Name: Combinato di microscopia Intravital e lecografia contrapporre-aumentata del Hindlimb Mouse per studiare la perfusione del muscolo e la vasodilatazione indotta da insulina (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-03-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 22 s
Description: Scopri come combinare ecografia con microbolle e microscopia intravital per studiare la vasodilatazione indotta dall'insulina nell'arteria gracile del topo. Questo metodo permette di analizzare la perfusione muscolare e il reclutamento microvascolare in vivo.

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Si ringrazia l'Ing. Duncan Groen van per la programmazione del software di analisi di immagine (ImageGrabber) utilizzato in questo studio. I finanziamenti per questa ricerca è stata fornita da una sovvenzione VIDI dell'organizzazione olandese per la ricerca scientifica (grant 016.136.372).

Tutti gli esperimenti sugli animali sono stati approvati dal comitato etico e cura degli animali locale. L'intero protocollo di induzione dell'anestesia nel topo fino alla fine del morsetto euglycemic hyperinsulinemic impiegano circa 2 ore.
1. microsurgical preparazione
<ol><li>Inducono anestesia con analgesia in un topo maschio 20-25 g di peso dopo un 14 h o durante la notte di digiuno con un'iniezione intraperitoneale di Fentanyl (0,31 mg/kg), Midazolam (6,25 mg/kg) e acepromazina (6,25 mg/kg) (anestesia FMA) e posizionarlo su un rilievo di riscaldamento omeotermi rettale a temperatura controllata che mantiene la temperatura corporea a 37 ° C.</li>
	<li>Disinfettare la tabella di funzionamento e le attrezzature più volte utilizzando una soluzione a base di alcool.</li>
	<li>Fissare un ago 27G un tubo di 10 cm lungo di polietilene (PE-20) e fissare il tubo al raccordo a 4 vie. Inserire l'ago nella vena caudale e fissarsi utilizzando gel adesivo del tessuto. Questa cannula verrà utilizzato per l'infusione di microbolle, insulina, glucosio e anestesia. Nota: L'aggiunta di eparina (5 U/mL) in soluzione salina sterile durante l'inserimento di una canula processo per irrigare la vena caudale (circa 10 µ l) riduce la possibilità di cannule intasati.</li>
	<li>Durante le procedure chirurgiche e protocolli sperimentali, mantenere l'anestesia da un'infusione endovenosa continua di anestesia FMA tramite cannula vena della coda al tasso di 33,75 µ l/kg/min.</li>
	<li>Inserire il mouse con il lato ventrale verso l'alto e fissare i piedi utilizzando un nastro termostabile per esporre l'area superiore della coscia. Utilizzare un lieve exorotation del giunto dell'anca (paws del hindlimb rivolto verso l'alto) e un angolo di 40-60° all'articolazione del ginocchio per standardizzare il tratto del muscolo il vano adduttori della coscia.</li>
	<li>Rimuovere i peli all'inguine e nelle aree coscia superiore bilateralmente usando una crema depilatoria. Raccogliere tutti i capelli sciolti con un batuffolo di cotone umido.</li>
	<li>Posizionare il mouse sotto un microscopio stereoscopico e attenersi alla seguente procedura chirurgica utilizzando 10x di ingrandimento X 16.</li>
	<li>Fare un'incisione di 2 cm utilizzando forbici pelle che corre parallela al legamento inguinal, appena laterale alla curvatura addominale (Figura 1). Applicare la trazione sul lato distale dell'incisione distalmente utilizzando un bulldog morsetto (Figura 1). Questo vi aiuterà a regolare la finestra in base alle esigenze e contribuire a tenere l'olio di paraffina (descritto in 1.12).</li>
	<li>Sezionare il tessuto adiposo dalla parete addominale. Per evitare il sanguinamento, separare delicatamente il cuscinetto di grasso dalla parete invece di dissezione direttamente attraverso il pad. Lieve trazione presso il cuscinetto di grasso in direzione distale faciliterà il processo (Figura 1).</li>
	<li>Identificare l'arteria femorale e seguirla fino ai primi rami principali (l'arteria epigastrica e l'arteria gracilis) (Figura 2). L'arteria gracilis è il primo ramo principale dell'arteria femorale in esecuzione sul muscolo grande adduttore e poi corre profonda per il muscolo gracile. L'arteria gracilis verrà utilizzato per IVM.</li>
	<li>Identificare la fascia profonda trasparente che copre i muscoli ed i vasi. Utilizzando pinze taglienti, tirare la fascia verso l'alto e tagliarlo usando una MICROFORBICE.</li>
	<li>Coprire il muscolo esposto con una goccia (200 µ l) di medicinale paraffina liquida (temperatura ambiente, o pre-riscaldato a 37 ° C) per evitare che il tessuto preparate dall'asciugarsi. Assicurarsi che la goccia d'olio non perdita di distanza. Regolare le pieghe di pelle dell'incisione utilizzando il bulldog morsetto per creare una piccola cavità per contenere l'olio di paraffina che bagna i vasi.</li>
	<li>Posizionare il mouse al microscopio (ingrandimento ottico 16 X) precedentemente calibrato in modo tale che l'arteria gracilis è verticale sullo schermo del computer. Collegare il microscopio a una telecamera e un computer basato su sistema di analisi che può estrarre il diametro dei vasi dal set di dati di immagine. Il diametro è la distanza tra i due lati luminal della nave. Continuo monitoraggio e la misurazione del diametro dell'arteria è auspicabile.</li>
	<li>Posizionare la sorgente di luce a una distanza sufficiente (minimo 20 cm) dall'arto posteriore per ridurre la testa conduzione dalla luce.</li>
	<li>Applicare il gel di trasduzione di ultrasuono preriscaldati l'arto posteriore controlaterale superiore. Posizionare la sonda ad ultrasuoni perpendicolare all'asse lungo del femore.</li>
	<li>Regolare con attenzione l'angolo e la direzione della sonda ecografica per ottenere una vista di sezione trasversale del gruppo del muscolo adduttore. Fare attenzione a mantenere la posizione della sonda ecografica in relazione al mouse stabile per mantenere sullo stesso piano di formazione immagine per le misure della linea di base e hyperinsulinemic.</li>
	<li>Lasciare che il mouse si stabilizzi per 30 min. Il diametro dell'arteria gracilis dovrebbe essere stabile per 10 min prima che documentano il diametro della linea di base.</li>
</ol>2. linea di base e misure Hyperinsulinemic
<ol><li>Assicurarsi che il diametro dell'arteria di baseline gracilis è salvato dal programma per computer utilizzato per la IVM.</li>
	<li>Preparare le microbolle in anticipo come descritto35 e conteggio con Coulter counter ad una concentrazione di 2.5 x 109 bolle/mL appena prima dell'esperimento.</li>
	<li>
Come microbolle possono essere visualizzati solo in modalità a contrasto della macchina ad ultrasuoni, controllare i parametri che influenzano l'immagine e il contrasto dati raccolti (descritto in 2.3.1) e uso costantemente durante l'acquisizione.
	<ol>
<li>Utilizzare le seguenti impostazioni della macchina di ultrasuono: aumento di contrasto a 35 decibel; il tempo ottenere compensazione su OFF; Densità di linee ad alta; Numero di zone focali di WIDE; Potenza di trasmissione di 4%; Trasmettere la larghezza del fascio standard; SV Gate a 4; Sensibilità a 1; Persistenza su OFF. Livello la posizione delle zone di focale al centro della regione di interesse.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Salvare un breve (5 s) clip. Questo utilizzerà per calcolare il segnale di fondo.</li>
	<li>Agitare il flaconcino contenente microbolle a mano per avere una sospensione uniforme. Iniziare l'infusione di microbolle utilizzando la cannula della vena della coda a un tasso di 5 µ l/min. Posizionare il tubo di infusione su una vibrante vortex (200 x / min) per mantenere una sospensione uniforme di microbolle.</li>
	<li>Lasciare 5 min di infusione continua di microbolle che viene raggiunto un livello stazionario. Procedere con ottenendo le curve di tempo-intensità delle bolle utilizzando la funzione di distruzione di microbolle (MBD) sulla macchina ultrasuoni a 5 min e a 10 min dopo l'inizio dell'infusione di microbolle (Figura 3A). Prendere il segnale medio di queste due misure per ottenere i dati di aspersione della linea di base.</li>
	<li>
Dopo aver ottenuto i dati di previsione, è necessario avviare il morsetto euglycemic hyperinsulinemic come descritto34. Utilizzare la cannula di coda (posizionata in 1.3) per amministrare l'insulina e glucosio (e anestesia).
	<ol>
<li>In breve, indurre uno stato di hyperinsulinemic introducendo un bolo di insulina 200 mU/kg seguito da infusione continua di insulina (7,5 mU/kg/min) per 60 min. uso un'infusione variabile del 20% D-glucosio per mantenere il euglycemia.</li>
		<li>Valutare la glicemia da vena caudale ogni 5 min con un dispositivo di monitoraggio del glucosio e mantenere a 5 mM regolando il tasso di infusione del glucosio variabile. Per determinare la sensibilità dell'insulina, in media il tasso di infusione del glucosio media durante gli ultimi 30 minuti.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Assicurarsi che il diametro dell'arteria gracilis è documentato presso i periodi di tempo desiderato (ad esempio a 10, 30 e 60 min) dell'inizio del morsetto euglycemic hyperinsulinemic con il programma del computer.</li>
	<li>Dopo 25 min e/o 55 min del morsetto dell'insulina, iniziare la seconda misurazione (hyperinsulinemic) CEUS per documentare il MBV a 30 o 60 min, rispettivamente. Seguire la stessa procedura descritta in 2.4 e 2.5. Staccare e utilizzare la porta di anestesia del connettore 4 vie per infondere microbolle. Ricollegare il tubo di anestesia dopo la fine dell'infusione di microbolle.</li>
	<li>Dopo il completamento di IVM e le misurazioni CEUS 60 min dopo l'inizio dell'infusione di insulina, prelevare sangue dal mouse da una procedura di puntura del cuore per un'analisi successiva. Questo sarà anche eutanasia il mouse. Accuratamente sezionare il gracilis e arterie femorali e conservarli per ulteriori esperimenti desiderati (per es., Western blot, immunoistochimica, ex vivo pressione myography esperimenti36,37, 38).</li>
</ol>3. analisi offline

