Name: Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 24 s
Description: Scopri l'isolamento e la coltura di cellule staminali neurali adulte dalla zona subcallosa del topo. Questo metodo permette di espandere le cellule in sistemi di coltura non aderenti e aderenti per studiare la neurogenesi adulta.

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Questo lavoro è stato sostenuto dal Programma di Ricerca sul Cervello attraverso la National Research Foundation (NRF), finanziato dal Ministero coreano della Scienza, delle TIC e della Pianificazione Futura (Sovvenzioni NRF-2015M3C7A1028790); e da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (HI14C3347).

1. Preparazione dei Materiali e terreno di coltura <ol><li> Per la dissezione e la dissociazione del SCZ, avvolgere la matrice del cervello, lama a doppio taglio di rasoio, e pinze con un foglio di alluminio, e poi sterilizzare in autoclave. </li><li> Preparare 50 ml di tampone PBS freddo per lavare l&#39;intero cervello di topo. </li><li> Impostare un microscopio dissezione e preparare gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione del cervello (forbici e pinze in autoclave) e l&#39;isolamento del (ml siringa da 1, 30 ago G, matrice del cervello, e una pinza sottile) SCZ. </li><li> Preparazione di N2 Media: <ol><li> Preparare F-12 / DMEM (+ L-Glutamin, + bicarbonato di sodio), media con 2% B27, 1% integratori N2, e l&#39;1% penicillina-streptomicina. Nota: Il mezzo di crescita è costituito da N2 medie e fattori di crescita (20 ng / mL purificata fattore di crescita epidermico (EGF) e 20 ng / mL di base del fattore di crescita dei fibroblasti (bFGF2)). </li></ol></li><li> Preparare un tampone di digestione (40 unità / ml papaina, 2,4 unità / ml dispase II, e 2% di penicillina-streptomicina in PBS) per la digestione dei tessuti. </li><li> Preparazione del piatto del rivestimento e Coverslip: <ol><li> Preparare poli-L-ornitina (OLP; 0,01%) e laminina (10 mg / ml disciolti in DH 2 O). Per cappotto 6 pozzetti per la manutenzione del SCZ-aNSCs come un monostrato o 18 coprioggetto mm per immunocolorazione, incubare con OLP notte a 4 ° C. Poi lavare 3 volte con DH 2 O. Lasciare le piastre e coprioggetti ad asciugare dopo l&#39;ultimo lavaggio. </li><li> Successivamente, incubare le piastre con laminina notte a 4 ° C. Poi, lavarli 3 volte con DH 2 O. Attenzione: Non asciugare la laminina, che interesserà l&#39;adesione cellulare. Nota: Le soluzioni di rivestimento possono essere riutilizzati per 3 volte. </li></ol></li></ol> 2. Isolamento e la dissociazione della Adult SCZ <ol><li> Prima della preparazione della cultura, posizionare la matrice del cervello e rasoio a doppio taglio sul ghiaccio. Nota: Non congelare la matrice cerebrale, perché il brain potrebbe allegare alla stessa. </li><li> Sacrifica un mouse (8 settimane) di CO 2 asfissia o dislocazione cervicale. <ol><li> Tagliare la testa con le forbici affilate dopo la spruzzatura il 70% di etanolo. Per immobilizzare la testa, tenere entrambi i lati della testa ermeticamente. Tagliare la pelle con le forbici sulla linea mediana in una direzione caudale-rostrale. Questo promuove la rimozione completa della pelle dal cranio. </li><li> Rimuovere la parte caudale del cranio (posteriore al lambda) prima, e quindi inserire la pinza tra il cranio e il cervello in posizione dorsale linea mediana. Afferra il sinistro (o destro) osso parietale e con attenzione buccia fuori. Ripetere questa procedura per la rimozione dell&#39;altro osso parietale. Nota: disconnessione del nervo ottico e la rimozione delle meningi dal cervello renderlo più facile da staccare il cervello dal cranio. </li><li> Trasferire il cervello a tampone PBS freddo (25 ml) e sciacquarlo due volte per rimuovere il sangue in eccesso. </li></ol></li><li> Posizionare il cervello nella matrice cervello su ghiaccio e make