Name: Un protocollo ottimizzato per analizzare glicolisi e mitocondriale respirazione nei linfociti (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 40 s
Description: Impara a misurare glicolisi e respirazione mitocondriale nei linfociti con un saggio di flusso extracellulare ottimizzato. Questo metodo consente l'analisi in tempo reale del metabolismo cellulare.

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Gli autori ringraziano il Dr. Michael N. Sack (National Heart, Lung, and Blood Institute) per il supporto e la discussione, la signora Ann Kim per aver ottimizzato il protocollo di isolamento delle cellule B, il Dr. Joseph Brzostowski per il suo aiuto con la microscopia e la signora Mirna Peña per il mantenimento degli animali utilizzati. Questo studio è stato supportato dai programmi di ricerca intramurale del National Institutes of Health, dal National Institute of Allergy and Infectious Diseases e dal National Heart, Lung, and Blood Institute.

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Gli autori dichiarano di non avere interessi finanziari concorrenti. Le tariffe di accesso aperto per questo articolo sono state fornite da Agilent Technologies.

Il protocollo abbiamo sviluppato consentito per l&#39;isolamento efficiente delle sottopopolazioni linfocitarie pura e vitale, che sono stati successivamente utilizzati nell&#39;analisi flusso extracellulare a diverse concentrazioni per valutare le differenze nella glicolisi e prestazioni respirazione mitocondriale. Questo protocollo è progettato specificamente per i linfociti e affronta le considerazioni particolari relativi a questi tipi di cellule, come la bassa attività metabolica basale, fragilità, a bassa frequenza, e la loro incapacità di aderire alle piastre test. Pertanto, rispetto a protocolli precedentemente pubblicati 11,12, il nostro metodo offre una guida più conveniente e meglio ottimizzata per i ricercatori che lavorano nel campo della immunologia. Ci sono diversi passaggi critici in questo protocollo, tra cui ottenere popolazioni di cellule pure e vitali, placcatura le cellule a confluenza ottimale, e la standardizzazione delle misure di analisi di flusso extracellulari per la concentrazione di proteine ​​in ogni pozzetto. l&#39;iil numero di cellule nitial placcato entrambi potrebbero essere visualizzati al microscopio ottico ed anche essere quantificato utilizzando le misure di concentrazione di proteine. La correlazione lineare tra numero di cellule e la concentrazione proteica confermato che la concentrazione proteica può effettivamente essere usato come un modo per standardizzare gli effetti delle variazioni di numero di cellule tra diversi pozzetti. Standardizzando i ECAR e OCR risultati alle concentrazioni di proteine, abbiamo dimostrato che, nonostante inferiori confluenza delle cellule, il minor numero di 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto possono essere usati nella maggior parte dei saggi senza compromettere la qualità dei dati. Tuttavia, il limite inferiore di cellule che possono essere utilizzati variato tra i tipi di cellule e saggi. Ad esempio, mentre il minor numero di 1,25 x 10 5 cellule potrebbero essere usate per misurazioni OCR cellule B, anche 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto non erano sufficienti per valutare le prestazioni glicolitico dello stesso tipo cellulare. Perciò, fintanto che il numero di cellule non è un fattore limitante, placcatura a più90% di confluenza, che corrisponde approssimativamente a 5 x 10 5 linfociti / pozzetto, è preferibile. Ulteriore ottimizzazione potrebbe essere necessaria quando le cellule di differenti dimensioni, ad esempio in precedenza attivati ​​e sono i linfociti-utilizzati parzialmente differenziate. Inoltre, quando si utilizza linfociti primari precedentemente coltivate, potrebbe verificarsi una variazione di vitalità cellulare tra diverse condizioni di trattamento, che ridurrebbe l&#39;affidabilità della concentrazione proteica come una misura del numero di cellule dal vivo o cellule morenti può anche contribuire ai livelli di proteina misurati . In questi casi, potrebbe essere utile per ordinare le cellule vive di citometria di flusso prima di effettuare le analisi di flusso extracellulari. Nei nostri test utilizzando popolazioni di linfociti appena isolate e altamente vitali, abbiamo ottenuto dati funzionali affidabili per entrambe le misure OCR e ECAR. Mentre tutti i tipi di cellule si comportavano allo stesso modo nello stress test mitocondriale, notevoli differenze tra i tipi di cellule sono statiosservata nel test di stress glicolisi. Per esempio, le prestazioni glicolitico di cellule T naive era basso rispetto al splenociti o cellule B, e non ha cambiato con l&#39;aggiunta di oligomicina. Questa osservazione è in linea con gli studi precedentemente pubblicati 7,30, confermando la validità del nostro protocollo. In conclusione, il metodo offre un modo efficiente e conveniente per testare l&#39;attività metabolica dei linfociti utilizzando un analizzatore di flusso extracellulare, e può essere utile in una vasta gamma di studi immunologici esplorare i cambiamenti metabolici nelle cellule immunitarie upon attivazione, differenziazione cellulare oa causa a fenotipi di malattie come l&#39;infezione, autoimmunità e ematologiche maligne.

