Name: Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-02-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Scopri la differenziazione condrogenica di cellule staminali derivate dal tessuto adiposo usando la forza di gravità centrifuga. Questo metodo senza citochine promuove l'espressione di SOX9 per la riparazione della cartilagine.

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Questa ricerca è stata supportata da una sovvenzione del Korea Health Technology R&D Project attraverso il Korea Health Industry Development Institute (KHIDI), finanziato dal Ministero della Salute e del Welfare, Repubblica di Corea (numero di sovvenzione: HI14C2116) e dal Fondo di Ricerca del Seoul St. Mary's Hospital, l'Università Cattolica della Corea.

Questo protocollo di studio è stato approvato dal Comitato Etico dell&#39;Università Cattolica di Corea (KC16EAME0162) ed eseguito secondo le direttive NIH. Tutti i tessuti sono stati ottenuti con il consenso informato scritto. 1. centrifuga carico gravitazionale e la cultura Pellet <ol><li> coltura cellulare e la raccolta <ol><li> ASC Culture (P2-P3, vedere elenco dei materiali) in Modified medio-basso livello di glucosio Eagle Dulbecco (DMEM-LG) supplementato con siero 10% fetale bovino (FBS) e 1% di penicillina / streptomicina (P / S) a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2. </li><li> Quando le cellule raggiungono 80% di confluenza, scartare il mezzo e lavare le cellule con 5 ml di 1x tampone fosfato salino (PBS). </li><li> Aggiungere 1 ml di PBS contenente 1 mM EDTA e incubare per 2 minuti a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2. </li><li> Toccare la piastra di coltura delicatamente, aggiungere 4 ml di terreno fresco, trasferire le cellule aun tubo da 15 ml conica e centrifugare le cellule a 250 xg per 2 minuti a temperatura ambiente (RT). </li></ol></li><li> carico gravitazionale centrifuga <ol><li> Dopo la centrifugazione (fase 1.1.4), rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet e risospendere il pellet in 10 ml di DMEM-LG con il 10% FBS. Contare le cellule utilizzando un emocitometro. </li><li> Per CG caricamento, trasferire 2,5 × 10 5 cellule in una nuova provetta conica da 15 ml e centrifugare a 2400 g per 15 min. </li></ol></li><li> cultura pellet <ol><li> Subito dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e aggiungere 500 ml di mezzo di differenziazione condrogenico definito (CDM, DMEM ad alto glucosio integrato con 1% FBS, 1% ITS + Premix, 100 nM desametasone, soluzione di aminoacidi 1x MEM non essenziali, 50 mcg / mL L-prolina, e l&#39;1% di penicillina / streptomicina). Aggiungere 50 mg / mL di preparati di acido L-ascorbico 2-fosfato ad ogni cambio medio. Come controllo positivo, indurre differentiati condrogenichesu cellule non centrifugati con l&#39;aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1. </li><li> Posizionare i tubi liberamente innevate contenenti il pellet in una posizione in piedi e incubare a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente il 5% di CO 2. </li><li> Modificare il medium a giorni alterni per 3 settimane. </li></ol></li><li> cultura Micromass <ol><li> Immediatamente dopo la centrifugazione (fase 1.2.2; 2.400 × g per 15 min), aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 ml di CDM. </li><li> Per formare un Micromass, posizionare le cellule risospese nel centro di un pozzetto di una piastra da 24 pozzetti. </li><li> Dopo 2 h, aggiungere con attenzione 1 mL di CDM al pozzo, pipettaggio contro la parete della piastra di non perturbare il Micromass. Come controllo positivo, eseguire una cultura Micromass con le cellule non centrifugati con l&#39;aggiunta di CDM contenente 10 ng / mL TGF-β1. </li><li> Incubare la Micromass a 37 ° C in un incubatore umidificato contenente 5% di CO 2. </li><li> Modificare l&#39;ev medioery altro giorno per 3 settimane. </li></ol></li></ol> 2. trascrittasi inversa-Polymerase Chain Reaction (RT-PCR) per rilevare trascrizionale upregulation di condrogenico differenziazione marcatori <ol><li> Il giorno 14, utilizzare una pipetta per trasferire i pellets sferoidali in una nuova provetta da 1,5 ml e lavarli in PBS 1x. </li><li> Estrarre l&#39;RNA totale da pellet che utilizzano il guanidinio tiocianato-fenolo-cloroformio metodo di estrazione 9. </li><li> Sintetizzare cDNA da 2 mg di RNA totale mediante trascrittasi inversa secondo il protocollo del produttore (incubare a 42 ° C per 1 ora e quindi inattivare