Nota: L'analisi di IVM e CEUS misurazioni devono essere effettuate non in linea da un ricercatore accecato. CEUS offre la possibilità di distinguere la microcircolazione dai vasi maggiori di temporaneamente destructing microbolle di onde di ultrasuoni ad alta intensità utilizzando la funzione MBD. Il segnale (misurato in unità arbitrarie (AGU)) in vasi più grandi viene ripristinato più velocemente rispetto a quelli a livello del microcircolo a causa della velocità di microbolle nei vasi corrispondente.
<ol><li>Utilizzare una workstation non in linea o il software sulla macchina ad ultrasuoni per fare le analisi.</li>
	<li>Disegnare un'area di interesse (ROI) per includere la microcircolazione. Disegnare un ROI separato per includere i più grandi vasi femorali (Figura 3A).</li>
	<li>Duplicare ROIs il di microcircolazione e più grandi vasi per le misurazioni di sfondo, baseline e hyperinsulinemic utilizzando la funzione di copia ROI costruita nel software.</li>
	<li>Sottrarre il segnale di intensità la misurazione di sfondo dalla linea di base e le misure di hyperinsulinemic.</li>
	<li>Dividere il segnale di intensità della microcircolazione dal segnale di intensità dei vasi femorali. MBVs basale e hyperinsulinemic ora possono essere confrontati.</li>
</ol>

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Visual Sonics Inc coperto le spese di accesso aperto, mentre la struttura e il contenuto dell'articolo è rimasta la piena responsabilità degli autori.