tagli coronali per ottenere 1 mm fette spesse. Trasferire le fettine cerebrali (1 mm) contenenti le regioni SCZ che si trovano nella parte posteriore del cervello ad un PBS freddo in un piatto di plastica Petri da 35 mm. Attenzione: Al fine di ottenere un piano parallelo di sezioni coronali, verificare che la fessura cervello è posizionato sulla linea mediana della matrice cerebrale; è fondamentale per evitare variazioni inutili sezioni. Nota: Ottenere fettine di cervello a 2-3 mm posteriormente al bregma; ciò consente la separazione del SCZ dalla SVZ. </li><li> Sotto il microscopio da dissezione con un basso ingrandimento, micro-sezionare il SCZ dalla zona sostanza bianca della corteccia e ippocampo con un piegato 6,9 30G ago. Quindi, rimuovere le regioni della corteccia sopra la SCZ. Posizionare la regione SCZ sezionato dalle fette in un piatto di plastica 35 millimetri di Petri sul ghiaccio senza PBS freddo. Nota: La contaminazione delle regioni in più contengono neuroni maturi potrebbe influenzare la vitalità delle aNSCs e neurosfere formazione Because essi subiscono la morte delle cellule in condizioni di coltura ANSC. </li><li> Utilizzando un piegato 30 ago G, tagliare immediatamente i tessuti sezionati in piccoli pezzi. Nota: Se è necessario un tempo più lungo per sezionare il tessuto SCZ, immergere i tessuti dissezionati in PBS freddo prima di tagliare. </li><li> Risospendere il tessuto tritato con 1 ml di tampone di digestione, trasferire il tessuto ad una provetta da 15 ml contenente 2 ml di tampone di digestione, e incubare per 30 min in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C. Nota: Agitare il tubo ogni 10 minuti per amalgamare bene. </li></ol> 3. Subcallosal Zone-derivato Cultura adulti cellule staminali neurali <ol><li> Toccare il tubo leggermente di dissociare il tessuto digerito, e poi centrifugare la provetta a 145 g per 5 min. Eliminare il surnatante, ri-sospeso il tessuto digerito con 1 ml di terreno di pre-riscaldato N2 per lavare il buffer di digestione, e pipettare delicatamente la soluzione del campione ad un massimo di 5 volte con una pipetta P1000. Nota: Over-triturazione con una strettapipetta punta può diminuire la vitalità delle cellule e la successiva crescita. </li><li> Centrifugare la provetta a 145 xg per 5 min. Dopo aver scartato il surnatante, risospendere il pellet cellulare in 1 ml di terreno N2. </li><li> Preparare 1 ml di terreno N2 in un piatto non rivestito da 6 pozzetti e aggiungere 1 ml di cellule sospese per fare un volume finale di 2 ml. </li><li> Aggiungere EGF (20 ng / ml) e bFGF (20 ng / ml) in ogni pozzetto. Agitare delicatamente il piatto cultura 6 pozzetti a mano per mescolare i fattori di crescita aggiunti con le cellule placcato. Mantenere il 6 pozzetti in un incubatore CO 2 37 ° C e 5%. </li><li> Aggiungere EGF (20 ng / ml) e bFGF (20 ng / ml) ad ogni pozzetto ogni giorno per 8 giorni. Ogni terzo giorno, aggiungere 200 ml di mezzi di N2 per mantenere la approssimata del volume 2 ml del mezzo. </li></ol> 4. Passaging di NSC come Neurosfere e colture monostrato <ol><li> Raccogliere le neurosfere e trasferirli in un nuovo tubo da 15 ml. Nota: Il numero di neurosfere (&gt; 50 micron di diametro) per bene dalla SCZ di un singolo cervello di topo era 64,3 ± 7,31, che era inferiore a quella della SVZ (190.5 ± 6,33) 9. </li><li> Incubare le neurosfere con 0,5 ml di tampone di dissociazione per 5 min in un bagno d&#39;acqua a 37 ° C per dissociare le neurosfere in singole cellule. neurosfere primarie possono essere dissociate in singole cellule e mantenuto per diversi passaggi come neurosfere o monostrato culture. Nota: Espansione SCZ-aNSCs come un monostrato è superiore a neurosfere perché SCZ-aNSCs possono essere diversi passaggi&gt; 10 volte in un formato cultura monostrato, ma &lt;5 volte in un formato cultura neurosfere. Attenzione: SCZ-aNSCs esporre forte aggregazione, ed è difficile per loro dissociarsi in singole cellule. Così, il formato la cultura neurosfere non è raccomandato per l&#39;espansione delle cellule di routine. </li><li> pipettare delicatamente la soluzione campione su e giù con una pipetta P1000 inferiore a 5 volte e centrifugare la provetta a 145 xg per 5 min. Eliminare il surnatante e ri-Sutrascorrere le neurosfere con 1 ml di terreno N2. Nota: Nel corso triturazione con una stretta punta della pipetta può diminuire la vitalità cellulare e la successiva crescita. </li><li> Per contare le cellule, fare una miscela 1: 1 di sospensione cellulare (10 microlitri) e il trypan blue soluzione 0,4%, e poi contare il numero di cellule vive in un hematocytometer. Dopo rivestimento di un 6-pozzetti con OLP / laminina, piastra le cellule a 2,5 x 10 5 cellule / ml con 2 ml di terreno N2 per ogni bene. Nota: Le variazioni di densità delle cellule possono influenzare la loro condizione e potenziale di differenziazione. </li><li> Mantenere le SCZ-aNSCs con un trattamento giornaliero di fattori di crescita (2 ml, 20 ng / ml) per 5 giorni, e il passaggio di loro. </li></ol> 5. La differenziazione di Subcallosal Zone-derivati ​​cellule staminali adulte neurali <ol><li> ANSCs piatto sulla un&#39;OLP / laminina rivestite coprioggetto 18 mm con filetto 1 x 10 5 cellule / ml in 1 ml N2 con fattori di crescita (20 ng / ml) per la differenziazione dei SCZ-aNSCs. </li><li> Il giorno successivo,quando le cellule sono saldamente attaccati al vetrino, scambiare il mezzo di crescita con N2 per rimuovere i fattori di crescita. </li><li> Dopo 6 giorni, lavare le cellule differenziate con 1 ml di PBS per rimuovere i detriti cellulari e fissarle per immunocolorazione. Nota: BrdU può essere incorporato nel DNA di nuova sintesi di cellule proliferanti. Pertanto, se desiderato, BrdU (10 ug / ml) può essere aggiunto a vivere cellule prima del fissaggio delle cellule. </li></ol> 6. cellule staminali neurali Immunocolorazione adulti e differenziata Progenitori <ol><li> Per immunostaining, lavare le cellule con PBS e fissarle con 4% PFA per 20 minuti a temperatura ambiente. Attenzione: PFA è altamente tossico; evitare il contatto con la pelle e gli occhi. </li><li> Rimuovere il 4% PFA, lavare le cellule fissate con PBS 3 volte, e poi conservarli a 4 ° Cuntil sono necessari per immunocolorazione. </li><li> Incubare le cellule sul vetrino con una soluzione bloccante (3% di albumina sierica bovina e 0,1% Triton X-100 in 1x PBS) per almeno 30 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Preparare gli anticorpi primari in soluzione di blocco fresco e incubare i campioni notte a 4 ° C. <ol><li> Immunocolorazione i aNSCs <ol><li> Macchiare le aNSCs utilizzando anti-Nestin e anticorpi anti-BrdU. Prima di fissazione, aggiungere 20 mg di BrdU alle aNSCs e incubare per 2 ore. Eseguire il passo denaturazione usando 2 N HCl per 20 min a 37 ° CBefore eseguire il passo di blocco. </li></ol></li><li> Immunocolorazione i progenitori differenziati: <ol><li> Usare gli anticorpi anti-proteina silicea fibrillare gliale (GFAP) anti-O4, anti-bIII-tubulina, e per etichettare i progenitori differenziati. </li></ol></li></ol></li><li> Lavare i campioni con PBS 3 volte e incubare con anticorpi secondari coniugati ai coloranti fluorescenti (1: 500) in soluzione bloccante per 30 minuti a temperatura ambiente. Poi, lavare i campioni 3 volte con PBS. Nota: utilizzare anticorpi secondari che corrispondono i padroni di casa del primarioanticorpi. Hoechest33343 (1: 2.000) è utilizzato per la colorazione nucleare. </li><li> Aggiungere la soluzione di montaggio di un vetrino e procedere con il montaggio. Osservare e immagine campione su un microscopio confocale a più lunghezze d&#39;onda: FITC (488 nm), Cy3 (543 nm), Cy5 (647 nm), e Hoechest33343 (405 nm). </li></ol>

