Name: Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 6 s
Description: Scopri come etichettare frammenti di anticorpi in modo specifico tramite incorporazione genetica di aminoacidi contenenti azide e cicloaddizione SPAAC. Questo metodo efficiente facilita la bioconiugazione proteica per studi di biologia chimica.

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1. Costruzione plasmide <ol><li> Costruire un plasmide di espressione (pBAD-HerFab-L177TAG) che esprimesse il gene bersaglio degli anticorpi (pBAD-HerFab-WT) con il suo 6 -tag, e sostituire il codone per la leucina-177 con il codone ambra (TAG) 27, utilizzando convenzionale tecnica di mutagenesi sito-diretta. Vedere la Tabella dei Materiali. </li><li> Costruire un altro plasmide di espressione (pEVOL-AFRS) contenente i geni per il tRNA evoluta Tyr e-tRNA sintetasi coppia (AARS). Utilizzare il vettore plasmide appositamente progettato, pEVOL, per un efficiente incorporazione di UAAs. Le dettagliate protocolli di informazione plasmide e la clonazione sono descritti nella relazione precedente. 28 </li><li> Ottenere DNA plasmidico di alta qualità utilizzando kit di preparazione plasmide disponibili in commercio. Il rapporto di 260/280 di ~ 1.8 è ottimale per il DNA purificato. Se richiesto, eseguire 1% elettroforesi su gel di agarosio per verificare la purezza del DNA. </li></ol><ol><li> elettroporazione <ol><li> Aggiungere ogni DNA 1 ml di pEVOL-AFRS 28 e pBAD-HerFab-L177TAG a 20 microlitri ceppo di Escherichia coli DH10β. Mescolare delicatamente, con una pipetta. I plasmidi possono essere trasformati insieme o in reazioni indipendenti. </li><li> Per 0,1 cm cuvette, configurare le impostazioni di elettroporazione a 25 mF e 2,5 kV. </li><li> Inserire la cuvetta nella diapositiva della camera di scioccante. Spingere la slitta nella camera fino a quando la provetta entra in contatto costante con gli elettrodi da camera. </li><li> Pulse una volta premendo il pulsante di impulso fino a quando il segnale acustico della macchina elettroporazione. </li><li> Aggiungere 1 ml di brodo eccellente ottimale con catabolite rimozione (SOC) mezzo contenente 2% (w / v) triptone, 0,5% (w / v) di estratto di lievito, 10 mM NaCl, 2,5 mM KCl, 10 mM MgCl 2, e 20 mM di glucosio alla cuvetta rapidamente e trasferire il composto in una provetta. Incubare le cellule per 1 ora a 37 ° C con agitazione.</li><li> Le cellule di E. coli diffusione trasformato in lisogenia brodo (LB) piastre di agar contenenti antibiotici appropriati (35 mg / ml cloramfenicolo e 100 mg / ml ampicillina per la selezione pEVOL-AFRS e pBAD-HerFab-L177TAG, rispettivamente). Incubare le piastre a 37 ° C per 12 h. </li></ol></li><li> preparazione Cultura <ol><li> Inoculare una singola colonia trasformata in 5 ml LB medie contenenti antibiotici. Incubare per 12 ore a 37 ° C con agitazione. </li></ol></li></ol> 3. Espressione e purificazione di HerFab-L177AF <ol><li> L&#39;espressione di HerFab-L177AF <ol><li> Trasferire la coltura primaria (5 mL) in 200 mL LB contenente ampicillina media (100 ug / mL) e AF (1 mM), seguita da incubazione a 37 ° C con agitazione. NOTA: soluzione madre 100 mM AF (10 mL) è stata preparata sciogliendo 206 mg AF in 100 mM di acido cloridrico (10 mL, volume finale). </li><li> Aggiungere 2 ml di 1,6 M arabinosio (16mM concentrazione finale) quando la cultura raggiunge il log-fase (OD 550 = 0,8, OD = densità ottica). Incubare per 12 ore a 30 ° C con agitazione. </li><li> Celle di raccolta per centrifugazione a 11.000 xg per 5 min. Gettare il surnatante e congelare il pellet a -20 ° C. </li></ol></li><li> La lisi cellulare <ol><li> Risospendere il pellet di cellule in 20 mL di tampone di lisi periplasmic contenente 30 mM Tris (pH 8,0), 1 mM EDTA, 20% di saccarosio e 0,2 mg / ml di lisozima e incubare la miscela per 1 ora a 37 ° C. </li><li> Centrifugare il lisato cellulare a 18.000 xga 4 ° C per 15 min. Trasferire il surnatante in una nuova provetta e scartare il pellet. </li></ol></li><li> Ni-NTA cromatografia di affinità <ol><li> Aggiungere