l&#39;enzima a 70 ° C per 5 min). </li><li> Eseguire la PCR con primer specifici per i marcatori di differenziazione condrogeniche 10. </li></ol> 3. La colorazione per rilevare la sovraespressione di condrogenico differenziazione Marker Proteine <ol><li> pellet cellulari paraffina-embedding <ol><li> Il giorno 21,utilizzare una pipetta per raccogliere le palline sferoide e lavarli con PBS 1x. </li><li> Fissare il pellet sferoidali per immersione in paraformaldeide al 4% per 24 ore. Attenzione: Paraformaldeide è altamente tossico. Evitare il contatto con gli occhi, la pelle o le mucose. Ridurre al minimo l&#39;esposizione e evitare l&#39;inalazione durante la preparazione. Indossare dispositivi di protezione adeguati. </li><li> Eliminare il fissativo e lavare il pellet di cellule con acqua deionizzata (DW). </li><li> Mettere uno strato di garza sulla cassetta e trasferire i pellet fisse con una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudere il coperchio della cassetta. </li><li> Disidratare il pellet. <ol><li> Immergere il pellet in 70% di etanolo (EtOH) per 5 minuti a temperatura ambiente. </li><li> Immergere il pellet in 80% EtOH per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere il pellet in 95% EtOH per 5 minuti a RT. </li><li> Immergere i pellets in 100% EtOH per 5 minuti a RT. Ripetere due volte. </li><li> Immergere i pellets in 100% xilene per 15 minuti a RT. Ripetere twiCE. </li></ol></li><li> Incorporare i pellet cellulari fissati in paraffina a 56 ° C in uno stampo; il pellet possono essere incorporati in paraffina utilizzando sistemi di lavorazione dei tessuti specializzati automatizzati. </li><li> Tagliare 5 sezioni micron di spessore dal pellet cellulare in paraffina utilizzando un microtomo rotativo. </li><li> Float sezioni nel 50% EtOH e poi trasferirli in un bagno d&#39;acqua a 50 ° C utilizzando una diapositiva. </li><li> Posizionare le sezioni galleggianti su vetrini. </li></ol></li><li> Safranina O e Alcian colorazione blu <ol><li> Reidratare il sezioni di paraffina. <ol><li> Immergere i vetrini in xilene per 15 min. Ripetere due volte. </li><li> Immergere i vetrini in 100% EtOH per 5 min. Ripetere due volte. </li><li> Immergere i vetrini in 90% EtOH per 5 min. </li><li> Immergere i vetrini in 80% EtOH per 5 min. </li><li> Immergere i vetrini in 70% EtOH per 5 minuti, e poi lavare in PBS 1x. </li></ol></li><li> Macchiare le sezioni reidratati con soluzione di safranina O 1% e il 3% blu Alcian per30 minuti. </li><li> Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW. </li><li> Macchiare le sezioni con soluzione ematossilina / eosina (di contrasto) per 1 min. </li><li> Eliminare la soluzione colorante e lavare le sezioni con DW. </li><li> Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l&#39;acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul vetrino che contiene il mezzo di montaggio. </li><li> Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3 ore a temperatura ambiente. </li><li> Acquisire immagini utilizzando un microscopio in campo chiaro (microscopio verticale automatizzato, 50X e 200X). </li></ol></li><li> test di immunofluorescenza <ol><li> Reidratare sezioni come descritto nella sezione 3.2.1. </li><li> Immergere i vetrini in tampone citrato di sodio (10 mM sodio citrato, 0,05% Tween 20, pH 6,0), e quindi di mantenere ad una temperatura sub-bollente per 10 minuti usando un forno a microonde. </li><li> Raffreddare i vetrini per 20 minuti a temperatura ambiente e poi lavarle con acqua del rubinetto. </li><li> Incubare i vetrini a 3%H 2 O 2 (in 1x PBS) per 15 minuti, e poi lavare con acqua corrente per 15 minuti 11. </li><li> Bloccare i vetrini con tampone di bloccaggio (10% di siero normale di capra in PBS) per 1 ora. </li><li> Aspirare la soluzione di saturazione, e quindi applicare un anticorpo primario diluito con 5% di siero normale di capra sulle diapositive. </li><li> Incubare i vetrini notte a 4 ° C. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna. </li><li> Incubare i vetrini in anticorpo secondario coniugato a un fluorocromo diluito con 5% di siero normale di capra per 1 ora a temperatura ambiente al buio. </li><li> Lavare i vetrini tre volte in PBS 1x per 5 minuti ciascuna al buio. </li><li> Incubare i vetrini con DAPI (1 mg / ml) per 10 minuti, e poi lavarli due volte in 1x PBS per 5 minuti ciascuna. </li><li> Mettere una goccia di mezzo di montaggio sul vetrino dopo aver rimosso l&#39;acqua residua. posizionare con cura il vetrino (cellule rivolto verso il basso) sul supporto di montaggio. </li><li> Lasciare i vetrini si asciughino per 2-3h al buio a temperatura ambiente. </li><li> Visualizza le diapositive utilizzando microscopia a fluorescenza (Rhod: 594 nm, DAPI: 340 nm; 60X e 200X ingrandimento) 12. </li></ol></li></ol>

