta e il successo dell'iniezione intra-portale possono essere confermati praticando il protocollo di iniezione con inchiostro di china o un colorante simile.Con una corretta iniezione attraverso la vena porta, l'inchiostro viene erogato immediatamente e specificamente al fegato senza diffondersi al polmone. Utilizzando cellule tumorali di memoria di topo marcate con GFP, la dispersione delle cellule tumorali in tutto il fegato è evidente a 90 minuti dopo l'iniezione, confermando il successo della consegna della vena porta al fegato. Le cellule tumorali si trovano all'interno dei sinusoidi e all'interno del parenchima epatico in prossimità delle triadi portali, dove il sangue della vena porta entra nel fegato, suggerendo che in questo momento è in corso uno stravaso attivo delle cellule tumorali.Come dimostrato da queste curve di sopravvivenza, il trasferimento adottivo della vena porta di linee cellulari tumorali mammarie aggressive si traduce in tassi di sopravvivenza libera da metastasi più brevi rispetto ai topi iniettati con una linea cellulare tumorale meno aggressiva. Le metastasi di questi animali possono essere confermate mediante sezionamento attraverso il fegato a livelli di 250 micron e la successiva analisi H&E dei campioni. Inoltre, l'analisi in immunofluorescenza è utile per l'analisi di lesioni micro e macro metastatiche di linee singeniche non marcate come la linea tumorale D2A1, che sono CD45 negative, Heppar-1 negative e CK18 positive, come dimostrato in queste immagini rappresentative.Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in 12-14 minuti per topo, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di prendersi il tempo necessario per visualizzare e accedere correttamente alla vena porta prima di tentare l'iniezione. Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging intravitale dopo l'iniezione di cellule tumorali per rispondere a ulteriori domande su come le cellule tumorali interagiscono con l'ambiente lubramicro.Con il suo sviluppo, questa tecnica consente ai ricercatori nel campo delle metastasi di esplorare le fasi successive della cascata metastatica di vari tumori nei topi. Dopo aver visto questo video dovresti avere una buona comprensione di dove eseguire l'incisione chirurgica, come muovere delicatamente gli organi interni per accedere alla vena porta e come eseguire l'iniezione intra-portale. Non dimenticare che lavorare con siringhe caricate con cellule tumorali può essere pericoloso e che è necessario prendere precauzioni per evitare punture di aghi durante l'esecuzione di questa procedura.

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