sospensione resina Ni-NTA ad ogni provetta da centrifuga (400 microlitri di resina per una cultura 200 mL), e mescolare delicatamente a 4 ° C per 1 h. </li><li> Versare la sospensione in una colonna polipropilene e lavare la resina tre volte con 5 mL bu lavaggioffer contenente 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 20 mM imidazolo, e 300 mm NaCl. </li><li> Eluire l&#39;anticorpo bersaglio con 300 microlitri di tampone di eluizione contenente 50 mM NaH 2 PO 4 (pH 8,0), 250 mm imidazolo, e 300 mm NaCl. </li><li> Determinare la concentrazione della proteina mutante Metodo di Bradford 29 o misurando l&#39;assorbanza a 280 nm. Calcolare il coefficiente di estinzione (75.866 M -1 cm -1) per HerFab-L177AF a 280 nm da proteine estinzione calcolatrice coefficiente utilizzando il coefficiente di estinzione (2.471 M -1 cm -1) per AF. NOTA: La sequenza aminoacidica del HerFab può essere trovata sul sito NCBI (GI: 783.282.791 e GI: 783.282.792). </li></ol></li></ol> 4. Coniugazione purificata HerFab-L177AF con Acetilene sonde Utilizzando cicloaddizione azide-alchino Strain-promossa (SPAAC) <ol><li> Aggiungere 20 ml di Cy5.5-Azadibenzocyclooctyne (Cy5.5-ADIBO) in H 2 O (20081; M concentrazione finale) ad una soluzione di 10 ml di HerFab-L177AF (10 mM concentrazione finale) in tampone fosfato contenente 10 mM Na 2 HPO 4 (pH 7,0) e 100 mM NaCl. NOTA: Come alternative, cyclooctyne difluorinated (DIFO) e biciclo [6.1.0] nonyne (BCN) derivati ​​sono disponibili per la stessa applicazione anche. </li><li> Lasciare che la reazione di cicloaddizione strain-promosso procedere per 6 ore a 37 ° C. Se viene utilizzata una sonda fotosensibile (ad esempio, Cy5.5), coprire il recipiente di reazione con un foglio di alluminio. </li><li> Purificare il HerFab etichettati in base al punto 5. </li></ol> 5. Purificazione di etichetta HerFab <ol><li> Aggiungere 500 ml di campione in una colonna di filtro rotativo centrifugo. </li><li> Centrifugare la colonna di spin a 14000 g a 4 ° C per 15 min. </li><li> Gettare flusso continuo e il trasferimento purificati campione dalla colonna di selezione per una provetta da microcentrifuga da 1,5. </li><li> In alternativa al passo 5.1 5.3, eseguire purificazione mediante dialisi contro lo stesso tampone. </li><li> Conservare il purificato etichettato HerFab a 4 ° C. </li></ol> 6. SDS-PAGE analisi di etichetta HerFab <ol><li> Aggiungere 5 ml LDS tampone proteica contenente 106 mm Tris · HCl, 141 mm di base Tris (pH 8,5), 2% LDS, 10% glicerolo, 0,51 mm EDTA, di 0,22 mm SERVA Blu G250, e 0,175 mm Rosso fenolo a 13 ml di purificato etichettati HerFab (7.8 mM o 0,38 mg / ml) in presenza (+) o in assenza (-) di 2 microlitri ditiotreitolo (DTT, 100 mM concentrazione finale). Incubare la miscela a 95 ° C per 10 min. </li><li> Fissare il 4-12% Bis-Tris gel SDS-PAGE cassette alla cella di elettroforesi e aggiungere tampone di corsa. Caricare i campioni di proteine ​​coniugate e il marcatore di peso molecolare pre-colorato. Eseguire l&#39;elettroforesi su gel per 35 minuti a 200 V. Nota: Mantenere la cella di elettroforesi al buio durante l&#39;intero periodo per ridurre al minimo fotometabolismo del fluoroforo. </li><li> Dopo l&#39;elettroforesi, trasferireil gel ad uno scanner gel fluorescenti, e scansione per l&#39;emissione di fluorescenza alla lunghezza d&#39;onda appropriata. Per Cy5.5, utilizzare la modalità Cy5 nel software dello scanner. </li><li> Macchia il gel con una macchia proteine ​​commerciale. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

L&#39;incorporazione genetica di aminoacidi non naturali in proteine ​​ha diversi vantaggi rispetto ad altri metodi utilizzati per la modifica della proteina. 1-3 Uno dei vantaggi importanti è la sua applicabilità generale a qualsiasi tipo di proteina. In linea di principio, non vi è alcuna limitazione nella scelta di una proteina bersaglio e un sito target della proteina. Tuttavia, la sostituzione di un residuo strutturalmente o funzionalmente importante con SAU può comportare alterando la struttura e la fun...