Abbiamo sviluppato una tecnica per stimare contemporaneamente azioni vascolari dell'insulina sui più grandi arterie (utilizzando IVM) e il microcircolo del muscolo scheletrico (utilizzando CEUS). I passaggi critici per misurazioni affidabili e di successo sono: 1) esporre correttamente l'arteria gracilis senza sanguinamento; 2) prevenire perdite di olio di paraffina balneazione l'arteria; 3) avendo un accesso venoso brevetto (cannula per vena della coda) per infusione di composti vasoattivi (insulina) e agente di contrasto (microbolle).
Lo studio della disfunzione microvascolare nel muscolo è stato guadagnando attenzione nel contesto dell'obesità e insulino resistenza14,25,39,40. L'impatto negativo dell'obesità e l'insulino-resistenza sulla funzione vascolare si manifesta a diversi livelli dell'albero vascolare. D'ora in poi, diversi approcci sono richiesti per valutare questi cambiamenti. L'uso combinato delle tecniche IVM e CEUS nel topo stesso fornisce un potente strumento per quantificare gli effetti dell'insulina a diversi livelli del sistema vascolare. IVM permette la visualizzazione diretta e analisi quantitativa dell'arteria resistenza e CEUS consente per la valutazione dei cambiamenti indotti da insulina nell'aspersione del muscolo.
Studiando il vano del muscolo adduttore ha diversi vantaggi. Le arterie sono facilmente accessibili e la natura superficiale dell'incisione permette di chiudere l'incisione cutanea con un 5,0 sutura riassorbibile sterile dopo l'esperimento è finito. Gli animali sono stati iniettati per via sottocutanea con buprenorfina dopo gli esperimenti come analgesico ad una dose di 0,1 mg/kg e ha permesso di recuperare in un ambiente caldo. I topi tollerato molto bene la procedura e abbiamo sperimentato senza perdita di animali né infezioni del hindlimb in più di 35 animali studiati. Questo rende possibile al follow-up o studiare gli animali in modo longitudinale. Gli animali utilizzati in questi esperimenti, tuttavia, sono stati anestetizzati con isoflurano 1,8% inalato bilanciato con l'ossigeno che scorre a 0,4 L/min, anche se una maschera di anestesia. In contrasto con isoflurano anestesia41,42, anestesia FMA non interferisce con la sensibilità periferica dell'insulina. Un progetto per il futuro è quello di studiare quanto bene i topi recupero dall'anestesia FMA.
Il vano di muscolo adduttore è utile anche da vari composti vasoattivi mediazione locale e possono essere valutati gli effetti vascolari a valle. Ad esempio, l'applicazione topica di questi composti per il tessuto bersaglio è fattibile utilizzando tecniche sopraffusione28 o manipolazione chirurgica e l'impianto di polsini medicati che circondano i vasi43. Inoltre, l'arteria gracilis può essere isolato e studiato nel myograph di pressione. Il nostro gruppo e gli altri si sono riuniti evidenze sperimentali utilizzando il myograph di pressione per documentare gli effetti di insulina e di altri composti vasoattivi su questa arteria ex vivo36,37,38.
Una limitazione inerente all'uso della tecnica IVM è l'esposizione chirurgica del muscolo e l'applicazione di olio di paraffina per stabilizzare i vasi. Non è chiaro se queste azioni impattano l'ambiente nativo dell'arteria. Figura 3A Mostra tuttavia che il diametro della linea di base dell'arteria gracilis immerso in olio di paraffina non cambia considerevolmente. È stato anche dimostrato che l'olio minerale inibisce con successo la diffusione dell'ossigeno, proteggendo il tessuto da hyperoxic condizioni44. Inoltre, l'olio aiuta a ridurre la variazione del diametro basale delle arterie. Ecco perché sosteniamo da usare olio di paraffina e lasciate riposare la preparazione per almeno 30 min. Di nota, l'uso di soluzione salina tamponata invece di olio – o non provocato a tutti – diametri altamente variabili e la costrizione della nave (dati non mostrati). Inoltre, alla fine degli esperimenti, abbiamo isolato le arterie gracilis - bagnate in olio di paraffina - e testato la loro reattività nella myograph pressione ex vivo. Le arterie di bagno d'olio di paraffina ha reagito allo stesso modo per controllare le arterie quando stimolati con insulina e acetilcolina (un vasodilatatore) (dati non mostrati). La vasodilatazione indotta da insulina coerenza dimostra chiaramente che il protocollo IVM descritto in questo studio produce risultati affidabili.
Il vantaggio di applicare entrambe le tecniche nel topo stesso supera alcune delle limitazioni intrinseche di una tecnica da altra: CEUS stime MBV nel muscolo indisturbati in vivo, ma non si vede singole navi; IVM rende possibile vedere singole navi, anche se esso non può stimare MBV. Un progetto per il futuro è quello di utilizzare la microscopia IVM del muscolo cremastere in combinazione con CEUS del muscolo adduttore sul lato controlaterale. Questa modifica può fornire una stima di MBV (utilizzando CEUS) e un accesso ottico diretto ai capillari (utilizzando IVM). Il protocollo può essere ulteriormente modificato; il raccordo a 4 vie utilizzata per la cannula di coda può essere commutato a un connettore a 5 vie. In questo modo, possiamo evitare di staccare il tubo di anestesia durante l'esecuzione la seconda misurazione CEUS (descritta nel punto 2.9). Nella nostra esperienza, i topi ha tollerato bene l'attuale protocollo. Un'altra modifica che può essere fatto per questo protocollo è utilizzato il tasso del morsetto dell'insulina. Abbiamo usato 7,5 tariffa morsetto mU/kg/min, che è considerato sovra-fisiologiche. Secondo lo studio, un basso tasso di morsetto di insulina (per esempio 3 mU/kg/min) possa essere usato.
Mentre abbiamo trovato il protocollo descritto affidabile, ci sono limitazioni specifiche che richiedono attenzione. Ci sono situazioni in cui la misurazione del diametro arterioso non è ottima. L'esecuzione della procedura di preparazione richiede qualche esperienza con il modello. È fondamentale che l'olio di paraffina non ci siano perdite dall'ambiente nave come completandolo con olio nuovo sarà disturbare il vaso e cambiare il diametro, rendendo necessario lasciare riposare l'arteria per altri 30 min. Inoltre, la riflessione della luce (descritta al punto 1.14 del protocollo) sulla superficie dell'olio di paraffina a volte era troppo luminosa, rendendolo difficile visualizzare l'arteria. Questo può essere neutralizzato da dirigere la sorgente luminosa in modo che la luce cade ad angolo per l'olio di paraffina superficiale e parallela all'arteria.
In conclusione, la combinazione di tecniche IVM e CEUS descritti in questo studio rende possibile quantificare gli effetti differenti di insulina a diversi livelli del sistema vascolare. IVM dell'arteria gracilis offre informazioni approfondite i cambiamenti vascolari a Monte contribuendo alla perfusione microvascolare a valle misurato utilizzando CEUS. Sosteniamo che la combinazione di diverse tecniche sperimentali nel topo stesso per meglio valutare la funzione vascolare.