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Gli autori dichiarano di non avere conflitti di interesse.

Questo documento descrive un protocollo dettagliato per generare NSCs dal SCZ topo adulto e mantenerli per varie applicazioni. Ci sono tre passi fondamentali per determinare lo vitro sistema di cultura necessaria per purificare ed espandere SCZ-NSC. In primo luogo, è importante assicurare che la regione SCZ è proprio sezionato da altri potenziali regioni neurogena (Figura 1B). Sezioni spesse e precisi contenenti le regioni SCZ sono stati ottenuti con una matrice cerebrale intervallo di...

NSC hanno caratteristiche di auto-rinnovamento e differenziazione di più lignaggi. Per confermare queste proprietà, è stato ampiamente utilizzato un sistema di coltura della neurosfera. Il sistema di coltura della neurosfera è stato sviluppato nei primi anni '90 ed è servito come sistema di coltura di cellule staminali standard1. A seconda della potenza di auto-rinnovamento, le NSC proliferano continuamente e generano una massa cellulare in una coltura in sospensione. Si ritiene che il numero di cellule e le dimensioni della neurosfera siano strettamente associati alle proprietà di proliferazione delle NSC. Le colture monostrato sono anche ampiamente utilizzate per il mantenimento e la differenziazione delle NSC. Rispetto alla coltura della neurosfera, il sistema di coltura monostrato fornisce un migliore mantenimento omogeneo e l'espansione delle NSC2. Questi due sistemi colturali ben sviluppati hanno contribuito alla caratterizzazione delle aNSC in vitro. 
Le NSC risiedono in diverse regioni del cervello, come la zona subventricolare (SVZ) del ventricolo laterale e la zona subgranulare (SGZ) dell'ippocampo3-5. La zona sottocallosa (SCZ) della sostanza bianca sottocorticale caudale è riconosciuta come una nuova regione neurogena6-8. È stato recentemente riportato che le SCZ-aNSC hanno un potenziale terapeutico nella lesione cerebrale traumatica9. Rispetto ad altre regioni neurogene, l'SCZ risiede lungo la sostanza bianca sottocorticale. Nel cervello umano, la sostanza bianca sottocorticale occupa una regione più ampia rispetto al cervello del topo10. Pertanto, la comprensione delle caratteristiche delle SCZ-aNSC utilizzando un sistema di coltura in vitro è importante per promuovere il potenziale utilizzo di queste cellule per la rigenerazione neurale. È necessaria una dissezione precisa della regione cerebrale desiderata per escludere la possibile contaminazione da parte di regioni indesiderate contenenti NSC attive o quiescenti. Ad esempio, le aNSC nelle regioni non neurogene possono essere attivate e produrre nuove cellule neurali in cervelli danneggiati o durante la coltura in vitro 11. Per ottenere le NSC dalla SCZ, le cellule sono state raccolte da fette di cervello contenenti la SCZ. Quindi, è stata eseguita un'attenta micro-dissezione della regione SCZ utilizzando un ago sottile. Per generare la neurosfera dall'SCZ, pezzi di tessuto SCZ micro-sezionati sono stati dissociati in singole cellule e poi coltivati come sospensione in presenza del fattore di crescita epidermico (EGF) e del fattore di crescita basico dei fibroblasti (bFGF). Dopo che le SCZ-aNSC hanno formato le neurosfere, possono anche essere mantenute come neurosfere o monostrati per l'espansione. Questa procedura dimostra anche processi di immunocolorazione con vari marcatori per la rilevazione delle NSC e della loro progenie dopo la loro espansione e differenziazione in una coltura monostrato. Qui viene presentato un protocollo visivo del sistema di coltura SCZ-aNSC. Questo protocollo contiene istruzioni dettagliate per la micro-dissezione della regione SCZ e per il mantenimento e il passaggio delle cellule.