La risposta immunitaria contro gli antigeni è un equilibrio strettamente regolata tra l&#39;attivazione immunitaria e la soppressione immunitaria. L&#39;attivazione immunitaria guida la proliferazione rapida e migrazione cellulare, così come la produzione di citochine, la secrezione di anticorpi e aumento della fagocitosi in risposta stimolante, che soppressione immunitaria inibisce semplicemente questi eventi e quindi è importante nel prevenire risposte immunitarie inutili 1-6. Recenti studi hanno dimostrato che esiste un legame diretto tra lo stato di attivazione delle cellule immunitarie e l&#39;attività delle varie vie metaboliche 7. Le cellule immunitarie possono spostare tra riposo e attivati ​​gli stati passando percorsi di produzione di energia e si spegne. Inoltre, è stato osservato che i diversi tipi di cellule immunitarie possono utilizzare diverse strategie metaboliche per alimentare le loro aumentati fabbisogni energetici durante l&#39;attivazione. Ad esempio, mentre l&#39;attivazione dei linfociti T dirige cellule in uno stato quasi completamente glicolitico 8 </sup&gt;, i linfociti B attivati utilizzare un equilibrio di glicolisi e fosforilazione ossidativa 9,10. Questi studi sottolineano l&#39;importanza di indagare gli effetti di attivazione delle cellule immunitarie sul metabolismo cellulare. In tempo reale, misure simultanee del tasso di consumo di ossigeno (OCR) e tasso di acidificazione extracellulare (ECAR), come indicatori di fosforilazione ossidativa e glicolisi, è una strategia comune per affrontare gli stati di percorsi di produzione di energia 11-13. Per realizzare ciò, un analizzatore di flusso extracellulare, come la Seahorse XF 96, viene utilizzato di routine. Tale strumento può confrontare rapidamente cambiamenti di OCR e ECAR attraverso tipi di cellule o su diverse condizioni di stimolazione. Finora, vari tipi di cellule, comprese le cellule immunitarie, sono stati studiati utilizzando questi dispositivi. Tuttavia, un protocollo ottimizzato specificamente progettato per cellule immunitarie non è disponibile. Le cellule immunitarie, in particolare i linfociti, differiscono da oti suoi tipi di cellule in diversi modi critici. I linfociti sono cellule fragili che non sopravvivono per lunghi periodi in condizioni ex vivo 14-16. Questo è un problema ancora maggiore quando sono coltivate in terreni di crescita subottimale manca nutrienti essenziali, come quelli utilizzati nell&#39;analisi flusso extracellulare. A differenza di macrofagi e molte linee di cellule, linfociti non aderiscono a superfici plastiche; pertanto è fondamentale per il fissaggio della piastra di analisi senza generare stress. Infine, alcune sottopopolazioni di linfociti possono essere estremamente rari e la raccolta presso le richieste, quantità ottimali potrebbero essere impegnativo 17-19. Qui, forniamo un protocollo ottimizzato che è specificamente sviluppato per i linfociti. Utilizzando splenociti, linfociti B e ingenuo linfociti T CD4 + isolate da milza e linfonodi del mouse 20, mostriamo le caratteristiche del loro stato di riposo glicolisi e fosforilazione ossidativa a differenle densità di cellule t. I dati sono stati normalizzati per spiegare le differenze nel numero di cellule iniziali per ciascun pozzetto misurando le concentrazioni proteiche lisato cellulare saggio finale, che erano direttamente proporzionali ai numeri cellulari. Il nostro protocollo non solo fornisce le linee guida per il rapido isolamento dei linfociti vitali per saggi di flusso extracellulari, ma permette anche di lavorare a concentrazioni di cellule non ottimali senza compromettere la qualità dei dati.