In risposta ad un aumento nel livello di glucosio nel sangue, il pancreas secerne insulina nel flusso sanguigno dove viene rapidamente distribuita ai suoi tessuti bersaglio, come muscolo scheletrico, via resistenza arterie e capillari. Il muscolo scheletrico è responsabile ~ 80% di assorbimento di glucosio postprandiale1. La consegna dell'insulina nell'interstizio del muscolo scheletrico ha dimostrata di essere un tasso che limita il passaggio delle azioni metaboliche dell'insulina che promuovono glucosio smaltimento2,3,4. Entro 10-15 min, l'insulina aumenta il volume di sangue capillare (reclutamento microvascolare), un effetto che si verifica prima che il flusso sanguigno totale aumenta di5,6. Microvascolare reclutamento si espande l'area della superficie endoteliale disponibile per scambio di sostanze nutrienti (e insulina)7,8. Insulina-mediato microvascolare reclutamento precede ed è indipendentemente associata con i cambiamenti in muscolo scheletrico del glucosio assorbimento8,9. L'effetto dell'insulina sul sistema vascolare è stata definita 'la sensibilità dell'insulina vascolari'.
È stato dimostrato che l'insulina-mediata assunzione microvascolare e vasodilatazione indotta da insulina sono alterati in obese Zucker ratti10,11. Inoltre, topi magri con ridotta densità capillare visualizzazione muscolo insulino resistenza12. Nel loro lavoro influente, Kubota et al ha dimostrato che alterata dell'insulina in cellule endoteliali di segnalazione causato riduzione nell'assunzione microvascolare indotta da insulina, che ha ridotto l'assorbimento del glucosio in muscolo scheletrico di circa 40%13. Queste anomalie nella funzione microvascolare non solo si verificano nel muscolo, ma anche in più altri tessuti e organi come il cuore, retina e rene14,15,16. Questi esempi e altri studi17,18,19,20 suggeriscono che gli effetti vascolari di insulina sono un meccanismo importante in fisiologia (patho) di insulino-resistenza e la sua complicazioni.
Mentre ci è prova notevole che l'insulina aumenta volume sanguigno microvascolare (MBV) nel muscolo scheletrico5,6, i meccanismi con cui questo accade non sono completamente capito9. Vasodilatazione endotelio-dipendente è essenziale in molti aspetti della vascolare insulino sensibilità21,22,23 a diversi livelli del sistema vascolare. La sensibilità dell'insulina vascolare può manifestarsi da insulina-indotta di rilassamento delle arterie di resistenza e di rilassamento delle arteriole pre-capillari per aumentare il cambio microvascolare irrorato superficie7,24, 25.
La microscopia intravital (IVM) è stata utilizzata in una varietà di preparazioni di tessuto comprese le camere dello skinfold il mouse dorsum26, il mesentere del topo e ratto27, modelli di ischemia dell'arto il mouse28 e il sacchetto di guancia del criceto 29. l'ecografia contrapporre-aumentata (CEUS) è un'altra tecnica di imaging che permette la valutazione del microcircolo in cardiaco30 così come il muscolo scheletrico31. Utilizza microbolle riempito di gas inerte che si comportano reologicamente come globuli rossi e rimangono interamente all'interno del lume vascolare. Queste microbolle sono infusi per via endovenosa a velocità costante per raggiungere uno stato stazionario. Un'onda di ultrasuoni ad alta energia, quindi, può essere utilizzata per distruggere le microbolle. Velocità di riempimento dei microbolle nella regione di interesse (ROI) rappresenta la velocità di flusso (MFV). L'intensità del segnale totale dell'immagine contrasto rappresenta il MBV. CEUS può essere eseguita più volte (anche in esseri umani) e ha avanzato la comprensione della disfunzione vascolare che si verifica in Stati di insulino-resistenza (discussi in Barrett et al. 32).
In questo studio, descriviamo una nuova tecnica per lo studio della regolazione della perfusione del muscolo, attraverso l'uso simultaneo di IVM e CEUS. Qui ci concentriamo su azioni vascolari dell'insulina nel vano adduttore del hindlimb mouse. Questo vano è uno dei più grandi gruppi del muscolo scheletrico nel topo, permettendo studi dell'assorbimento del glucosio locale in un muscolo rappresentativo. Questo comparto è ideale per IVM in quanto la preparazione e la visualizzazione delle arterie sono facilmente accessibili da una procedura chirurgica standardizzata28. Inoltre, il nostro gruppo e altri hanno mostrato CEUS può essere utilizzato in questo compartimento33,34.
Un vantaggio per la tecnica combinata di IVM e CEUS è la possibilità di valutare l'effetto dell'insulina a livello delle arteriole più grandi (arterie feed o resistenza) e la microcircolazione (letti capillari) nello stesso gruppo muscolare. Inoltre, l'applicazione simultanea di due metodi fornisce insight into the azione temporale dell'insulina a livello delle arterie di resistenza e microcircolazione. Questo combinato IVM e CEUS tecnica può anche essere implementata in altri campi di biologia vascolare. Ad esempio, il ruolo delle varie proteine e determinate condizioni fisiopatologiche che interessa l'endotelio possa essere studiato utilizzando modelli ad eliminazione diretta. Inoltre, entrambe le tecniche possono essere utilizzate in un mouse a più punti di tempo, riducendo i tempi e i costi della ricerca.

