Matrici 2D e 3D per studiare formazione e attività lineare invazienti

Il nostro gruppo lavora sull'interazione tra cellula e matrice extracellulare. Le cellule possono produrre, ma anche degradare, l'elemento della matrice extracellulare. La degradazione della matrice può avvenire durante processi fisiologici ma anche patologici, come la neurodegensi e l'invasione del tumore cellulare.

A livello cellulare possiamo notare la presenza di strutture a base di actina coinvolte nella degradazione della matrice. E queste strutture sono chiamate invasomi. Invadosoma, è un termine generico che include i podosomi nelle cellule normali e gli invadopodi nelle cellule tumorali.

La degradazione di questo invasomaso può essere auto-organizzata in diverse forme, punti, aggregati e rosette. E l'attività di questo invadosoma, è guidata dalle metalloproteinasi, come MMP2 e MT1-MMP. Questo non è per molto tempo che la coppia, MMP2, MT1-MMP viene attivata dalle fibrille di collagene di tipo 1.

Per studiare l'attività degli invadosomi, è stato utilizzato un classico saggio di zimografia in situ. Ma per studiare il ruolo e l'impatto delle fibrille di collagene di tipo 1 negli invasomi, abbiamo deciso di creare un nuovo test. Per fare questo, abbiamo creato una matrice mista composta da gelatina e fibrille di collagene di tipo 1.

In questo film, nella prima parte, Eloide Henriet vi mostrerà come generiamo questo tipo di matrice. Nella seconda parte, Zakaria Ezzoukhry vi mostrerà come siamo in grado di misurare l'impatto delle fibrille di collagene di tipo 1 nella morfologia, nella formazione e nell'attivazione degli invasomi. E nell'ultima parte, Julie Di Marino vi mostrerà come adattiamo un saggio di invasione del collagene 3D.

Ti mostrerò come preparare una matrice mista composta da gelatina e fibrille di collagene di tipo 1. Farò due tipi di matrice mista. Uno per eseguire il test di zimografia in situ con gelatina di fluoresceina e collagene di tipo 1 non fluoresceina.

E un altro che ci permette di visualizzare le fibrille di collagene con gelatina non fluoresceina e fibrille di collagene marcate. Per preparare la matrice di gelatina, aliquotare 20 microlitri di gocce di gelatina su un pezzo di parafilm. Coprire ogni goccia con un vetrino coprioggetti autoclavato.

Incubare a temperatura ambiente per 20 minuti e proteggere dalla luce. Per il fissaggio della gelatina, aliquotare 40 microlitri di goccioline di glutaraldeide allo 0,5% in PBS. Usando una pinza, trasferire i vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina su ciascuna gocciolina di glutaraldeide.

Incubare a temperatura ambiente per 40 minuti e proteggere dalla luce. Prendere una piastra per colture cellulari multipozzetto e riempire ogni pozzetto con 500 microlitri di PBS sterile 1X. Al termine del periodo di incubazione, posizionare ogni vetrino coprioggetti, con la gelatina rivolta verso l'alto, in ogni pozzetto.

Lavare i vetrini coprioggetti due volte in 1X PBS per cinque minuti ciascuno. In questa fase, i vetrini coprioggetti possono essere utilizzati per la sperimentazione o conservati per un uso successivo. Pipettare 0,4 mg per ml di collagene uno in una provetta.

Aggiungere il colorante fluorescente per una concentrazione finale di 10 microgrammi per ml. Mescolare la soluzione nella provetta e incubare per cinque minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Diluire fino al volume finale con 1x DPBS e aggiungere 500 microlitri di soluzione sopra i vetrini coprioggetti rivestiti di gelatina in una piastra multipozzetto.

Incubare per quattro ore a 37 gradi Celsius per la polimerizzazione del collagene. Dopo l'incubazione rimuovere il collagene in eccesso. Aggiungere le cellule per un volume finale di 500 microlitri e incubare le cellule a 37 gradi Celsius prima della fissazione.

Questo tipo di matrici potrebbe essere modificato con altri elementi della matrice come la fibronectina, la vitronectina o il collagene di tipo IV. Da parte mia, ti mostrerò come eseguire l'immunofluorescenza utilizzando Tks5, un marcatore di invasomi, e come quantificare gli invadosomi lineari su vetrini coprioggetti rivestiti di collagene di tipo 1. Possiamo presentare i risultati in base al numero di cellule presenti negli invasomi lineari, ma possiamo anche presentare il numero di strutture in ciascuna cellula.

Fissare i vetrini coprioggetti per 10 minuti in 500 microlitri di paraformaldeide al 4% in PBS. Lavare due volte con 1x PBS e permeabilizzare le cellule con 0,2% di Triton X-100 in 1x PBS per 10 minuti. Aliquotare 50 microlitri di goccioline di soluzione di anticorpi primari al 4%BSA in 1x PBS su un pezzo di parafilm.

Posiziona ogni vetrino coprioggetti su una gocciolina. Incubare per 40 minuti a temperatura ambiente al riparo dalla luce. Lavare i vetrini coprioggetti due volte con 1x PBS e incubare i vetrini coprioggetti in anticorpi secondari, colloidina e colorante Hoechst per 30 minuti al riparo dalla luce.