Dal momento che la costituzione genetica di p -methoxyphenylalanine in Escherichia coli è stato segnalato, 1 più di 100 amminoacidi non naturali (UAAs) sono stati inseriti con successo in varie proteine. 1-3 Tra questi UAAs, gli aminoacidi contenenti gruppi funzionali bioorthogonal sono stati ampiamente studiati e rappresentano la percentuale più elevata. I gruppi funzionali bioorthogonal utilizzati nei UAAs includono chetone, 4 azide, 5 alchino, 6 cyclooctyne, 7 tetrazina, 8 α, β-insaturo ammide, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 e biciclo [6.1.0] -nonyne. 11 Sebbene ogni gruppo funzionale ha i suoi vantaggi e svantaggi, gli amminoacidi azide contenenti più sono stati ampiamente utilizzati per la coniugazione di proteine. p -Azidophenylalanine (AF), uno degli amminoacidi azido-contenente, è prontamente disponibile, e la sua incorporazione efficiency è eccellente. proteine ​​mutanti contenenti questo aminoacido può essere fatto reagire con alchini di cicloaddizione di rame-catalizzata o con cyclooctynes ​​di SPAAC. 12-20 Recentemente, biofarmaceutici hanno attratto grande attenzione nel settore farmaceutico. Il coniugato anticorpo-farmaco (ADC) è una classe di anticorpi terapeutici che sono vantaggiosi per la loro capacità di terapia mirata per il trattamento dei tumori umani 21 e altre malattie. Più di 50 ADC sono attualmente in sperimentazione clinica, e il numero è in rapido aumento. Nello sviluppo di ADC, molti fattori devono essere considerati per massimizzare l&#39;efficacia e minimizzare gli effetti collaterali. Tra questi fattori, una reazione di coniugazione efficiente e sito-specifica per formare un legame covalente tra un anticorpo ed un farmaco è critica. L&#39;efficienza desiderata e specificità nella reazione di coniugazione può essere ottenuto mediante coniugazione con un gruppo funzionale in un bioorthogonalamminoacido non naturale che è specificamente incorporata in un anticorpo. 22-26 Qui, si segnala un protocollo al sito-specifico incorporano AF in un frammento di anticorpo e coniugare il frammento di anticorpo mutante con una sonda biochimico.