<table><tbody><tr><td>C57BL/6 Mice</td><td>Charles river</td><td></td><td>I topi utilizzati sono stati allevati internamente Vevo</td></tr><tr><td>2100 sistema ad ultrasuoni ad alta risoluzione</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Trasduttore non lineare MS250</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vevo 2100 software</td><td>VisualSonics inc.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel per ultrasuoni (Aquasonic 100, incolore)</td><td>CSP Medical</td><td>133-1009</td><td>Gel per ultrasuoni utilizzato per trasmettere le onde ultrasoniche</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>VWR international</td><td>58815-234</td><td></td></tr><tr><td>Termoforo</td><td>Pantlab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Freestyle Precision Xceed&nbsp;</td><td>Abbott</td><td></td><td>Per misurare il livello di glucosio nel sangue durante il clamp iperinsulinemico-euglicemico</td></tr><tr><td>Insulina Novorapid</td><td>Novo Nordisk</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Glucosio monoidrato</td><td>Merck Millipore</td><td>1083421000</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione salina tamponata</td><td>B. Braun</td><td>152118062</td><td></td></tr><tr><td>Tubo medicale PE-20</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>427405</td><td></td></tr><tr><td>Ago, calibro 27</td><td>Becton-Dickinson & Co</td><td>305109</td><td></td></tr><tr><td>Nastro medico</td><td>3M</td><td></td><td></td></tr><tr>Supporto <td></td><td></td> per<td>sonda ecografica</td><td>Tamponi</td></tr><tr><td>di cotone integrati internamente Depilatore</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td> in crema multiplo equivalente <td>Multiplo</td></tr><tr><td>Adesivo per tessuti in gel</td><td>equivalente multiplo Derma+flex</td><td>GA30005-2222</td><td></td></tr><tr><td>Pompa per infusione</td><td>Harvard Apparecchio</td><td>Harvard Apparatus PHD 2000</td><td></td></tr><tr><td>Forbici dritte piccole e fini</td><td>Strumenti per le scienze fini (FST)</td><td>14090-09</td><td></td></tr><tr><td>Porta aghi</td><td>Strumenti per le scienze fini (FST)</td><td>12500-12</td><td></td></tr><tr><td>Pinze dritte con punta fine</td><td>Strumenti per le scienze fini (FST)</td><td>11251-20</td><td></td></tr><tr><td>Stereomicroscopio</td><td>Olympus</td><td>SZX12</td><td></td></tr><tr><td>Camera</td><td>Basler</td><td>scA1390-17gc</td><td></td></tr><tr><td>Programma Image Grabber</td> Sistema di <td>acquisizione immagini</td><td>interno integrato</td><td></td></tr><tr><td>Timer</td><td>VWR</td><td>33501-418</td><td></td></tr><tr><td>Siringhe, 1 mL</td><td>Fisher</td><td>14-817-25</td><td></td></tr><tr><td>Sorgente luminosa, fibra ottica</td><td>Schott</td><td>KL1500</td><td>Idealmente ha bracci regolabili</td></tr><tr>Olio <td></td><td></td> di<td>paraffina</td><td>Multiplo equivalente</td></tr><tr><td>Name</td><td>Azienda</td><td>Numero di catalogo</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Microbubbles</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1,2-Distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine&nbsp;</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850365C</td><td></td></tr><tr><td>poliossietilene stearato</td><td>&nbsp; Sigma</td><td>p3440</td><td></td></tr><tr><td>gas perfluorobutano&nbsp;</td><td>F2 Chemicals</td><td>C4F10(g)</td><td></td></tr><tr><td>Decon FS200 bagno ad ultrasuoni&nbsp;</td><td>Decon Ultrasonics Ltd</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vialmix&nbsp;</td><td>Lantheus Medical Imaging</td><td>515370-0810</td><td></td></tr><tr><td>Multisizer Coulter Counter</td><td>Beckman Coulter Inc</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

combinato di microscopia intravital e l'ecografia contrapporre-aumentata del hindlimb mouse per studiare la perfusione del muscolo e la vasodilatazione indotta da insulina

Combined Intravital Microscopy and Contrast-enhanced Ultrasonography of the Mouse Hindlimb to Study Insulin-induced Vasodilation and Muscle Perfusion

È stato dimostrato che azioni vascolari dell'insulina contribuiscano alla regolazione della sensibilità dell'insulina. Gli effetti dell'insulina sulla perfusione muscolare regolano postprandiale consegna delle sostanze nutrienti e gli ormoni per tessuti insulino-sensibili. Qui descriviamo una tecnica per la combinazione di microscopia intravital (IVM) e l'ecografia contrapporre-aumentata (CEUS) del vano adduttore del hindlimb del mouse per visualizzare contemporaneamente le arterie di resistenza muscolare e perfusione della microcircolazione in vivo. Valutare contemporaneamente effetto dell'insulina a più livelli dell'albero vascolare è importante studiare le relazioni tra molteplici effetti vasoattivi dell'insulina e l'aspersione del muscolo. In questo studio sono stati esperimenti in topi. In primo luogo, la cannula della vena della coda viene inserita per l'infusione di anestesia, composti vasoattivi e agente di contrasto di ultrasuono (lipido-incapsulato microbolle). In secondo luogo, una piccola incisione è fatta nella zona dell'inguine per esporre l'albero arterioso del compartimento di muscolo adduttore. La sonda di ultrasuono è quindi posizionata il hindlimb superiore controlaterale per visualizzare i muscoli in sezione trasversale. Per valutare i parametri della linea di base, viene valutato il diametro arterioso e microbolle sono successivamente infuso ad un tasso costante di stimare il flusso sanguigno del muscolo e del volume sanguigno microvascolare (MBV). Quando applicato prima e durante un morsetto euglycemic hyperinsulinemic, combinato IVM e CEUS consentire la valutazione dei cambiamenti indotti da insulina di diametro arterioso, perfusione microvascolare del muscolo e la sensibilità dell'insulina del corpo intero. Inoltre, il rapporto temporale tra le risposte della microcircolazione e le arterie di resistenza all'insulina può essere quantificato. È anche possibile follow-up il tempo longitudinalmente in topi, che lo rende uno strumento prezioso per studiare i cambiamenti nella sensibilità dell'insulina vascolare e al corpo intero.

