Un protocollo ottimizzato per analizzare glicolisi e mitocondriale respirazione nei linfociti

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare con precisione la glicolisi e la respirazione mitocondriale nei linfociti utilizzando un saggio del flusso extracellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunometabolismo, ad esempio quali cambiamenti metabolici avvengono nelle cellule immunitarie in seguito ad attivazione, differenziazione o durante una malattia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi efficiente e in tempo reale dei profili metabolici di oltre 90 campioni contemporaneamente.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo dei linfociti, può essere applicato anche ad altre cellule, inclusi i globuli non aderenti che richiedono l'aggiunta della piastra con il minimo impatto sulla loro funzionalità. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà poiché i linfociti sono fragili e richiedono un trattamento delicato per mantenere la loro funzionalità e vitalità. Il giorno prima dell'esperimento, sollevare la cartuccia del sensore dell'analizzatore del flusso extracellulare e riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con 200 microlitri di soluzione calibrante.

Successivamente, abbassare la cartuccia sulla piastra, immergendo i sensori nella soluzione calibrante, e incubare la cartuccia durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica o azoto. La mattina seguente, ricoprire ogni pozzetto di una piastra per saggio a 96 pozzetti con 25 microlitri di soluzione adesiva e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione adesiva e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di acqua sterile.

Mentre la piastra si asciuga all'aria, posizionare un filtro cellulare da 70 micron su un tubo conico da 50 millilitri e trasferire gli organi raccolti sul filtro. Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da tre millilitri, macerare il tessuto attraverso il filtro, mantenendo costantemente umido sia il filtro che gli organi durante tutto il processo di macerazione aggiungendo tampone MS secondo necessità. Successivamente, lavare il filtro con cinque-dieci millilitri di tampone MS, quindi centrifugare la sospensione cellulare ottenuta.

Risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone ACK per la lisi dei globuli rossi. Dopo cinque minuti sul ghiaccio, ripristinare la forza con 10-20 millilitri di tampone MS e centrifugare nuovamente le cellule. Al termine della centrifugazione, posizionare un filtro cellulare da 30 micron su una provetta conica da 15 millilitri e prerisciacquare il filtro con un millilitro di tampone MS.

Risospendere le cellule in cinque millilitri di tampone MS fresco e filtrare la sospensione cellulare attraverso il setaccio per rimuovere gli aggregati di globuli rossi lisati. Aggiungere quattro millilitri di tampone MS fresco per risciacquare il tubo di lisi vuoto e far passare il risciacquo attraverso il setaccio. Contare le cellule ed aliquotare un numero appropriato di splenociti per il saggio del flusso extracellulare.

Quindi, centrifugare entrambi i campioni cellulari, risospendendo il campione di splenociti per il saggio del flusso extracellulare in cinque millilitri di mezzo RF 10 su ghiaccio. Risospendere le cellule per l'isolamento con microsfere nei volumi appropriati di cocktail di anticorpi biotinilati, microsfere magnetiche anti-biotina e buffer MS per i tempi di incubazione indicati a due-otto gradi Celsius. Al termine della seconda incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer MS fresco per ogni 1 × 10⁸ cellule.

Successivamente, posizionare la colonna appropriata sul magnete di separazione e prerisciacquare la colonna con tre millilitri di tampone MS, scartando il flusso iniziale. Posizionare un tubo conico sterile da 15 millilitri sotto la colonna e caricare sulla colonna l'intero volume del campione cellulare. Quindi risciacquare il tubo di incubazione cellulare con tre millilitri di tampone MS fresco, raccogliendo il lavaggio nel tubo conico.

Dopo aver raccolto l'ultima frazione eluita, portare il volume del tubo a 15 millilitri con tampone MS e centrifugare le cellule isolate negativamente. Successivamente, risospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo RF 10 fresco su ghiaccio. Non più di tre ore dopo l'isolamento, centrifugare tutti i campioni cellulari e risospendere i pellet in cinque millilitri del mezzo appropriato per il saggio, prima di un'ulteriore centrifugazione.

Dopo la seconda centrifugazione, risospendere i pellet alla concentrazione sperimentale appropriata per ottenere un volume finale di 180 microlitri di cellule per pozzetto in mezzo di saggio fresco e distribuire 180 microlitri di cellule in ogni pozzetto della piastra. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 25 minuti. Quindi centrifugare la piastra per far aderire saldamente le cellule al fondo dei pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatore.

Dopo 30 minuti, utilizzare una micropipetta per caricare i composti di interesse appena preparati a 37 gradi Celsius nelle porte di iniezione appropriate della cartuccia del sensore dell'analizzatore del flusso extracellulare, caricando le porte di controllo di fondo e non sperimentali con il mezzo da solo. Riposizionare la cartuccia caricata nell'incubatrice e configurare il programma del saggio del flusso extracellulare. Quindi caricare la cartuccia e avviare il programma, sostituendo la piastra di calibrazione con la piastra del saggio dopo la calibrazione, come richiesto.

Dopo il saggio del flusso extracellulare, procedere con le misurazioni del contenuto proteico. Oltre il 90% di tutte le popolazioni cellulari è vitale, con una purezza osservata tra il 98 e il 99% per i linfociti. La confluenza di ciascun tipo cellulare correla con le densità iniziali di semina.

Le concentrazioni proteiche del lisato correlano linearmente con le densità di semina, confermando che le concentrazioni proteiche possono essere utilizzate per normalizzare accuratamente i dati del flusso extracellulare. Un numero maggiore di cellule correla con una maggiore velocità misurata di consumo di ossigeno, nonché con risposte più marcate agli inibitori mitocondriali. Densità di semina più elevate producono misurazioni simili del tasso di consumo di ossigeno normalizzato in linfociti T e splenociti, mentre cinque e 1,25 volte 10 alla cinque cellule per pozzetto producono misurazioni simili del tasso di consumo di ossigeno normalizzato in cellule B.

I parametri della respirazione mitocondriale correlano linearmente anche con le densità di semina. Inoltre, il basso perdita protonica indica che la maggior parte della respirazione basale è utilizzata per la sintesi di ATP. Densità di semina più elevate determinano tassi di acidificazione extracellulare più elevati e risposte maggiori agli inibitori mitocondriali.

I parametri della glicolisi sono linearmente correlati alle densità di semina cellulare, con la densità di semina elevata determinata come la più ottimale per un saggio di stress glicolitico di successo. Il glucosio stimola leggermente la respirazione mitocondriale, che viene inibita dall'oligomicina, mentre il 2-DG non influenza significativamente il consumo di ossigeno. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei-otto ore se eseguita correttamente.

Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cellule sul ghiaccio prima dell'analisi del flusso extracellulare e di contare e seminare accuratamente le cellule. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la misurazione del potenziale mitocondriale e dell'assorbimento del glucosio possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti lo stato metabolico delle cellule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i linfociti e come eseguire un saggio del flusso extracellulare.