<table><tbody><tr><td colspan="4">1. Costruzione del plasmide</pBAD_HerFab_L177TAG</td></tr> <tr><td></td><td></td><td>plasmidi</td>> <td>opzionalmente contiene il codone di stop ambrato (TAG) in una posizione desiderata. Ko, W. et al. Marcatura efficiente e sito-specifica degli anticorpi mediante cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015)</td></tr><tr><td>plasmide pEvol-AFRS</td><td></td><td></td><td>Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., e Schultz, P. G. Un sistema potenziato per la mutagenesi innaturale degli aminoacidi in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/jmb.2009.10.030, (2010)</td></tr><tr><td>DH10B</td><td>Invitrogen</td><td>C6400-03</td><td>Expression Host</td></tr><tr><td>Plasmid Mini-prep kit</td><td>Nucleogen</td><td>5112</td><td>200/pack</td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Introne biotecnologia</td><td>32034</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td>Bromuro di etidio</td><td>Alfa Aesar</td><td>L07482</td><td>1 g</td></tr><tr><td>LB Brodo</td><td>BD Difco</td><td>244620</td><td>500&nbsp; g</td></tr><tr><td colspan="4">2. Preparazione della coltura</td></tr><tr><td colspan="4">2.1 Elettroporazione</td></tr><tr><td>Micro pulsatore</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2100</td><td></td></tr><tr><td>Cuvetta per micro pulsatore</td><td>BIO-RAD</td><td>165-2089</td><td>0.1&nbsp; cm interasse tra gli elettrodi, confezione da 50</td></tr><tr><td>Ampicillina Sodium</td><td>Wako</td><td>018-10372</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Cloramfenicolo</td><td>Alfa Aesar</td><td>B20841</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Agar</td><td>SAMCHUN</td><td>214230</td><td>500 g</td></tr><tr><td>SOC medium</td><td>Sigma</td><td>S1797</td><td>100 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3. Espressione e purificazione di HerFab-L177AF</td></tr><tr><td colspan="4">3.1 Espressione di Herfab-L177AF</td></tr><tr><td>p-azido-L-fenilalanina (AF)</td><td>Bachem</td><td>F-3075.0001</td><td>1 g</td></tr><tr><td>L(+)-arabinosio, 99%</td><td>Acros</td><td>104981000</td><td>100 g</td></tr><tr><td>Acido cloridrico, 35~37%</td><td>SAMCHUN</td><td>H0256</td><td>500 mL</td></tr><tr><td colspan="4">3.2 Lisi cellulare</td></tr><tr><td>Tris(idrossimetil)amminometano, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>T1351</td><td>500 g</td></tr><tr><td>EDTA sale disodico diidrato, 99,5%</td><td>SAMCHUN</td><td>E0064</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Saccarosio</td><td>Sigma</td><td>S9378</td><td>500 g</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Siyaku</td><td>126-0671</td><td>1 g</td></tr><tr><td colspan="4">3.3 Cromatografia di affinità Ni-NTA</strongResina ></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>QIAGEN</td><td>30210</td><td>25 mL</td></tr><tr><td>Colonna in polipropilene</td><td>QIAGEN</td><td>34924</td><td>50/confezione, capacità 1 mL</td></tr><tr><td>Imidazolo, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>I0578</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Fosfato di sodio monobasico, 98%</td><td>SAMCHUN</td><td>S0919</td><td>1 kg</td></tr><tr><td>Cloruro di sodio, 99%</td><td>SAMCHUN</td><td>S2907</td><td>1 kg</td></tr><tr><td colspan="4"><forte>4. Coniugazione di HerFab-L177AF purificato con sonde alchine utilizzando la cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo (SPAAC)</td></tr><tr><td>Cy5.5-ADIBO&nbsp;</td><td>FutureChem</td><td>FC-6119</td><td>1 mg</td></tr><tr><td colspan="4">5. Purificazione dei filtri centrifughi HerFab</td></tr><tr><td>Amicon Ultra da 0,5 mL</td><td>MILLIPORE</td><td>UFC500396</td><td>96/confezione, 500 &#956; L capacity</td></tr><tr><td colspan="4">6. Analisi SDS-PAGE di HerFab marcato e scansione su gel fluorescente</td></tr><tr><td>1,4-Ditio-DL-treitolo, DTT, 99,5%</td> <td>Sigma</td><td>10708984001</td><td>10 g</td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Sample Buffer, 4x</td><td>Thermofisher</td><td>NP0007</td><td>10 mL</td></tr><tr><td>MES tampone di corsa</td><td>Thermofisher</td><td>NP0002</td><td>500 mL</td></tr><tr><td>Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gel</td><td>Thermofisher</td><td>NO0321</td><td>12 pozzetti</td></tr><tr><td>Coomassie Brilliant Blue R-250</td><td>Wako</td><td>031-17922</td><td>25 g</td></tr><tr><td>Typhoon 9210 imager a modalità variabile</td><td>Amersham Biosciences</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino strain-promosso site-specific

Efficient and Site-specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-alkyne Cycloaddition

Ci sono attualmente molti strumenti chimici a disposizione per introdurre sonde chimiche in proteine ​​per studiare la loro struttura e funzione. Un metodo utile è la coniugazione di proteine ​​geneticamente introducendo un amminoacido non naturale contenente un gruppo funzionale bioorthogonal. Questo rapporto descrive un protocollo dettagliato per site-specific anticorpi coniugazione. Il protocollo comprende dettagli sperimentali per la costituzione genetica di un aminoacido azide contenenti, e la reazione di coniugazione per cicloaddizione azide-alchino strain-promosso (SPAAC). Questa reazione strain-promosso procede per semplice miscelazione delle molecole reagenti a pH fisiologico e temperatura, e non richiede reagenti aggiuntivi come rame (I) ioni e leganti rame-chelanti. Pertanto, questo metodo sarebbe utile per la coniugazione di proteine ​​generale e sviluppo di anticorpi coniugati farmaco (ADC).