Dopo l'incubazione, lavare due volte con 1x PBS, seguito da acqua distillata per rimuovere i sali. Montare i vetrini coprioggetti su un vetrino con mezzo di montaggio polimerizzante. Lasciare asciugare il vetrino per una notte a temperatura ambiente prima di eseguire l'imaging.

Per l'analisi delle immagini acquisire un'immagine di actina e Tks5 in sequenza utilizzando un microscopio confocale. Per quantificare le dimensioni e il numero di invasomi lineari per cellula, utilizzare il software ImageJ e la macro fornita. Per prima cosa eseguire la macro in ImageJ e aprire l'immagine di actina.

Successivamente, apri l'immagine Tks5. Impostare la soglia e applicare la macro. I risultati analizzati appariranno in due tabelle.

Il numero di invadosomi lineari per cellula e altre informazioni come l'area percentuale utilizzata dagli invadosomi lineari nella cella saranno nella tabella riassuntiva. La dimensione di ciascun invasomama lineare sarà nella tabella dei risultati. Dopo la quantificazione delle immagini, possiamo presentare i risultati mostrando il numero di strutture per cella.

Quindi, da parte mia, adattiamo un metodo per dimostrare la presenza di invadosomi lineari in 3D. Ci siamo resi conto che il gel è composto solo da fibrille di collagene e questo test viene utilizzato per valutare l'invasione cellulare nel contesto del collagene. Preparare la soluzione di collagene di tipo 1 con ghiaccio a una concentrazione finale di due mg per ml.

Aggiungere il colorante fluorescente alla concentrazione finale di un microgrammo per millilitro. Mescolare la soluzione e incubare con ghiaccio per cinque minuti al riparo dalla luce. Successivamente, aggiungere 50 microlitri di PBS 10x ghiacciato.

Quindi aggiungere 6,25 microlitri di idrossido di sodio monomolare ghiacciato. Aggiungere acqua sterile per ottenere la concentrazione corretta e mescolare la soluzione. Posizionare gli inserti della camera di Boyden in un piatto di coltura cellulare multipozzetto.

Aggiungere 100 microlitri di una soluzione di collagene a ciascun inserto. Per polimerizzare il gel di collagene, incubare la capsula per un'ora a 37 gradi Celsius. Aggiungere il terreno di coltura cellulare arricchito con siero a ciascun pozzetto e posizionare gli inserti nel terreno.

Semina 30.000 cellule in terreni privi di siero sopra il gel di collagene. Per fissare le cellule, aggiungere una soluzione di paraformaldeide al 4% in un pozzetto vuoto. Rimuovere il mezzo cellulare dall'inserto senza toccare il gel di collagene.

Posizionare l'inserto nei pozzetti con la soluzione di paraformaldeide al 4% e aggiungere ulteriore soluzione di paraformaldeide al 4% sopra il gel di collagene. Incubare a temperatura ambiente per 30 minuti. Dopo il fissaggio, rimuovere la soluzione di paraformaldeide al 4% e lavare con 1x PBS.

Dopo il lavaggio, il gel di collagene dovrebbe diventare trasparente. Ora gli inserti sono pronti per l'immunofluorescenza. Per prima cosa scolare gli inserti.

Quindi posizionare gli inserti nei nuovi pozzetti della piastra multipozzetto. Per permeabilizzare le cellule, aggiungere una soluzione di Triton X-100 allo 0,2% in 1X PBS sopra il gel di collagene per 30 minuti. Scolare gli inserti.

Lavare con 1X PBS e aggiungere la soluzione di anticorpi primari sopra il gel di collagene per un'ora al riparo dalla luce. Rimuovere la soluzione di anticorpi primari, lavare con 1X PBS e incubare il gel di collagene con la soluzione di anticorpi secondari per 1,5 ore al riparo dalla luce. Lavare la soluzione di anticorpi secondari con 1X PBS.

Per preparare il gel di collagene per il montaggio, tagliare la membrana dell'inserto con un bisturi. Posizionare il gel di collagene attaccato alla membrana in un piatto con fondo di vetro. È importante che la parte superiore del gel sia a contatto con il fondo del piatto.

Aggiungere il supporto di montaggio e un vetrino coprioggetti sulla parte superiore per l'osservazione al microscopio. Con questo test, abbiamo dimostrato il ruolo chiave del recettore DDR1 nell'invasione cellulare nel gel di collagene uno. Questo test può essere utilizzato anche per valutare l'effetto dei farmaci sull'invasione cellulare.

In diversi studi, abbiamo dimostrato che la sola aggiunta di un nuovo elemento di matrice extracellulare nella sua conferma fisiologica, qui le fibrille di collagene di tipo 1, può modificare la morfologia, la composizione molecolare e l'attività degli invadosomi. Quindi, utilizzando i diversi saggi descritti in questo filmato, abbiamo dimostrato l'esistenza di nuove strutture, una nuova organizzazione di invadosomi che abbiamo chiamato invadosomi lineari. Generando matrici complesse e più fisiologiche, permettiamo l'identificazione di nuove vie coinvolte nell'aggiunta, migrazione e invasione cellulare.