<ol><li>Awad, H. A., Halvorsen, Y. D., Gimble, J. M., Guilak, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+transforming+growth+factor+beta1+and+dexamethasone+on+the+growth+and+chondrogenic+differentiation+of+adipose-derived+stromal+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng%22%5BJournal%5D)">Effects of transforming growth factor beta1 and dexamethasone on the growth and chondrogenic differentiation of adipose-derived stromal cells.</a> Tissue Eng. 9 (6), 1301-1312 (2003).</li>
<li>Erickson, G. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+potential+of+adipose+tissue-derived+stromal+cells+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Biophys+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic potential of adipose tissue-derived stromal cells in vitro and in vivo.</a> Biochem Biophys Res Commun. 290 (2), 763-769 (2002).</li>
<li>Sah, R. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biosynthetic+response+of+cartilage+explants+to+dynamic+compression%5BTitle%5D)+AND+%22J+Orthop+Res%22%5BJournal%5D)">Biosynthetic response of cartilage explants to dynamic compression.</a> J Orthop Res. 7 (5), 619-636 (1989).</li>
<li>Sakao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Induction+of+chondrogenic+phenotype+in+synovium-derived+progenitor+cells+by+intermittent+hydrostatic+pressure%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Induction of chondrogenic phenotype in synovium-derived progenitor cells by intermittent hydrostatic pressure.</a> Osteoarthritis Cartilage. 16 (7), 805-814 (2008).</li>
<li>Li, Z., Yao, S. J., Alini, M., Stoddart, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenesis+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+fibrin-polyurethane+composites+is+modulated+by+frequency+and+amplitude+of+dynamic+compression+and+shear+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Tissue+Eng+Part+A%22%5BJournal%5D)">Chondrogenesis of human bone marrow mesenchymal stem cells in fibrin-polyurethane composites is modulated by frequency and amplitude of dynamic compression and shear stress.</a> Tissue Eng Part A. 16 (2), 575-584 (2010).</li>
<li>Alves da Silva, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chondrogenic+differentiation+of+human+bone+marrow+mesenchymal+stem+cells+in+chitosan-based+scaffolds+using+a+flow-perfusion+bioreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Tissue+Eng+Regen+Med%22%5BJournal%5D)">Chondrogenic differentiation of human bone marrow mesenchymal stem cells in chitosan-based scaffolds using a flow-perfusion bioreactor.</a> J Tissue Eng Regen Med. 5 (9), 722-732 (2011).</li>
<li>Maeda, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Changes+in+microstructure+and+gene+expression+of+articular+chondrocytes+cultured+in+a+tube+under+mechanical+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Osteoarthritis+Cartilage%22%5BJournal%5D)">Changes in microstructure and gene expression of articular chondrocytes cultured in a tube under mechanical stress.</a> Osteoarthritis Cartilage. 13 (2), 154-161 (2005).</li>
<li>Yang, J., Hooper, W. C., Phillips, D. J., Tondella, M. L., Talkington, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Centrifugation+of+human+lung+epithelial+carcinoma+a549+cells+up-regulates+interleukin-1beta+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Diagn+Lab+Immunol%22%5BJournal%5D)">Centrifugation of human lung epithelial carcinoma a549 cells up-regulates interleukin-1beta gene expression.</a> Clin Diagn Lab Immunol. 9 (5), 1142-1143 (2002).</li>
<li>Rio, D. C., Ares, M., Hannon, G. J., Nilsen, T. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Purification+of+RNA+using+TRIzol+%28TRI+reagent%29%5BTitle%5D)+AND+%22Cold+Spring+Harb+Protoc%22%5BJournal%5D)">Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent).</a> Cold Spring Harb Protoc. (6), (2010).</li>