In questo studio, un frammento di anticorpo era sito-specifico coniugato con un fluorocromo incorporando un aminoacido azide contenente nel frammento e reagire il frammento di anticorpo mutante con un cyclooctyne teso (Figura 1). HerFab è stato selezionato come il frammento di anticorpo di destinazione in cui AF è stato accolto come un aminoacido azide contenenti. Per scegliere il residuo in HerFab per la sostituzione con AF, la struttura cristallina ai raggi X del HerFa...

Qui, presentiamo un protocollo per introdurre sonde chimiche sito-specifiche in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide, e successivamente accoppiando l'azide con una sonda chimica mediante cicloaddizione azide-alchino promossa dal ceppo (SPAAC).

Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

There are currently many chemical tools available to introduce chemical probes into proteins to study their structure and function. A useful method is ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre sonde chimiche sito-specifiche in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia chimica, come la modifica, l'ingegneria e la coniugazione delle proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la sonda o il brodo target possono essere introdotti in modo specifico nel sito nelle proteine o negli anticorpi mediante una semplice miscelazione.Dopo aver costruito i plasmidi, aggiungere un microlitro di ciascuno a 20 microlitri di ceppo DH10-beta di E.Coli a una concentrazione di due volte 10 alle otto cellule per microlitro in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente la soluzione. Quindi mettere 20 microlitri della soluzione miscelata in una cuvetta pulita.Impostare la macchina per elettroporazione su 25 microfarad e 2,5 kilovolt. Quindi inserire la cuvetta nel vetrino della camera di shocking. Spingere il vetrino nella camera fino a quando la cuvetta non entra in contatto con gli elettrodi della camera.Premere una volta il pulsante a impulsi fino a quando la macchina per elettroporazione non emette un segnale acustico. Successivamente, aggiungere rapidamente un millilitro di terreno SOC alla cuvetta. Quindi trasferire la miscela in una provetta.Incubare agitando a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, distribuire le cellule di E.Coli trasformate su piastre di agar per brodo di lisogenia contenenti antibiotici appropriati. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12 ore.Al termine dell'incubazione della piastra, inoculare una singola colonia trasformata in cinque millilitri di terreno LB contenente antibiotici. Incubare agitando per 12 ore a 37 gradi Celsius. Quindi trasferire la coltura primaria in 200 millilitri di terreno LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e un millimolare di AF. Incubare agitando a 37 gradi Celsius per almeno tre ore.Aggiungere due millilitri di arabinosio molare da 1,6 quando la coltura raggiunge una densità ottica di 0,8 a 550 nanometri. Quindi incubare agitando a 30 gradi Celsius per 12 ore. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 11.000 volte g per cinque minuti.Scartare il surnatante e congelare il pellet a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Quando si è pronti per lisare le cellule, sospendere nuovamente il pellet in 20 millilitri di tampone di lisi paraplasmatica in una nuova provetta da centrifuga. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora.Quindi, centrifugare il lisato cellulare a 18.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo e scartare il pellet. Quindi aggiungere 400 microlitri di una sospensione di resina Ni-NTA.Utilizzando un rotatore, agitare delicatamente il tubo per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine della miscelazione, versare la sospensione in una colonna di polipropilene. Lavare la resina tre volte con cinque millilitri di tampone di lavaggio.Eluire l'anticorpo bersaglio con 300 microlitri di tampone di eluizione. Successivamente, determinare la concentrazione della proteina mutante come indicato nel protocollo di testo. Iniziare aggiungendo 10 microlitri di una soluzione da 10 micromolari di HerFab-L177AF in tampone fosfato contenente 10 millimolari di sodio fosfato bibasico e 100 millimolari di cloruro di sodio a una nuova provetta da centrifuga.Quindi aggiungere 20 microlitri di una soluzione da 200 micromolari di Cy 5,5 azadibenzocicloottino in acqua. Successivamente, coprire il recipiente di reazione con un foglio di alluminio. Lasciare che la reazione di cicloedizione promossa dalla colorazione proceda per sei ore a 37 gradi Celsius.Una volta completata la reazione, aggiungere 30 microlitri di campione e 450 microlitri di tampone fosfato per lavare il colorante Cy 5.5 libero in una colonna di centrifuga con filtro. Centrifugare la colonna di centrifuga a 14.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il flusso continuo e quindi trasferire il campione purificato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.Conservare l'HerFab purificato etichettato a quattro gradi Celsius a meno che non sia pronto per l'analisi. Inizia aggiungendo 13 microlitri di HerFab purificato da 7,8 micromolari a un tubo nuovo. Quindi aggiungere cinque microlitri di tampone per campioni di proteine LDS.Incubare la miscela a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, collegare la cassetta di gel SDS-PAGE da quattro al 12% di Bis-Tris alla cella di elettroforesi. Aggiungere il buffer in esecuzione.Quindi, caricare i campioni di proteine coniugate nel pesatore molecolare precolorato. Eseguire l'elettroforesi su gel per 35 minuti a 200 volt. Al termine dell'elettroforesi, trasferire il gel in un sistema di documentazione e analisi del gel.Scansiona il Cy 5.5 e poi colora il gel con una macchia proteica commerciale. In questo studio, il frammento di anticorpo Her-Fab è coniugato in modo sito-specifico con un Ciò si ottiene incorporando un amminoacido contenente azide nel frammento e quindi facendo reagire il frammento di anticorpo mutante con un cicloottino teso. L'analisi SDS-PAGE viene eseguita per proteine mutanti espresse sia con che senza l'amminoacido contenente azide.Come si può notare, il frammento di anticorpo a lunghezza intera è stato ottenuto solo in presenza dell'amminoacido. L'anticorpo contenente l'amminoacido viene valutato per la coniugazione tramite reazione con un derivato dell'azadibenzociclootttina legato a Cy 5.5 Cy 5.5 e analizzato mediante SDS-PAGE. Le immagini a fluorescenza mostrano la coniugazione del frammento di anticorpo mutante con Cy 5.5, mentre non è stata osservata alcuna coniugazione nel controllo.Una volta espressa e purificata correttamente la proteina con acetilfenilalanina, la proteina può essere etichettata in modo efficiente con una sonda con il ceppo Poiché la reazione di marcatura non richiede reagenti aggiuntivi, è possibile introdurre la sonda nella proteina target semplicemente mescolando la sonda con la proteina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come introdurre una sonda chimica sito-specifica in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide.