Tasso di infusione del glucosio durante il morsetto euglycemic hyperinsulinemic (la sensibilità dell'insulina) era 180,21 ± 19,81 µmol/kg/min applicazione locale di olio di paraffina nello scomparto del muscolo adduttore per stabilizzare la nave non ha cambiato il diametro medio della linea di base delle arterie (73,6 ± 29,0 µm vs 68,8 ± 17,9 µm; p = 0,58) ma ha contribuito a ridurre la variazione degli animali testati (Figura 4A). Insulina costantemente aumentati il diametro dell'arteria gracilis (14,58 ± 6,2% a 60 min; N = 9) che era significativamente differente (p &lt; 0,0001) dal cambiamento di diametro causati dall'infusione salina (-6,3 ± 4,9%; N = 6). Vasodilatazione indotta da insulina era apprezzabile dopo 10 min (10,09 ± 5,1%; p = 0,002) e raggiunge circa il 95% della sua capacità massima dilatorio dopo 30 min.
Utilizzando CEUS, insulina costantemente aumentati del muscolo MBV (Figura 5A) 33,5% (± 31.04%, N = 7; p = 0,0009) rispetto all'infusione salina (-10.63 ± 27,87%, N = 6) (figura 5B). I dati presentati sono le intensità di segnale del muscolo MBV che diviso in vasi femorali. Questo riduce la variazione sperimentale tra diverse misure e tra diversi topi (dati non mostrati). L'intensità di segnale in vasi femorali corrisponde linearmente con la concentrazione di microbolle in circolazione (Figura 3). Correzione per il segnale dei vasi femorali teoricamente corregge le differenze nelle concentrazioni di microbolle utilizzato (Figura 3D). I dati sono presentati in questa sezione come media ± deviazione standard.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig1.jpg"> Figura 1: Esposizione chirurgica del compartimento adduttore del Hindlimb. (A) un'incisione è fatta all'inguine, parallela alla direzione del legamento inguinale. (B) lieve trazione presso il cuscinetto di grasso in direzione distale (frecce nere) presenterà il tessuto connettivo (*) tra il cuscinetto di grasso e la parete addominale. (C) la pelle pieghe dell'incisione possono essere regolate utilizzando il bulldog morsetto per creare una piccola cavità per contenere l'olio di paraffina che bagna i vasi. (D), l'ultrasuono sonda viene posizionato sull'arto posteriore superiore controlaterale dopo l'arteria gracilis preparato viene visualizzato tramite un microscopio calibrato. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig2.jpg"> Figura 2: Microscopia intravital del Hindlimb Mouse. L'arteria femorale (A) dà luogo all'arteria epigastrica (B) e l'arteria gracilis (C) che corre sopra il gruppo di muscoli adduttori (D). L'arteria gracilis è utilizzato per la IVM usando un microscopio calibrato. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig3.jpg"> Figura 3: Segnale di intensità dell'ecografia contrapporre-aumentato in Volume sanguigno microvascolare del muscolo e vasi femorali. (A) vista il contrasto non lineare modalità della piattaforma di imaging digitale di imaging durante l'infusione costante di microbolle in un arto posteriore superiore di topo maschio. Pannello di destra: due ROIs sono disegnati per rappresentare il muscolo MBV e vasi femorali. Solo la parte superficiale del comparto muscolo adduttore è inclusa nel ROI come segnale di intensità diminuisce con la profondità. Pannello di sinistra: curva tempo-intensità dal muscolo MBV ROI. Linee verticali rappresentano la distruzione delle microbolle (MBD) con onde ad alta energia. Immediatamente dopo il MBD, nessun agente di contrasto è presente nel piano imaging che inizia a riempirsi di microbolle gradualmente. Dopo 10-15 s, è stato raggiunto il picco del miglioramento del contrasto. (B-D) Dopo un segnale allo steady-state è stato raggiunto, è stata raddoppiata la velocità di infusione di 2,5 x 109 bolle/mL (5, 10, 20 µ l/min). L'intensità del segnale da muscolo MBV (B) e vasi femorali (C) ha messo in parallelo il raddoppiamento della concentrazione microbolle in circolazione. (D) Correcting muscolare MBV per il segnale di vasi femorali rimuove la variabilità nell'intensità del segnale causato da microbolle diverse concentrazioni (N = 9; barre di errore rappresentano la deviazione standard). <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig4.jpg"> Figura 4: Misure di microscopia intravital dell'arteria Gracilis. (A) l'olio di paraffina riduce la variazione delle arterie gracilis di diversi animali (ovvero 29.0 µm senza paraffina vs 17,9 µm dopo aver applicato l'olio) mantenendo il diametro medio della linea di base stabile (73,6 µm vs 68,8 µm; p = 0,58). Diametri arteriosa (B) al basale e dopo 60 min di infusioni di insulina o di soluzione fisiologica. Insulina dopo 60 min infusione costantemente dilatata l'arteria gracilis (p &lt; 0,0001) rispetto all'infusione salina. (C) la vasodilatazione indotta da insulina si verifica a 10 min dopo l'inizio dell'infusione (p = 0,002) e raggiunge il 95% del massimo a 30 min. barre di errore rappresentano deviazione standard; test T di Student spaiato è utilizzato per le statistiche. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>
<img alt="Figure 5" src="/files/ftp_upload/54912/54912fig5.jpg"> Figura 5: Misure di Volume sanguigno microvascolare usando l'ecografia contrapporre-aumentata del compartimento di muscolo adduttore del Hindlimb Mouse. (A) insulina ha provocato un aumento consistente in MBV 30 min dopo l'inizio dell'infusione di insulina. (B) la differenza tra il hyperinsulinemic e le misurazioni di base (cambiamento MBV) è indicato come il reclutamento microvascolare insulina-mediato. Insulina indotto un 33,5% (± 31.04%, p = 0,016; N = 7) reclutamento microvascolare rispetto all'infusione salina (-10.63 ± 27,87%, N = 6). Barre di errore rappresentano la deviazione standard; test T di Student spaiato è utilizzato per le statistiche. <a href="http://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/54912/54912fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.</a>

Vasodilatazione indotta da insulina regola perfusione muscolare e aumenta la microvascolare superficie (reclutamento microvascolare) disponibili per lo scambio di soluti tra sangue e tessuti interstizio. Ecografia contrapporre-aumentata e microscopia intravital combinata è presentato per valutare simultaneamente l'azione dell'insulina alle imbarcazioni più grandi e la microcircolazione in vivo.