<table><tbody><tr><td><forte>Componenti medi</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12&nbsp;</td><td>Gibco</td><td>11320-033+</td><td>L-glutammina, +Bicarbonato di sodio</td></tr><tr><td>Pen/Strep</td><td>Invitrogen</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Integratore N2</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td></td></tr><tr><td>Integratore B27</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td></td></tr><tr><td>Fattore di crescita</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D</td><td>233-FB</td><td></td></tr><tr><td>EGF</td><td>Gibco</td><td>PHG0313</td><td></td></tr><tr><td>Buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS (10x)</td><td>BIOSOLUTION</td><td>BP007a</td><td>1x diluizione</td></tr><tr><td>HBSS</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Dissociattion buffer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dispase II</td><td>Roche</td><td>04-942-078-001</td><td></td></tr><tr><td>Papain</td><td>Worthington</td><td>3126</td><td></td></tr><tr><td>Accutase</td><td>ICT</td><td>AT-104</td><td></td></tr><tr><td>Tool</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Fine pincipe</td><td>WPI</td><td>555229F</td><td></td></tr><tr><td>Forbici</td><td>Storz</td><td>E3321-C</td><td></td></tr><tr><td>Matrice cerebrale (1 mm)</td><td>RWD</td><td>68707</td><td></td></tr><tr><td>Rasoio a doppio taglio</td><td>DORCO</td><td>ST-300</td><td></td></tr><tr><td>Ago da 30 G</td><td>SUNGSHIM</td><td>N1300</td><td></td></tr><tr><td>Materiali</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tubi da 15 ml</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>Tubi da 50 ml</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Piastra da 35 mm</td><td>SPL</td><td>10035</td><td>Piastra Petri</td></tr><tr><td>Piastra da 100 mm</td><td>SPL</td><td>10090</td><td>Piastra di Petri</td></tr><tr><td>Vetrino di copertura (18 mm)</td><td>Deckglaser</td><td>111580</td><td></td></tr><tr><td>Piastra a 12 pozzetti</td><td>SPL</td><td>32012</td><td>non rivestimento</td></tr><tr><td>Piastra a 6 pozzetti</td><td>SPL</td><td>32006</td><td>non</td></tr> <tr><td>< rivestimentoforte>Materiali di rivestimento</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PLO</td><td>Sigma</td><td>P4957</td><td>0,01%</td></tr><tr><td>Laminin</td><td>Gibco</td><td>23017-015</td><td>10 mg/ml</td></tr><tr><td><forte>Anticorpi primari&nbsp; </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nestin</td><td>Millipore</td><td>MAB353</td><td>topo (1:1.000)</td></tr><tr><td>EGFR</td><td>Abcam</td><td>ab2430</td><td>coniglio (1:1.000)</td></tr><tr><td>DCX</td><td>Santa Cruz</td><td>SC8066</td><td>capra (1:500)</td></tr><tr><td>Tuj1</td><td>Sigma</td><td>T2200</td><td>coniglio (1:2.000)</td></tr><tr><td>GFAP</td><td>Invitrogen</td><td>13-0300</td><td>ratto (1:1.000)</td></tr><tr><td>O4</td><td>Millipore</td><td>MAB345</td><td>mouse (1:500)</td></tr><tr><td>BrdU</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>Rat (1:500)</td></tr><tr><td>Secondary antibodies</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21202</td><td>1:500</td></tr><tr><td>anti-mouse cy3</td><td>Jackson</td><td>715-165-151</td><td></td></tr><tr><td>anti-mouse 647</td><td>Jackson</td><td>715-606-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-coniglio 488</td><td>Alexa</td><td>A21206</td><td></td></tr><tr><td>anti-coniglio cy3</td><td>Jackson</td><td>711-165-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-coniglio 647</td><td>Jackson</td><td>711-605-152</td><td></td></tr><tr><td>anti-capra 488</td><td>Alexa</td><td>A11055</td><td></td></tr><tr><td>anti-capra cy3</td><td>Jackson</td><td>705-165-147</td><td></td></tr><tr><td>anti-capra 647</td><td>Invitrogen</td><td>A21447</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto 488</td><td>Invitrogen</td><td>A21208</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto cy3</td><td>Jackson</td><td>712-166-150</td><td></td></tr><tr><td>anti-ratto 647</td><td>Jackson</td><td>712-605-153</td><td></td></tr><tr><td>Materiali immunocoloranti</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Millipore</td><td>82-100-6</td><td>3% BSA con 0,1% Triton X-100 in PBS</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>usb</td><td>22686</td><td></td></tr><tr><td>4% PFA</td><td>Biosesang</td><td>P2031</td><td></td></tr><tr><td>Hoechest33342</td><td>Life Technology</td><td>H3570</td><td>Colorante per la colorazione dei nuclei</td></tr></tbody></table>

isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal subcallosal zona mouse

Isolation and Culture of Adult Neural Stem Cells from the Mouse Subcallosal Zone

Le cellule staminali neurali adulte (aNSC) possono essere utilizzate per la rigenerazione del tessuto cerebrale danneggiato. Le NSC hanno il potenziale per la differenziazione e la proliferazione in tre tipi di cellule: neuroni, astrociti e oligodendrociti. L'identificazione delle regioni derivate da aNSC e la caratterizzazione delle proprietà delle aNSC sono fondamentali per il potenziale utilizzo delle aNSC e per chiarire il loro ruolo nella rigenerazione neurale. Recentemente è stato riportato che la zona sottocallosa (SCZ), situata tra la sostanza bianca e l'ippocampo, contiene aNSC e dà continuamente origine a neuroblasti. Una bassa percentuale di aNSCs provenienti dalla SCZ si differenzia in neuroni; La maggior parte delle cellule sono differenziate in cellule gliali, come gli oligodendrociti e gli astrociti. Si suggerisce che queste cellule abbiano un potenziale terapeutico per la lesione corticale traumatica. Questo protocollo descrive in dettaglio il processo per generare SCZ-aNSC da un cervello di topo adulto. Una matrice cerebrale con intervalli di 1 mm viene utilizzata per ottenere le fette coronali contenenti SCZ e per sezionare con precisione la SCZ dall'intero cervello. Le sezioni SCZ sono inizialmente sottoposte a una coltura della neurosfera. Un sistema di coltura ben sviluppato consente la verifica delle loro caratteristiche e può aumentare la ricerca sulle NSC. Un sistema di coltura della neurosfera fornisce uno strumento utile per determinare la proliferazione e raccogliere le NSC autentiche. Una coltura monostrato è anche un sistema in vitro per saggiare la proliferazione e la differenziazione. Significativamente, questo sistema di coltura fornisce un ambiente più omogeneo per le NSC rispetto al sistema di coltura della neurosfera. Pertanto, utilizzando una regione discreta del cervello, questi sistemi di coltura saranno utili per ampliare le nostre conoscenze sulle aNSC e le loro applicazioni per usi terapeutici.

Definizione del sistema di coltura per aNSCs dalla regione neurogena ignoto è essenziale per la comprensione di queste cellule e di sviluppare il loro potenziale utilizzo nella riparazione del cervello 12. È noto che le NSC a diversi stadi di sviluppo o in regioni diverse si comportano in modo diverso 3,4. Recentemente, è stato riportato che le cellule SCZ derivate presentano potenziali differenziali di differenziazione neuronale in vivo e in vitro...

Stabilire sistemi di coltura per l'espansione delle cellule staminali neurali adulte (aNSC) consente l'esame e l'applicazione di aNSC per la terapia. La zona sottocallosa (SCZ) è stata recentemente riconosciuta come una nuova regione che forma neuroblasti nei topi adulti. Qui vengono descritti i metodi per l'isolamento, l'espansione e la differenziazione delle SCZ-aNSC.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

Adult neural stem cells (aNSCs) can be used for the regeneration of damaged brain tissue. NSCs have the potential for differentiation and proliferation ...

L'obiettivo generale di questo sistema di coltura cellulare neurale adulta è isolare cellule staminali neurali adulte dalla zona subcallosale ed espandere le cellule in sistemi di coltura non aderenti e aderenti. Questo approccio può contribuire a rispondere a domande fondamentali nel campo delle cellule staminali neurali adulte, come l'isolamento e la coltivazione di cellule staminali neurali da piccole lesioni cerebrali quali la zona subcallosale. Il principale vantaggio di questa tecnica è l'isolamento di cellule staminali neurali adulte dalla zona subcallosale.È semplice, ma preciso. Per iniziare questa procedura, sterilizzare in autoclave la matrice cerebrale, una lama di rasoio a doppio taglio e le pinzette. Successivamente, preparare 50 millilitri di PBS freddo per lavare il cervello del topo.Quindi, impostare un microscopio per dissezione e preparare gli strumenti chirurgici necessari per la dissezione del cervello e l'isolamento della ZCS. Preparare il mezzo F-12 DMEM con integratori B-27 al 2%, N-2 all'1% e penicillina-streptomicina all'1%. Successivamente, preparare il buffer di digestione per la digestione del tessuto.In seguito, preparare poli-L-ornitina allo 0,01% e l

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Questo video descrive il metodo utilizzato per l'isolamento di neuroprecursors dalla corteccia sviluppo embrionale dei topi. Il procedimento per eliminare gli embrioni dall'utero, sezionare il tessuto corticale, e digerire la corteccia cerebrale isolato viene mostrato.