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Particelle di adenovirus sono progettati per contenere l'innaturale azidohomoalanine analogo dell'acido amino o lo zucchero...

Modifica Chemoselective delle superfici virali tramite Chimica Click Bioorthogonal

Abbiamo geneticamente codificare l'amminoacido non naturale, p-azido-L-fenilalanina in varie posizioni mirate a GPCR e mostra la versatilità del gruppo azido in diverse applicazioni. Questi includono una tecnologia photocrosslinking mirato a identificare i residui nella tasca-ligando di un GPCR, e site-specific modifica bioorthogonal di GPCR con un tag peptide-epitopo o sonda fluorescente.

Molecular Probes geneticamente codificati a studiare G recettori accoppiati alle proteine

DNA e proteine ​​sono la sequenza-specifica etichettati con affinità o gruppi reporter fluorescente con DNA o proteine ​​metiltransferasi e analoghi cofattore sintetici. A seconda della specificità cofattore di enzimi, aziridina o doppi analoghi cofattore attivati ​​sono impiegati per l'etichettatura di uno o due step.

Specifici Sequenza Etichettatura degli acidi nucleici e proteine ​​con metiltransferasi e cofattore Analoghi

I coloranti fotostabili della cianina sono attaccati agli oligonucleotidi per monitorare l'ibridazione mediante trasferimento di energia.

Sintesi della lunghezza d&#39;onda-shifting DNA sonde di ibridazione utilizzando Fotostabile Cyanine Coloranti

Descriviamo qui un metodo per l'identificazione di proteine che legano piccole molecole utilizzando l'etichettatura di fotoaffinità. Il vantaggio di questa tecnica è che il legame e la marcatura covalente delle proteine bersaglio avvengono all'interno dell'ambiente cellulare vivo, eliminando il rischio di interrompere la struttura proteica nativa e le condizioni di legame dopo la lisi cellulare.

L&#39;identificazione di piccole proteine ​​che legano molecole in un nativo Cellular ambiente da Live-cell Photoaffinity Etichettatura

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Un protocollo ottimizzato per la radiomarcatura efficiente di oro nanoparticelle utilizzando un<sup&gt; 125</sup&gt; Azide gruppo I-etichettati protesico

Un'analisi di fluorescenza facile è presentata per valutare l'efficienza di amino-acil-tRNA-sintetasi/tRNA coppie conglobando amino acidi non canonico (ncAAs) proteine espresse nelle cellule di mammifero. L'applicazione di ncAAs per studiare i recettori accoppiati a proteine G (GPCR) è descritto, tra cui la mappatura foto-reticolazione di associazione siti e bioorthogonal GPCR etichettatura su cellule vive.

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