Combinato di microscopia Intravital e l'ecografia contrapporre-aumentata del Hindlimb Mouse per studiare la perfusione del muscolo e la vasodilatazione indotta da insulina

It has been demonstrated that insulin's vascular actions contribute to regulation of insulin sensitivity. Insulin's effects on muscle perfusion regulate ...

L'obiettivo generale di questa tecnica combinata di ecografia con mezzo di contrasto e microscopia intravitale è quello di visualizzare contemporaneamente le arterie muscolo-resistenti e di studiare la perfusione della microcircolazione del muscolo scheletrico in vivo. Questo metodo aiuta a rispondere a domande chiave nel campo del diabete di tipo 2 e dell'obesità sulla regolazione della sensibilità all'insulina e del flusso sanguigno d'organo. Il giorno della procedura, dopo aver disinfettato l'area operativa e l'attrezzatura con una soluzione a base di alcol, dotare un pezzo di tubo PE20 di 10 centimetri con un ago calibro 27 e collegare il tubo a un connettore a quattro vie.Inserire l'ago nella vena caudale di un topo maschio CD57 BL6 anestetizzato a digiuno da 20 a 25 grammi. E usa il gel adesivo per tessuti per fissare l'ago al tessuto cutaneo. Posiziona il mouse in posizione supina e usa del nastro termostabile per fissare i piedi, esponendo la zona della parte superiore della coscia.Utilizzando una leggera esorotazione dell'articolazione dell'anca, rivolgi le zampe degli arti posteriori verso l'alto con le ginocchia con un angolo compreso tra 40 e 60 gradi per standardizzare l'allungamento del muscolo nel compartimento adduttore della coscia. Usa una crema depilatoria per rimuovere bilateralmente i peli nella zona dell'inguine e della parte superiore della coscia, raccogliendo tutti i peli sciolti con un batuffolo di cotone umido. Quindi posizionare il topo sotto uno stereomicroscopio con un ingrandimento da 10 a 16X e praticare un'incisione di due centimetri parallela al legamento inguinale, appena lateralmente alla curvatura addominale.È importante esercitarsi nel posizionamento dell'incisione cutanea, che dovrebbe essere tagliata abbastanza piccola da non far fuoriuscire il perifemore, ma abbastanza grande da poter vedere la vascolarizzazione. Usando un morsetto per bulldog, applicare la trazione sul lato distale dell'incisione, quindi sezionare il tessuto adiposo lontano dalla parete addominale, separando delicatamente il cuscinetto adiposo dalla parete in direzione distale invece di sezionare direttamente attraverso il cuscinetto per evitare sanguinamenti. Identificare l'arteria femorale, seguendo il vaso fino alle arterie epigastrica e gracile e alla fascia profonda trasparente che copre i muscoli e i vasi.Usando una pinza affilata, tirare la fascia verso l'alto e tagliare il tessuto con le microforbici. Quindi coprire il muscolo esposto con una goccia da 200 microlitri di olio di paraffina per evitare che il tessuto si secchi e utilizzare il morsetto bulldog per sistemare queste pieghe cutanee dell'incisione per creare una piccola cavità per trattenere l'olio bagnando i vasi. Ora regola il mouse in modo che l'arteria gracile sia verticale sullo schermo del computer con un ingrandimento 16X e posiziona una fonte di luce a una distanza minima di 20 centimetri dall'arto posteriore per ridurre la conduzione del calore dalla luce.Applicare il gel di trasduzione degli ultrasuoni preriscaldato sull'arto posteriore controlaterale superiore e posizionare la sonda ecografica perpendicolarmente all'asse lungo dell'osso del femore. Regolare attentamente l'angolo e la direzione della sonda ecografica per ottenere una vista in sezione trasversale del gruppo muscolare adduttore, avendo cura di mantenere stabile la posizione della sonda per mantenere lo stesso piano di imaging per le misurazioni di base e iperinsulinemiche. Il posizionamento della sonda ecografica deve essere standardizzato in modo che la stessa porzione dell'arto posteriore superiore venga studiata in tutti i topi con la sonda nella stessa posizione per le misurazioni basali e iperinsulinemiche.Dopo aver posizionato correttamente la sonda ecografica e aver preparato con successo l'arteria gracile per le misurazioni, lasciare che i topi si stabilizzino per 30 minuti. Dopo un periodo di stabilizzazione di 30 minuti, procedere effettuando le misurazioni di base. Misurare e conservare il diametro di base dell'arteria gracile.Poiché le microbolle possono essere visualizzate solo nella modalità di contrasto dell'ecografo, impostare i parametri appropriati sul sistema di imaging per la valutazione delle microbolle. Livellare la posizione delle zone focali al centro della regione di interesse e salvare una clip di cinque secondi per il calcolo del segnale di fondo. Indirizzare le microbolle a una concentrazione da 2,5 volte 10 a 9 bolle per millilitro e agitare manualmente la fiala contenente le microbolle per ottenere una sospensione uniforme.Iniziare a infondere le microbolle attraverso la cannula della vena di coda a una velocità di cinque microlitri al minuto, mantenendo il tubo di infusione su un vortice vibrante per mantenere una sospensione uniforme di microbolle. Dopo cinque minuti di infusione continua, utilizzare la funzione di distruzione delle microbolle per generare curve di intensità temporale delle bolle a cinque e 10 minuti all'inizio dell'infusione di microbolle. Valutare la glicemia dalla vena caudale ogni cinque minuti.Dopo aver ottenuto i dati di base, iniziare il clamp iperinsulinemico-euglicemico utilizzando la cannula di coda per somministrare 200 milliunità per chilogrammo di bolo di insulina. Mantenere un'infusione continua di insulina di 7,5 milliunità per chilogrammo al minuto per 60 minuti. Il monitoraggio seriale del livello di glucosio nel sangue deve essere eseguito in gocce di sangue prelevate dalla punta della coda, come mostrato in precedenza.Utilizzare un'infusione variabile di glucosio DE al 20% per mantenere l'euglicemia. Utilizzando il software di imaging, misurare il diametro dell'arteria gracile nei punti temporali desiderati dopo l'inizio del clamp euglicemico iperinsulinemico. Dopo 25 e/o 55 minuti, iniziare la seconda misurazione ecografica iperinsulinemica con mezzo di contrasto, per monitorare il volume ematico microvascolare rispettivamente a 30 e/o 60 minuti, come appena dimostrato utilizzando la porta di anestesia per infondere le microbolle.Come dimostrato da questi dati, l'applicazione locale di olio di paraffina sul compartimento muscolare adduttore stabilizza il vaso senza modificare il diametro medio basale delle arterie e aiuta a ridurre la variazione tra gli animali testati. L'infusione di insulina aumenta costantemente il diametro dell'arteria gracile rispetto alle variazioni di diametro indotte dall'infusione salina, con una vasodilatazione indotta dall'insulina evidente dopo 10 minuti e una capacità dilatatoria massima di circa il 95% dopo 30 minuti. Utilizzando l'ecografia con mezzo di contrasto, l'insulina aumenta costantemente il volume del sangue microvascolare muscolare rispetto all'infusione salina.L'intensità del segnale nei vasi femorali corrisponde linearmente alla concentrazione di microbolle in circolazione, con aggiustamenti nel segnale del vaso femorale, correggendo teoricamente le differenze nella concentrazione di microbolle utilizzate. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in due ore, se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordarsi di utilizzare reagenti e microbolle appena preparati e di lasciare che il topo si stabilizzi per 30 minuti in anestesia continua prima di effettuare le misurazioni sperimentali.Seguendo questa procedura, è possibile testare nuovi farmaci per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio qual è l'effetto di un nuovo componente vasoattivo sul sistema vascolare. Dopo il suo sviluppo, questa tecnica ha aperto la strada agli scienziati nel campo della biologia vascolare per valutare gli effetti di nuovi trattamenti e il cambiamento di interesse nei topi norco. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come studiare contemporaneamente il diametro delle arterie muscolo-resistenti e valutare la perfusione dell'arto posteriore del topo in vivo, utilizzando la microscopia intravitale e l'ecografia con mezzo di contrasto.