<table><tbody><tr><td>PBS (pH 7,2)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>20012-050</td><td>Per fare il tampone MACS</td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina BSA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3803</td><td>Per fare il tampone MACS</td></tr><tr><td>0,5 M EDTA, pH 8</td><td>Qualità Biologico</td><td>10128-446</td><td>Per fare il tampone MACS</td></tr><tr><td>soluzione di risciacquo autoMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-091-222</td><td>Invece di PBS + EDTA per fare il tampone MS. Utilizzato anche in autoMACS Pro Separator.</td></tr><tr><td>RPMI-1640</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11875-093</td><td>Contiene rosso fenolo e L-glutammina</td></tr><tr><td>Fetale Siero Bovino</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>10437-028</td><td>Per l'inattivazione termica, scongelare il flacone di brodo congelato in un 37 &deg; C bagnomaria e poi inattivarlo a 56 &deg; C per 30 min. Aliquotare il siero inattivato termicamente per la conservazione (es. , in tubi conici da 50 ml) e congelare a -20 &deg; C fino a quando non è necessario.</td></tr><tr><td>Penicillina-Streptomicina (Pen Strep)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15140-122</td><td>Combinare Pen Strep con L-Glut 1:1 (se si producono 500 ml di terreno, per un totale di 12 ml Pen Strep/L-Glut); mantenere le aliquote a -20 &deg; C fino al momento di creare i supporti.</td></tr><tr><td>L-Glutammina 200 mM (L-Glut)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>25030-081</td><td>Componente di RF10 e terreni per prove da sforzo</td></tr><tr><td>Piruvato di sodio 100 mM</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11360-070</td><td>Componente di RF10 e terreni per prove da sforzo</td></tr><tr><td>HEPES 1 M</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>15630-080</td> Componente della soluzione di aminoacidi non essenziali <td>RF10</td></tr><tr><td>MEM (100x)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>11140-050</td><td>Componente di RF10</td></tr><tr><td>2-Mercaptoetanolo (55 mM)</td><td>Gibco-ThermoFisher</td><td>21985-023</td><td>Componente di RF10</td></tr><tr><td>Falcon 70 &mu; filtro per cellule m</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>87712</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Siringa monoject da 3 ml, punta Luer-Lock</td><td>Covidien</td> 8881513934 <td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 15 ml Provette da centrifuga coniche&nbsp;</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-959-53A</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Falcon 50 ml Provette da centrifuga coniche</td><td>Falcon-Fischer Scientific</td><td>14-432-22</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>ACK Lysing Buffer</td><td>Lonza</td><td>10-548E</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>CellTrics 30 &mu; filtro cellulare m, sterile, confezione singola</td><td>Partec CellTrics</td><td>04-004-2326</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Kit di isolamento cellulare B, topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-090-862</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Na&iuml; ve CD4+ Kit di isolamento delle cellule T, topo</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-453</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Colonna LS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-401</td><td>Utilizzato nell'isolamento cellulare</td></tr><tr><td>Separatore MidiMACS</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-302</td><td>Magnete per</td></tr><tr><td>separazione MACS MultiStand</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-042-303</td><td>Supporto per magneti</td></tr><tr><td>Soluzione di risciacquo autoMACS</td><td>130-091-222</td><td>Soluzione di risciacquo per autoMACS Pro Separator</td>Instrument autoMACS Pro Separator Miltenyi Biotec N/A 2-Deoxy-D-glucose (2-DG)Sigma-Aldrich D8375-5G Cell-Tak Corning 354240 Adesivo per cellule.<td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> Fai attenzione a notare la concentrazione, poiché ogni lotto è diverso (la confezione è da 1 mg).</td></tr><tr><td>Oligomicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>75351</td><td></td></tr><tr><td>2,4-Dinotrofenolo (2,4-DNP)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D198501</td><td></td></tr><tr><td>Antimicina A</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8674</td><td></td></tr><tr><td>Rotenone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>Glucosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td></td></tr><tr><td>Cocktail di inibitori della proteasi</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>78429</td><td>Fornito come cocktail 100x, combinare con RIPA per formare 1x soluzione per lisi.</td></tr><tr><td>RIPA Buffer</td><td>Boston BioProducts</td><td>BP-115</td><td></td></tr><tr><td>Kit per il dosaggio delle proteine BCA Pierce ThermoFisher</td><td>Scientific</td><td>23225</td><td>Seguire le istruzioni del produttore</td></tr><tr><td>Seahorse XFe96 FluxPak</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>101085-004</td><td>Include piastre per saggi, cartucce, guide di caricamento per il trasferimento dei composti alla cartuccia del saggio e soluzione calibrante.</td></tr><tr><td>Cavalluccio marino XF Base Medium</td><td>Seahorse Bioscience</td><td>102353-100</td><td>Utilizzato per preparare terreni di prova da sforzo</td></tr><tr><td>Analizzatore di flusso extracellulare Cavalluccio marino XFe96</td><td>Cavalluccio marino Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Stericup Unità filtranti sottovuoto sterili, 0,22 &; m</td><td>EMD Millipore-Fisher Scientific</td><td>SCGPU10RE</td><td>Utilizzato per la sterilizzazione dei mezzi filtranti.</td></tr><tr><td>Bicarbonato di sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>487031</td><td>disciolto a 0,1 M e utilizzato per diluire Cell-Tak.</td></tr></tbody></table>

un protocollo ottimizzato per analizzare glicolisi e mitocondriale respirazione nei linfociti

An Optimized Protocol to Analyze Glycolysis and Mitochondrial Respiration in Lymphocytes

Linfociti rispondono ad una varietà di stimoli attivando vie di segnalazione intracellulare, che a sua volta porta ad una rapida cellulare proliferazione, migrazione e differenziazione e la produzione di citochine. Tutti questi eventi sono strettamente legate allo stato di energia della cellula, e quindi studiare i percorsi che producono energia può fornire indizi circa la funzionalità complessiva di queste cellule. L&#39;analizzatore di flusso extracellulare è un dispositivo comunemente utilizzato per valutare le prestazioni di glicolisi e la respirazione mitocondriale in molti tipi cellulari. Questo sistema è stato utilizzato per studiare le cellule immunitarie in alcuni rapporti pubblicati, ancora un protocollo completo ottimizzata, particolarmente per i linfociti è carente. I linfociti sono cellule fragili che sopravvivono male in ex vivo condizioni. Sovente sottopopolazioni linfocitarie sono rari, e lavorare con il numero di cellule bassi è inevitabile. Pertanto, è necessaria una strategia sperimentale che affronta queste difficoltà. Qui, forniamo un protocolloche consente un rapido isolamento dei linfociti vitali da tessuti linfoidi, e per l&#39;analisi dei loro stati metabolici nell&#39;analizzatore flusso extracellulare. Inoltre, forniamo risultati degli esperimenti in cui sono stati confrontati le attività metaboliche dei vari sottotipi di linfociti a diverse densità cellulari. Queste osservazioni suggeriscono che il nostro protocollo può essere utilizzato per ottenere risultati coerenti e ben standardizzate anche a concentrazioni basse di cellule, e quindi può avere ampie applicazioni in studi futuri concentrandosi sulla caratterizzazione degli eventi metabolici nelle cellule immunitarie.

