Un modo semplice per misurare alterazioni in ricompensa il comportamento di ricerca Utilizzando Drosophila melanogaster

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare l'autosomministrazione di etanolo nei moscerini della frutta come proxy per i cambiamenti negli stati di ricompensa. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nelle neuroscienze, come ad esempio come l'esperienza è codificata nel cervello e porta alla modifica del comportamento. Il vantaggio principale di questa tecnica è che è relativamente semplice e non richiede una configurazione complicata.

Il protocollo è composto da due parti distinte. Il primo è esporre i moscerini a esperienze gratificanti e non gratificanti, e il secondo è valutare il consumo volontario di etanolo come misura della motivazione per ottenere una ricompensa farmacologica. Le due parti del protocollo possono essere utilizzate in modo indipendente.

Indurre la modulazione dell'esperienza come passo iniziale per ulteriori saggi a valle o, come saggio di alimentazione indipendente, a due scelte. A dimostrare la procedura saranno Shir Zer, uno studente di master, e Julia Ryvkin, una studentessa laureata, entrambi del mio laboratorio. Per iniziare la costruzione dell'alimentatore capillare, prendere prima una fiala di mosca standard con piccoli fori lungo il lato della fiala.

Utilizzare una lama di rasoio per tagliare a metà il tappo della fiala, trasversalmente. Segnare quattro punti sulla superficie del tappo, creando una forma quadrata per posizionare i supporti dei capillari. Con un ago calibro 18, praticare quattro fori attraverso il tappo nella posizione dei segni.

E allargare i fori usando una micropipetta. Usando una lama di rasoio, taglia quattro micropipette in modo che tengano saldamente i capillari di vetro da cinque microlitri. Inserirli nei fori del tappo preparato.

Segnare la posizione sul tappo dei due capillari che conterranno etanolo. Quindi, disporre le fiale di vetro nei rack per microcentrifuga. Sciogliere il cibo per mosche, quindi versare due millilitri in ciascuna delle fiale.

Lasciare indurire il cibo, quindi coprire le fiale con pellicola trasparente. Inizia prendendo i moscerini maschi che sono stati alloggiati separatamente in fiale più piccole in isolamento. Assegnali a due gruppi in modo casuale.

Coloro che subiranno esperienze di accoppiamento gratificanti, rispetto a quelle non gratificanti. Iniziando con il gruppo non gratificante, aggiungi una femmina precedentemente accoppiata a ciascuna fiala. Passando al gruppo di ricompensa, aggiungi una femmina vergine a ogni fiala.

Guarda gli incontri di accoppiamento per assicurarti che i maschi che interagiscono con le femmine vergini si accoppino con successo entro la prima ora. E che i maschi che interagiscono con femmine precedentemente accoppiate non si accoppiano. È essenziale osservare attentamente, per assicurarsi che la coorte accoppiata subisca effettivamente l'accoppiamento e che la coorte rifiutata non riesca ad accoppiarsi.

Dopo un'ora, rimuovere dall'esperimento tutti i maschi della coorte rifiutata che sono riusciti ad accoppiarsi e i maschi della coorte accoppiata che non hanno finito per accoppiarsi entro la fine della prima sessione di addestramento. Concludi la sessione di condizionamento aspirando le femmine precedentemente accoppiate dalla condizione non gratificante, conservando questi individui per prove successive. Infine, rimuovi e scarta le femmine dal gruppo dei maschi accoppiati.

Lascia riposare le mosche per un'ora, quindi ripeti il test di condizionamento di un'ora altre due volte con un'ora di riposo in mezzo. Queste sessioni di allenamento dovrebbero essere ripetute ogni giorno per altri tre giorni. Dopo l'ultima sessione di condizionamento del quarto giorno, aspirare i singoli maschi e posizionarli in gruppi da sei a otto nelle fiale di alimentazione capillari, mantenendo insieme le mosche nello stesso gruppo di ricompensa.

Utilizzare un plug morbido per mantenere i maschi in posizione durante il trasferimento. Una volta inserite tutte le mosche, sostituire il tappo morbido con il tappo di alimentazione capillare. Inumidire i tappi aggiungendo delicatamente cinque millilitri di acqua sulla parte superiore di ciascun tappo, evitando fuoriuscite nella fiala.

Preparare le soluzioni alimentari di etanolo e acqua, quindi posizionare cinque microlitri di queste gocce su una striscia di pellicola da laboratorio. Lasciare che la soluzione riempia il capillare fino a raggiungere il segno di cinque microlitri. E poi picchiettarli delicatamente sulla striscia per posizionare la soluzione esattamente sulla linea premarcata.

Sigillare le estremità dei capillari immergendole in piccole goccioline di olio minerale. Infine, inserire i due capillari contenenti etanolo e non contenenti etanolo negli adattatori della spina. I lati esposti devono sporgere di un millimetro o meno dalla superficie del tappo.

Mantenere l'apertura per i capillari vicino al tappo umido riduce l'evaporazione e consente un facile accesso al cibo, poiché le mosche normalmente si siedono sui tappi e scendono sul capillare esposto per nutrirsi. Inoltre, prepara una fiala finta senza mosche, che verrà utilizzata come controllo per valutare l'evaporazione naturale. Infine, registrare la posizione relativa del liquido in ciascuno dei capillari nelle provette rispetto alla linea nera in millimetri.

Mettere le fiale nell'incubatore sperimentale per 24 ore. Misurare e registrare i livelli del liquido in ciascun capillare rimosso rispetto alla linea nera. Una volta che l'esperimento è in corso, sostituire il capillare a un'ora prestabilita, ogni giorno.

Inumidire nuovamente i tappi con due millilitri d'acqua, quindi rimettere le fiale nell'incubatrice. I moscerini della frutta maschi del ceppo Canton S di tipo selvatico raccolti dopo l'eclosion e invecchiati fino a quattro giorni di età, sono stati analizzati nel corso di quattro giorni per la loro innata preferenza al consumo di alcol. L'analisi dei volumi consumati da soluzioni contenenti etanolo e non etanolo, mostra che i moscerini hanno mostrato una preferenza significativa per la fonte alimentare di etanolo al 15%.

L'esperimento CAFE è stato ripetuto con maschi accoppiati rispetto a maschi respinti. Entrambi i gruppi erano stati precedentemente alloggiati singolarmente ed esposti a femmine che accettavano o rifiutavano l'accoppiamento. Dopo l'introduzione in gruppi nelle fiale CAFE, il gruppo rifiutato ha consumato più dai capillari dell'etanolo.

Ciò ha suggerito che la mancanza percepita di ricompensa ha portato a un aumento del comportamento di ricerca della ricompensa. Al contrario, l'accoppiamento riuscito aumenta i livelli di ricompensa interna, che a sua volta riduce il consumo di etanolo. Durante il tentativo di questa procedura, è importante mantenere un ambiente ben umidificato per l'intero esperimento, con particolare enfasi sulla parte del consumo, innaffiando i tappi ogni giorno e mantenendo le estremità dei capillari in prossimità dei tappi bagnati.