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Un nuovo metodo versatile per l'osservazione del microcircolo è presentato. E 'considerato adatto per osservazione a lungo termine, e per la combinazione con interventi biologici pharmacophysiological o molecolare.

In vivo micro-circolazione di misura nel muscolo scheletrico da Intra-vitale Microscopia

La procedura chirurgica per l'induzione di ischemia degli arti posteriori unilaterale è dimostrato, con la conferma di ischemia da imaging laser Doppler perfusione.

Modello murino di ischemia degli arti posteriori

In questo video, descriviamo l'imaging intravitale di un pancreas di topo attraverso una finestra stabilizzata per la visualizzazione a lungo termine delle dinamiche cellulari.

Imaging intravitale: un metodo per l'osservazione a livello cellulare del pancreas di topo attraverso una finestra di imaging stabilizzata

Descriviamo il metodo di cellule staminali programmazione di iperespressione fattori terapeutici per angiogenesi utilizzando nanoparticelle polimeriche biodegradabili. Processi descritti includono sintesi dei polimeri, trasfezione delle cellule staminali derivate da tessuto adiposo in vitro, e convalida l'efficacia delle cellule staminali programmato per promuovere l'angiogenesi in un modello di ischemia degli arti posteriori murino.

Cellule staminali per la programmazione terapeutica angiogenesi Uso biodegradabili polimerico Nanoparticelle

L'induzione chirurgica dell'ischemia degli arti posteriori nel topo è utile per esaminare l'angiogenesi, tuttavia questa è compromessa in alcuni ceppi di topi consanguinei che mostrano una marcata necrosi tissutale indotta da ischemia. Vengono descritti metodi per indurre l'ischemia subacuta degli arti utilizzando costrittori ameroidi per aggirare questo problema attraverso l'induzione di un'occlusione arteriosa graduale.

Metodi di acuta e subacuta murino arti posteriori ischemia

Questo articolo descrive una metodologia dettagliata dell'utilizzo di una gomma di silicone radiopaco base di piombo per irrorare il vasculature murino per la quantificazione di diametro aortico in un modello murino di aneurisma e dissezione.

Analisi quantitativa di Micro-CT di Aortopathy in un modello murino di indotta da β-aminopropionitrile aneurisma e dissezione

Presentato qui è un protocollo per studiare il microcircolo coronarico nel tessuto cardiaco murino vivente monitorando ex vivo la pressione e il flusso di perfusione arteriosa che mantiene la pressione, così come i componenti dell'albero vascolare tra cui i letti capillari e i periciti, poiché l'arteria settale è cannulata e pressurizzata.

Misurazione dinamica e imaging di capillari, arterioli e periciti nel cuore del topo

Qui presentiamo un protocollo che dimostra la tecnica e i controlli necessari per l'imaging perfusione Laser Doppler per misurare il flusso sanguigno nell'arto posteriore del topo.

Imaging perfusione Doppler laser nell'hindlimb del mouse

L'imaging ad alta risoluzione in vivo del pancreas è stato facilitato con la finestra di imaging intravitale pancreatico.

Visualizzazione longitudinale stabilizzata a livello cellulare in vivo del pancreas in un modello murino con una finestra di imaging intravitale pancreatico

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

Il presente protocollo descrive un modello unico e clinicamente rilevante di arteriopatia periferica che combina l'elettrocoagulazione dell'arteria femorale e venosa con la somministrazione di un inibitore dell'ossido nitrico sintasi per indurre la cancrena degli arti posteriori nei topi FVB. La perfusione intracardiaca di DiI viene quindi utilizzata per l'imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad.

Imaging tridimensionale ad alta risoluzione della vascolarizzazione del footpad in un modello di cancrena posteriore murina

Scopri come combinare ecografia con microbolle e microscopia intravital per studiare la vasodilatazione indotta dall'insulina nell'arteria gracile del topo. Questo metodo permette di analizzare la perfusione muscolare e il reclutamento microvascolare in vivo.

Combinato di microscopia Intravital e lecografia contrapporre-aumentata del Hindlimb Mouse per studiare la perfusione del muscolo e la vasodilatazione indotta da insulina (Video) | JoVE Journal

Combinato di microscopia Intravital e l'ecografia contrapporre-aumentata del Hindlimb Mouse per studiare la perfusione del muscolo e la vasodilatazione indotta da insulina

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