Le cellule eucariotiche utilizzano una rete integrata di glicolisi, il ciclo degli acidi tricarbossilici (TCA), e la fosforilazione ossidativa per soddisfare la maggior parte delle loro richieste energetiche e fornire intermedi necessari per la crescita e la proliferazione cellulare. Questi percorsi iniziano con la cattura intracellulare di glucosio libero sotto forma di glucosio-6-fosfato, che successivamente viene trasformato in piruvato. Il piruvato è sia ridotto a lattato o trasportati nei mitocondri, dove forma acetil coenzima A (CoA). Acetil-CoA entra quindi nel ciclo TCA. Intermedi ad alta energia del ciclo TCA sospingere il movimento degli elettroni nella catena di trasporto degli elettroni (ETC), che a sua volta espelle H + dalla matrice mitocondriale per generare un H + gradiente attraverso la membrana mitocondriale interna. Ossigeno agisce come accettore finale di elettroni e H + ritorno indietro alla matrice mitocondriale attraverso la F O / F &lt;sub&gt; 1 complessa, dove la loro energia potenziale è utilizzato per generare ATP (Figura 1A). Il principio di funzionamento del dosaggio flusso extracellulare dipende interferire con glicolisi e fosforilazione ossidativa in punti specifici, e valutare gli effetti derivanti. A questo scopo, abbiamo usato il glucosio per propagare glicolisi in cellule affamate, e 2-deossiglucosio (2-DG), che viene convertito in 2-deossiglucosio-6-fosfato, un inibitore competitivo di phosphoglucoisomerase 23, dall&#39;esochinasi, al fine di bloccare glicolisi. Rotenone (complesso inibitore specifico-I della ETC), antimicina A (un complesso inibitore III-specifico della ETC), oligomicina (inibitore della ATP sintasi 24), e l&#39;agente disaccoppiamento 2,4-dinotrophenol (DNP) 25 erano utilizzati per intervenire eventi specifici relativi al trasporto degli elettroni, gradiente protonico e la sintesi di ATP (Figura 1A). Invece di 2,4-DNP, cya carboniliconide-4- (trifluorometossi) fenilidrazone (FCCP) può anche essere utilizzato, ma un&#39;ulteriore ottimizzazione può essere richiesto. In entrambi i casi, uncouplers dovrebbero sempre essere titolati per uno specifico tipo cellulare prima dell&#39;uso per determinare la concentrazione ottimale necessaria. Lo stress test glicolisi (Figura 1B) inizia con una misura di base del tasso di acidificazione extracellulare (ECAR) nelle cellule in precedenza affamate. Poiché queste cellule sono al loro minima basale, e possono quindi essere praticamente considerate non glicolitico, il ECAR misurata a questo punto è indicato come l&#39;acidificazione non glicolitico. Questo acidificazione probabilmente corrisponde a CO 2 respiratoria generato nel ciclo TCA essere convertito in HCO 3 - e H +. Segue l&#39;iniezione di glucosio per attivare glicolisi, che presenta come un aumento acidificazione extracellulare causa della formazione di lattato.Questo aumento rappresenta il normale tasso di glicolisi. Le cellule sono poi sfidati con l&#39;iniezione di oligomicina, che blocca la generazione di ATP attraverso la fosforilazione ossidativa. Le cellule rispondono a questa drammatica diminuzione della produzione di ATP, attivando la glicolisi al suo livello massimo, e che si traduce in un aumento secondario del livello ECAR (riserva glicolitico). La prova viene terminata totale inibizione della glicolisi usando l&#39;analogico glucosio 2-DG, che restituisce il ECAR al suo livello non glicolitico. È interessante notare, è stato proposto che, contrariamente alle raccomandazioni del fabbricante, la glicolisi massima non è necessariamente raggiunto con l&#39;iniezione di oligomicina 26. In cellule con una elevata capacità glicolitica, se non vi è un aumento significativo della domanda ATP, glicolisi può essere perfettamente in grado di far fronte alla perdita di ATP mitocondriale senza dover essere up-regolata. Il tasso di glicolisi con oligomicina potrebbe essere superato con l&#39;aggiunta di inibitori delle vie respiratorie, Quali rotenone e myxothiazol, che forniscono alcuni vantaggi rispetto oligomicina: 1) Aumentano la domanda ATP, in cui possono causare l&#39;inversione di ATP sintasi, con idrolisi, per pompare protoni nel tentativo di recuperare il potenziale di membrana mitocondriale 26; 2) Impediscono acidificazione respiratoria del mezzo, che può confondere i risultati ECAR (vedere sotto). Altri modi per aumentare la domanda ATP includono l&#39;aggiunta di composti che stimolano l&#39;idrolisi di ATP dai ATPasi della membrana plasmatica 26. Tutto questo dovrebbe essere considerato con attenzione da parte dei ricercatori quando si pianifica un test di stress glicolisi. Lo stress test mitocondriale (Figura 1C) inizia con una misura di base del tasso di consumo di ossigeno (OCR) in cellule non-fame. Segue l&#39;iniezione di oligomicina, che inibisce il ritorno di protoni attraverso il complesso F O / F 1 e quindi hyperpolariz rapidamentees