Cultura di cellule precursori staminali neurali del mouse

Questo protocollo video viene illustrato il metodo di analisi per generare neurosfere ed espandere le cellule staminali neurali adulte provenienti dalla regione periventricolare del mouse, e fornisce approfondimenti tecnici per garantire la si può raggiungere culture neurosfere riproducibile.

Isolamento ed espansione della cellule staminali neurali del mouse utilizzando il saggio neurosfere

Questo protocollo video mostra l'applicazione del test neurosfere per l'isolamento e l'espansione delle cellule staminali neurali da eminenze gangliari del giorno embrionale 14-topo cervello.

Stabilire embrionali di topo Neural Stem Cell Culture del saggio di neurosfere

Il video mostra il processo di isolamento e coltura delle cellule staminali neurali dalla zona sottocallosa del cervello del topo. Comporta la dissezione dei tessuti, la dissociazione enzimatica e la loro coltura con fattori di differenziazione per svilupparsi in cellule neurali mature.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali adulte dalla zona sottocallosa del topo

Questo video mostra un protocollo dettagliato per isolare le pareti del ventricolo laterale dal cervello del topo adulto ed eseguire la dissociazione enzimatica del tessuto per ottenere singole cellule. Queste cellule sono poi sottoposte a specifiche condizioni di coltura che aumentano selettivamente la proliferazione delle cellule staminali neurali e ne promuovono la differenziazione in co-colture di oligodendrociti e astrociti.

Ottenimento di una coltura mista di oligodendrociti e astrociti da cellule staminali neurali di topo adulto

Questo video mostra un metodo per isolare le cellule staminali dal cervelletto del topo postnatale e differenziarle in cellule neurali. Le cellule staminali della sospensione cellulare isolata vengono purificate utilizzando perle magnetiche rivestite di anticorpi e vengono coltivate per formare neurosfere. Le neurosfere vengono quindi mantenute in un mezzo di differenziazione per generare cellule neurali.

Isolamento di cellule staminali dal cervelletto di topo postnatale e differenziazione in cellule neurali

Cellule staminali neurali raccolte dal cervello adulto sono in aumento utilizzati in applicazioni che vanno dalla ricerca di base dello sviluppo del sistema nervoso ad esplorare potenziali applicazioni cliniche in medicina rigenerativa. Questo rende rigoroso controllo delle condizioni di isolamento e di coltura utilizzate per coltivare queste cellule fondamentali per suonare i risultati sperimentali.

Crescere cellule staminali neurali da Regioni convenzionali e non convenzionali del cervello adulto Roditore

Qui si descrive un protocollo dettagliato per la generazione simultanea di colture di cellule precursore neuronali, sia come monostrati aderenti o neurosfere, dalla zona subventricolare e giro dentato di singoli topi adulti.

Un mouse, due culture: isolamento e la coltura di Adult Neural Stem Cells dalle due zone neurogena Mice individuale

Riportiamo un metodo basato sul Fluorescent Activated Cell Sorting (FACS) per isolare le cellule staminali neurali (NSC) e la loro progenie dalla zona subventricolare (SVZ) del cervello del topo adulto. Applicato a topi transgenici FUCCI (Fluorescence Ubiquitination Cell Cycle Indicator), consente lo studio della progressione del ciclo cellulare mediante imaging dal vivo.

Ordinamento delle cellule staminali neurali e di cellule progenitrici del topo adulto subventricolare Zone e Live-imaging loro dinamiche del ciclo cellulare

Qui, presentiamo una nuova tecnica microsurgical per l'isolamento delle cellule staminali neurali dall'eminenza E13 del mouse embrione gangliare.

Isolamento e coltura di cellule staminali neurali embrionali del Mouse

Qui, descriviamo un sistema di nucleofecazione progettato per migliorare l'efficienza del rilascio genico in cellule staminali neurali espanse (NSC) isolate dalla zona subventricolare murina adulta. I risultati dimostrano che questo metodo migliora significativamente la perturbazione genica nelle NSC, superando l'efficacia dei protocolli di trasfezione tradizionali e migliorando il tasso di sopravvivenza cellulare.

Isolamento, espansione e nucleofezione di cellule staminali neurali dalla zona subventricolare murina adulta

Scopri l'isolamento e la coltura di cellule staminali neurali adulte dalla zona subcallosa del topo. Questo metodo permette di espandere le cellule in sistemi di coltura non aderenti e aderenti per studiare la neurogenesi adulta.

Isolamento e la coltura di adulti neurali cellule staminali dal Subcallosal Zona mouse

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