Efficiente e anticorpi etichettatura per cicloaddizione azide-alchino Strain-promosso site-specific

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di introdurre sonde chimiche sito-specifiche in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia chimica, come la modifica, l'ingegneria e la coniugazione delle proteine. Il vantaggio principale di questa tecnica è che la sonda o il brodo target possono essere introdotti in modo specifico nel sito nelle proteine o negli anticorpi mediante una semplice miscelazione.

Dopo aver costruito i plasmidi, aggiungere un microlitro di ciascuno a 20 microlitri di ceppo DH10-beta di E.Coli a una concentrazione di due volte 10 alle otto cellule per microlitro in una provetta da centrifuga da 1,5 millilitri. Utilizzare una pipetta per mescolare delicatamente la soluzione. Quindi mettere 20 microlitri della soluzione miscelata in una cuvetta pulita.

Impostare la macchina per elettroporazione su 25 microfarad e 2,5 kilovolt. Quindi inserire la cuvetta nel vetrino della camera di shocking. Spingere il vetrino nella camera fino a quando la cuvetta non entra in contatto con gli elettrodi della camera.

Premere una volta il pulsante a impulsi fino a quando la macchina per elettroporazione non emette un segnale acustico. Successivamente, aggiungere rapidamente un millilitro di terreno SOC alla cuvetta. Quindi trasferire la miscela in una provetta.

Incubare agitando a 37 gradi Celsius per un'ora. Al termine dell'incubazione, distribuire le cellule di E.Coli trasformate su piastre di agar per brodo di lisogenia contenenti antibiotici appropriati. Incubare le piastre a 37 gradi Celsius per 12 ore.

Al termine dell'incubazione della piastra, inoculare una singola colonia trasformata in cinque millilitri di terreno LB contenente antibiotici. Incubare agitando per 12 ore a 37 gradi Celsius. Quindi trasferire la coltura primaria in 200 millilitri di terreno LB con 100 microgrammi per millilitro di ampicillina e un millimolare di AF. Incubare agitando a 37 gradi Celsius per almeno tre ore.

Aggiungere due millilitri di arabinosio molare da 1,6 quando la coltura raggiunge una densità ottica di 0,8 a 550 nanometri. Quindi incubare agitando a 30 gradi Celsius per 12 ore. Al termine dell'incubazione, raccogliere le cellule mediante centrifugazione a 11.000 volte g per cinque minuti.

Scartare il surnatante e congelare il pellet a una temperatura negativa di 20 gradi Celsius. Quando si è pronti per lisare le cellule, sospendere nuovamente il pellet in 20 millilitri di tampone di lisi paraplasmatica in una nuova provetta da centrifuga. Incubare la miscela a 37 gradi Celsius per un'ora.

Quindi, centrifugare il lisato cellulare a 18.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Trasferire il surnatante in un tubo nuovo e scartare il pellet. Quindi aggiungere 400 microlitri di una sospensione di resina Ni-NTA.

Utilizzando un rotatore, agitare delicatamente il tubo per un'ora a quattro gradi Celsius. Al termine della miscelazione, versare la sospensione in una colonna di polipropilene. Lavare la resina tre volte con cinque millilitri di tampone di lavaggio.

Eluire l'anticorpo bersaglio con 300 microlitri di tampone di eluizione. Successivamente, determinare la concentrazione della proteina mutante come indicato nel protocollo di testo. Iniziare aggiungendo 10 microlitri di una soluzione da 10 micromolari di HerFab-L177AF in tampone fosfato contenente 10 millimolari di sodio fosfato bibasico e 100 millimolari di cloruro di sodio a una nuova provetta da centrifuga.

Quindi aggiungere 20 microlitri di una soluzione da 200 micromolari di Cy 5,5 azadibenzocicloottino in acqua. Successivamente, coprire il recipiente di reazione con un foglio di alluminio. Lasciare che la reazione di cicloedizione promossa dalla colorazione proceda per sei ore a 37 gradi Celsius.

Una volta completata la reazione, aggiungere 30 microlitri di campione e 450 microlitri di tampone fosfato per lavare il colorante Cy 5.5 libero in una colonna di centrifuga con filtro. Centrifugare la colonna di centrifuga a 14.000 volte g per 15 minuti a quattro gradi Celsius. Scartare il flusso continuo e quindi trasferire il campione purificato in una provetta da microcentrifuga da 1,5 millilitri.

Conservare l'HerFab purificato etichettato a quattro gradi Celsius a meno che non sia pronto per l'analisi. Inizia aggiungendo 13 microlitri di HerFab purificato da 7,8 micromolari a un tubo nuovo. Quindi aggiungere cinque microlitri di tampone per campioni di proteine LDS.

Incubare la miscela a 95 gradi Celsius per 10 minuti. Dopo l'incubazione, collegare la cassetta di gel SDS-PAGE da quattro al 12% di Bis-Tris alla cella di elettroforesi. Aggiungere il buffer in esecuzione.

Quindi, caricare i campioni di proteine coniugate nel pesatore molecolare precolorato. Eseguire l'elettroforesi su gel per 35 minuti a 200 volt. Al termine dell'elettroforesi, trasferire il gel in un sistema di documentazione e analisi del gel.

Scansiona il Cy 5.5 e poi colora il gel con una macchia proteica commerciale. In questo studio, il frammento di anticorpo Her-Fab è coniugato in modo sito-specifico con un Ciò si ottiene incorporando un amminoacido contenente azide nel frammento e quindi facendo reagire il frammento di anticorpo mutante con un cicloottino teso. L'analisi SDS-PAGE viene eseguita per proteine mutanti espresse sia con che senza l'amminoacido contenente azide.

Come si può notare, il frammento di anticorpo a lunghezza intera è stato ottenuto solo in presenza dell'amminoacido. L'anticorpo contenente l'amminoacido viene valutato per la coniugazione tramite reazione con un derivato dell'azadibenzociclootttina legato a Cy 5.5 Cy 5.5 e analizzato mediante SDS-PAGE. Le immagini a fluorescenza mostrano la coniugazione del frammento di anticorpo mutante con Cy 5.5, mentre non è stata osservata alcuna coniugazione nel controllo.

Una volta espressa e purificata correttamente la proteina con acetilfenilalanina, la proteina può essere etichettata in modo efficiente con una sonda con il ceppo Poiché la reazione di marcatura non richiede reagenti aggiuntivi, è possibile introdurre la sonda nella proteina target semplicemente mescolando la sonda con la proteina. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come introdurre una sonda chimica sito-specifica in un frammento di anticorpo incorporando geneticamente un amminoacido contenente azide.