la membrana mitocondriale. Iperpolarizzazione impedisce l&#39;ulteriore protone pompaggio attraverso complessi respiratori, e il tasso diminuisce respiratorie. La respirazione rimanente viene chiamato perdita protonica, che rappresenta il flusso di protoni attraverso lipidi o altri canali. Questo stato iperpolarizzato viene rapidamente invertita mediante aggiunta dell&#39;agente disaccoppiamento 2,4-DNP, che funge da ionoforo protonico. In risposta, le cellule cercano di recuperare il potenziale di membrana in un tentativo futile aumentando la velocità di trasporto di elettroni al massimo, e questo a sua volta aumenta il OCR. Infine, con l&#39;aggiunta di due inibitori ETC (antimicina A e rotenone), respirazione mitocondriale completamente ferma e OCR diminuisce al livello più basso. A questo livello, il consumo di ossigeno non è dovuta ad attività mitocondriale (non mitocondriale). La differenza nella OCR generato da questi inibitori è chiamato respirazione mitocondriale massima, che è la somma della respirazione basale e la capacità inutilizzata. <pclass = &quot;jove_content&quot; fo: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; B e isolamenti delle cellule T resa altamente vitali popolazioni di linfociti puri. Le cellule B e le cellule T CD4 + naive sono stati isolati come indicato nella Sezione 4 del protocollo, e splenociti sono stati semplicemente ottenuti lisi dei globuli rossi, come descritto nella Sezione 3.3. La sensibilità di tipo-specifiche cellule saggi metabolici dipende la vitalità e la purezza della popolazione cellulare di partenza. Pertanto, al fine di verificare la vitalità delle cellule isolate topo T, splenociti e le cellule B, e la purezza delle cellule T e B, piccole aliquote di cellule sono state colorate per l&#39;analisi citofluorimetrica (Figura 2). Nel forward scatter-zona VS lato scatter-zona (FSC-A vs SSC-A) la trama, i linfociti sono stati gated, e all&#39;interno di questa porta, la popolazione lungo la diagonale in avanti scatter-altezzat (FSC-H) vs. FSC Una trama sono stati determinati come le canottiere. All&#39;interno della popolazione singoletto, la vitalità è stata misurata mediante gating le cellule che macchiati negativo per il / marcatore morti vivo (Figura 2A); la vitalità delle cellule T è stata 97,9%, splenocyte viabilità è stata del 92%, e la vitalità delle cellule B è stata del 94%. B purezza delle cellule, come misurato dalla B220 + CD19 + popolazione 26, era del 99%, mentre CD4 + T purezza delle cellule, come misurato dal CD44 - CD4 + popolazione 27, era 98,3% (Figura 2B). La concentrazione proteica del lisato cellulare può essere utilizzato come indicatore diretta del numero di cellule placcato. Linfociti isolati e splenociti sono state piastrate in una piastra da 96 pozzetti test adesivizzato a 5 x 10 5 cellule / pozzetto, 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto, 1,25 x 10 5 cellule / pozzetto, e 0,625 x 10 <sup&gt; 5 cellule / pozzetto. La confluenza in ciascuna densità di placcatura dei tre tipi di cellule è stato visualizzato sotto il microscopio ottico (Figura 3A). Come previsto, confluenza correlata con le densità di placcatura iniziali. Al termine del test flusso extracellulare, le cellule sono state lisate placcato e loro concentrazioni proteiche sono state quantificate usando il saggio BCA. Per tutti i tipi di cellule, concentrazioni di proteine lisato hanno dimostrato di essere linearmente correlata con la densità di placcatura iniziali (Figura 3B), il che conferma che le concentrazioni di proteine lisato possono essere usate come una misura accurata per la normalizzazione dei numeri di cellulare quando si interpretano i dati di flusso extracellulari. Le densità di placcatura utilizzati in questo esperimento sono stati ottimizzati per ingenui, i linfociti non stimolati. Se cellule stimolate o precedentemente coltivate devono essere utilizzati, può essere necessaria un&#39;ulteriore ottimizzazione. Mitocondriale e stres glycolyticsaggi s dipendono dal numero di cellulare placcato. L&#39;OCR è stata misurata per ciascun tipo di cellula e densità di placcatura in analizzatore di flusso extracellulare. Come previsto, il numero di cellule superiori hanno un OCR più alto misurato, così come risposte più drammatici oligomicina, 2,4-DNP, e antimicina A / rotenone (Figura 4A). La standardizzazione misurazioni OCR di concentrazione di proteine ​​di ogni campione rivela che, in generale, un maggior numero di cellule portano misurazioni OCR a più accurate. Placcatura a 5 e 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto provocato simili misurazioni normalizzate OCR nelle cellule T e splenociti e 5 e 1,25 x 10 5 cellule / pozzetto portato simili misurazioni normalizzate OCR in cellule B (Figura 4B). Le leggere differenze nella cellula B normalizzato misurazioni OCR potrebbe essere un&#39;indicazione indiretta che le cellule B eseguono meglio a 2,5 x 10 5 cellule / pozzetto rispetto ad altre densità cellulari. Con tutte le misure, 0,625 x 10 5 cellule / pozzetto ha dato risultati non ottimali, dimostrando che questa densità placcatura è insufficiente. La respirazione basale, perdita di protoni, massima respirazione mitocondriale, la respirazione non mitocondriale e la produzione di ATP linearmente correlati con densità di placcatura per tutti i tipi di cellule (Figura 4C). Inoltre, la maggior parte della respirazione basale è usato verso sintetizzare ATP, come indicato dalla bassa perdita protonica nelle tre tipi di cellule. Mentre l&#39;obiettivo primario dell&#39;esperimento lo stress mitocondriale è quello di misurare le variazioni OCR l&#39;ECAR è ancora utile per registrare assicurare che il saggio è stato eseguito con successo. Simile al OCR, i due densità di placcatura più elevati per effetto di accrescere ECAR e risposte più drammatici a oligomicina, 2,4-DNP, e antimicina A / rotenone (Figura 4D). I cambiamenti drammatici ECAR dopo l&#39;aggiunta di 2,4-DNP, e antimicina A / rotenone possono essere dovute a cambiamenti nella respirazione, oltre ai cambiamenti di glycolysis, poiché CO 2 generato nel ciclo TCA viene convertito HCO 3 - e H +. Questo problema è stato recentemente affrontato, e non esiste un metodo semplice per correggere il segnale totale extracellulare acidificazione utilizzando dati sul consumo di ossigeno, per ottenere il tasso reale glicolisi 12,29. Il test di stress glicolisi era di maggior successo al più alto densità di placcatura (Figura 5A, B). In tutti i tipi cellulari, i campioni 5 x 10 5 cellule / pozzetto avevano le maggiori variazioni ECAR dopo l&#39;aggiunta di glucosio, oligomicina, e 2-DG (Figura 5B). Inoltre, normalizzando di concentrazione di proteina ha dimostrato che per tutti i tipi di cellule, i 5 x 10 5 cellule / pozzetto di campioni ha dato risultati ottimali, mentre minori concentrazioni, soprattutto 0,625 x 10 5 cellule / benessere non hanno mostrano una robusta capacità di riserva glicolitico. Non-glycolytic acidificazione, la glicolisi, e la capacità glicolitico apparente linearmente correlati con densità di placcatura per tutti i tipi di cellule (Figura 5C). Per l&#39;esperimento sollecitazioni glicolisi, il grafico mostra che OCR glucosio stimola leggermente respirazione mitocondriale, che viene quindi inibita mediante trattamento oligomicina; l&#39;aggiunta di 2-DG non ha influenzato il OCR (Figura 5D). Il grafico OCR può essere utilizzato come un ulteriore indicatore che l&#39;esperimento sollecitazioni glicolisi stata effettuata con successo. Inoltre, il grafico OCR può essere utilizzato per correggere il grafico ECAR, se necessario, come spiegato in precedenza nel caso di stress test mitocondriale 12,29. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig1.jpg" /> Figura 1:. Schema di saggi flusso extracellulari (A) Illustrazione della glicolisi (sinistra) e la fosforilazione ossidativa (destra) che mostra l&#39;azione delfarmaci metabolici utilizzati nei saggi flusso extracellulari. (B) Schema del grafico tasso di acidificazione extracellulare (ECAR); schematica del grafico tasso di consumo di ossigeno (OCR) (C). <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig1large.jpg" target="_blank">Fai clic qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="figura 2" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig2.jpg" /> . Figura 2: gating graduale delle cellule T, cellule B, e splenociti per determinare la vitalità e purezza citometria a flusso trame che mostrano la vitalità delle cellule T, splenociti e le cellule B (A); e la purezza di T e cellule B (B). I risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig2large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di Th</a>è figura. <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig3.jpg" /> Figura 3: Cell. Confluenza correla con le concentrazioni di proteine lisato di ciascun tipo cellulare a differenti densità di placcatura (A) micrografie luce di cellule in pozzetti della piastra dosaggio a densità placcatura vanno da 5 x 10 5 cellule / pozzetto a 0,625 x 10 5 cellule / bene. Barre di scala denotano 50 micron. Concentrazioni di proteine (B) Lysate a diverse densità di placcatura, come misurate con il test BCA. I risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig3large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 4" src="/files/ftp_upload/54918/54918fig4.jpg" /> Figura 4:<html> Sono mostrati dosaggio mitocondriale stress. Grezzo (A) e standardizzato OCR (B) per ogni tipo di cellula e densità di placcatura. (C) numero-dipendente cellulare cambiamenti nei livelli di base, massima mitocondriale e la respirazione non mitocondriale, nonché i consumi di ossigeno legati alla perdita di protone o produzione di ATP, sono presenti per ogni tipi di cellule. Sono mostrati valori (D) grezza ECAR ottenuti dalle prove di stress mitocondriale. Ciascun punto di dati rappresenta la media di 7-8 pozzetti con deviazione standard. frecce indicano etichettati iniezioni di oligomicina (O), 2,4-DNP (D), e rotenone / antimicina A (R / A). I risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig4large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> _upload / 54918 / 54918fig5.jpg &quot;/&gt; Figura 5:. Test di stress glicolitica crudo (A) e standardizzato (B) ECAR per ciascun tipo di cellula e densità di rivestimento sono mostrati. (C) sono mostrati numero-dipendente delle cellule cambiamenti nella ECAR per l&#39;acidificazione non glicolitico, glicolisi glucosio-indotta e la capacità glicolitico totale. Vengono visualizzati i valori (D) Raw OCR ottenuti dalle prove di stress glicolitico. Ciascun punto di dati rappresenta la media di 7-8 pozzetti con deviazione standard. frecce indicano etichettati iniezioni di glucosio (G), oligomicina (O), e 2-desossiglucosio (2-DG). I risultati sono rappresentativi di almeno tre esperimenti indipendenti. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54918/54918fig5large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

Lo studio del metabolismo sta diventando sempre più rilevante per la ricerca immunologica. Qui presentiamo un metodo ottimizzato per misurare la glicolisi e la respirazione mitocondriale negli splenociti di topo e nei linfociti T e B.

Un protocollo ottimizzato per analizzare glicolisi e mitocondriale respirazione nei linfociti

Lymphocytes respond to a variety of stimuli by activating intracellular signaling pathways, which in turn leads to rapid cellular proliferation, migration ...

L'obiettivo generale di questa procedura è misurare con precisione la glicolisi e la respirazione mitocondriale nei linfociti utilizzando un saggio del flusso extracellulare. Questo metodo può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo dell'immunometabolismo, ad esempio quali cambiamenti metabolici avvengono nelle cellule immunitarie in seguito ad attivazione, differenziazione o durante una malattia. Il principale vantaggio di questa tecnica è che consente l'analisi efficiente e in tempo reale dei profili metabolici di oltre 90 campioni contemporaneamente.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sul metabolismo dei linfociti, può essere applicato anche ad altre cellule, inclusi i globuli non aderenti che richiedono l'aggiunta della piastra con il minimo impatto sulla loro funzionalità. In generale, chi si approccia per la prima volta a questo metodo potrebbe incontrare difficoltà poiché i linfociti sono fragili e richiedono un trattamento delicato per mantenere la loro funzionalità e vitalità. Il giorno prima dell'esperimento, sollevare la cartuccia del sensore dell'analizzatore del flusso extracellulare e riempire ogni pozzetto della piastra di utilità con 200 microlitri di soluzione calibrante.Successivamente, abbassare la cartuccia sulla piastra, immergendo i sensori nella soluzione calibrante, e incubare la cartuccia durante la notte in un incubatore a 37 gradi Celsius senza anidride carbonica o azoto. La mattina seguente, ricoprire ogni pozzetto di una piastra per saggio a 96 pozzetti con 25 microlitri di soluzione adesiva e incubare la piastra a temperatura ambiente per 20 minuti. Al termine dell'incubazione, aspirare la soluzione adesiva e lavare ogni pozzetto due volte con 200 microlitri di acqua sterile.Mentre la piastra si asciuga all'aria, posizionare un filtro cellulare da 70 micron su un tubo conico da 50 millilitri e trasferire gli organi raccolti sul filtro. Utilizzando lo stantuffo di una siringa sterile da tre millilitri, macerare il tessuto attraverso il filtro, mantenendo costantemente umido sia il filtro che gli organi durante tutto il processo di macerazione aggiungendo tampone MS secondo necessità. Successivamente, lavare il filtro con cinque-dieci millilitri di tampone MS, quindi centrifugare la sospensione cellulare ottenuta.Risospendere il pellet in cinque millilitri di tampone ACK per la lisi dei globuli rossi. Dopo cinque minuti sul ghiaccio, ripristinare la forza con 10-20 millilitri di tampone MS e centrifugare nuovamente le cellule. Al termine della centrifugazione, posizionare un filtro cellulare da 30 micron su una provetta conica da 15 millilitri e prerisciacquare il filtro con un millilitro di tampone MS.Risospendere le cellule in cinque millilitri di tampone MS fresco e filtrare la sospensione cellulare attraverso il setaccio per rimuovere gli aggregati di globuli rossi lisati. Aggiungere quattro millilitri di tampone MS fresco per risciacquare il tubo di lisi vuoto e far passare il risciacquo attraverso il setaccio. Contare le cellule ed aliquotare un numero appropriato di splenociti per il saggio del flusso extracellulare.Quindi, centrifugare entrambi i campioni cellulari, risospendendo il campione di splenociti per il saggio del flusso extracellulare in cinque millilitri di mezzo RF 10 su ghiaccio. Risospendere le cellule per l'isolamento con microsfere nei volumi appropriati di cocktail di anticorpi biotinilati, microsfere magnetiche anti-biotina e buffer MS per i tempi di incubazione indicati a due-otto gradi Celsius. Al termine della seconda incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione e risospendere il pellet in 500 microlitri di buffer MS fresco per ogni 1 × 10⁸ cellule.Successivamente, posizionare la colonna appropriata sul magnete di separazione e prerisciacquare la colonna con tre millilitri di tampone MS, scartando il flusso iniziale. Posizionare un tubo conico sterile da 15 millilitri sotto la colonna e caricare sulla colonna l'intero volume del campione cellulare. Quindi risciacquare il tubo di incubazione cellulare con tre millilitri di tampone MS fresco, raccogliendo il lavaggio nel tubo conico.Dopo aver raccolto l'ultima frazione eluita, portare il volume del tubo a 15 millilitri con tampone MS e centrifugare le cellule isolate negativamente. Successivamente, risospendere il pellet in cinque millilitri di mezzo RF 10 fresco su ghiaccio. Non più di tre ore dopo l'isolamento, centrifugare tutti i campioni cellulari e risospendere i pellet in cinque millilitri del mezzo appropriato per il saggio, prima di un'ulteriore centrifugazione.Dopo la seconda centrifugazione, risospendere i pellet alla concentrazione sperimentale appropriata per ottenere un volume finale di 180 microlitri di cellule per pozzetto in mezzo di saggio fresco e distribuire 180 microlitri di cellule in ogni pozzetto della piastra. Incubare le cellule a 37 gradi Celsius per 25 minuti. Quindi centrifugare la piastra per far aderire saldamente le cellule al fondo dei pozzetti e rimettere la piastra nell'incubatore.Dopo 30 minuti, utilizzare una micropipetta per caricare i composti di interesse appena preparati a 37 gradi Celsius nelle porte di iniezione appropriate della cartuccia del sensore dell'analizzatore del flusso extracellulare, caricando le porte di controllo di fondo e non sperimentali con il mezzo da solo. Riposizionare la cartuccia caricata nell'incubatrice e configurare il programma del saggio del flusso extracellulare. Quindi caricare la cartuccia e avviare il programma, sostituendo la piastra di calibrazione con la piastra del saggio dopo la calibrazione, come richiesto.Dopo il saggio del flusso extracellulare, procedere con le misurazioni del contenuto proteico. Oltre il 90% di tutte le popolazioni cellulari è vitale, con una purezza osservata tra il 98 e il 99% per i linfociti. La confluenza di ciascun tipo cellulare correla con le densità iniziali di semina.Le concentrazioni proteiche del lisato correlano linearmente con le densità di semina, confermando che le concentrazioni proteiche possono essere utilizzate per normalizzare accuratamente i dati del flusso extracellulare. Un numero maggiore di cellule correla con una maggiore velocità misurata di consumo di ossigeno, nonché con risposte più marcate agli inibitori mitocondriali. Densità di semina più elevate producono misurazioni simili del tasso di consumo di ossigeno normalizzato in linfociti T e splenociti, mentre cinque e 1,25 volte 10 alla cinque cellule per pozzetto producono misurazioni simili del tasso di consumo di ossigeno normalizzato in cellule B.I parametri della respirazione mitocondriale correlano linearmente anche con le densità di semina. Inoltre, il basso perdita protonica indica che la maggior parte della respirazione basale è utilizzata per la sintesi di ATP. Densità di semina più elevate determinano tassi di acidificazione extracellulare più elevati e risposte maggiori agli inibitori mitocondriali.I parametri della glicolisi sono linearmente correlati alle densità di semina cellulare, con la densità di semina elevata determinata come la più ottimale per un saggio di stress glicolitico di successo. Il glucosio stimola leggermente la respirazione mitocondriale, che viene inibita dall'oligomicina, mentre il 2-DG non influenza significativamente il consumo di ossigeno. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere completata in sei-otto ore se eseguita correttamente.Nel tentativo di eseguire questa procedura, è importante ricordare di mantenere le cellule sul ghiaccio prima dell'analisi del flusso extracellulare e di contare e seminare accuratamente le cellule. Dopo aver seguito questa procedura, altri metodi come la misurazione del potenziale mitocondriale e dell'assorbimento del glucosio possono essere eseguiti per rispondere a ulteriori domande riguardanti lo stato metabolico delle cellule. Dopo aver visto questo video, si dovrebbe avere una buona comprensione di come isolare i linfociti e come eseguire un saggio del flusso extracellulare.

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