<li>Lorenz, T. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Polymerase+chain+reaction%3A+basic+protocol+plus+troubleshooting+and+optimization+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Polymerase chain reaction: basic protocol plus troubleshooting and optimization strategies.</a> J Vis Exp. (63), e3998(2012).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((UVB+induces+HIF-1alpha-dependent+TSLP+expression+via+the+JNK+and+ERK+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">UVB induces HIF-1alpha-dependent TSLP expression via the JNK and ERK pathways.</a> J Invest Dermatol. 133 (11), 2601-2608 (2013).</li>
<li>Wu, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunodetection+of+human+telomerase+reverse-transcriptase+%28hTERT%29+re-appraised%3A+nucleolin+and+telomerase+cross+paths%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Immunodetection of human telomerase reverse-transcriptase (hTERT) re-appraised: nucleolin and telomerase cross paths.</a> J Cell Sci. 119, Pt 13 2797-2806 (2006).</li>
<li>Bobick, B. E., Chen, F. H., Le, A. M., Tuan, R. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+chondrogenic+phenotype+in+culture%5BTitle%5D)+AND+%22Birth+Defects+Res+C+Embryo+Today%22%5BJournal%5D)">Regulation of the chondrogenic phenotype in culture.</a> Birth Defects Res C Embryo Today. 87 (4), 351-371 (2009).</li>
<li>Akiyama, H., Chaboissier, M. C., Martin, J. F., Schedl, A., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+transcription+factor+Sox9+has+essential+roles+in+successive+steps+of+the+chondrocyte+differentiation+pathway+and+is+required+for+expression+of+Sox5+and+Sox6%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">The transcription factor Sox9 has essential roles in successive steps of the chondrocyte differentiation pathway and is required for expression of Sox5 and Sox6.</a> Genes Dev. 16 (21), 2813-2828 (2002).</li>
<li>Lefebvre, V., Huang, W., Harley, V. R., Goodfellow, P. N., de Crombrugghe, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SOX9+is+a+potent+activator+of+the+chondrocyte-specific+enhancer+of+the+pro+alpha1%28II%29+collagen+gene%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">SOX9 is a potent activator of the chondrocyte-specific enhancer of the pro alpha1(II) collagen gene.</a> Mol Cell Biol. 17 (4), 2336-2346 (1997).</li>
<li>Jang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+adipose+tissue-derived+stromal+vascular+fraction+for+clinical+application+to+cartilage+regeneration%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol+Anim%22%5BJournal%5D)">Characterization of adipose tissue-derived stromal vascular fraction for clinical application to cartilage regeneration.</a> In Vitro Cell Dev Biol Anim. 51 (2), 142-150 (2015).</li>
<li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+regeneration+of+articular+cartilage+and+subchondral+bone+in+vivo+using+MSCs+induced+by+a+spatially+controlled+gene+delivery+system+in+bilayered+integrated+scaffolds%5BTitle%5D)+AND+%22Biomaterials%22%5BJournal%5D)">Simultaneous regeneration of articular cartilage and subchondral bone in vivo using MSCs induced by a spatially controlled gene delivery system in bilayered integrated scaffolds.</a> Biomaterials. 32 (21), 4793-4805 (2011).</li>
<li>Janzen, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem-cell+ageing+modified+by+the+cyclin-dependent+kinase+inhibitor+p16INK4a%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Stem-cell ageing modified by the cyclin-dependent kinase inhibitor p16INK4a.</a> Nature. 443 (7110), 421-426 (2006).</li>
<li>Muraglia, A., Cancedda, R., Quarto, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Clonal+mesenchymal+progenitors+from+human+bone+marrow+differentiate+in+vitro+according+to+a+hierarchical+model%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Clonal mesenchymal progenitors from human bone marrow differentiate in vitro according to a hierarchical model.</a> J Cell Sci. 113, Pt 7 1161-1166 (2000).</li>
</ol>

Dichiariamo di non avere conflitti di interesse associati a questo lavoro.

Lo stato stemness delle cellule è molto importante per la sovraespressione CG-indotta SOX9. Nel nostro studio, espressione SOX9 potrebbe essere indotta da CG ASC precoce passaggio (2-3), ma non in ASC dopo-passaggio. E &#39;stato riportato che, durante la coltivazione, ASC contengono cellule CD34 + fino a 3 passaggi 16. ASC tendono a perdere l&#39;espressione di CD34 come le cellule sono diversi passaggi, con conseguente bassa risposta al CG. Con forza di gravità cent...

Difetti di cartilagine articolare non guariscono naturalmente. Di conseguenza, trapianto di cellule staminali è stata proposta come un approccio promettente per la riparazione della cartilagine compromessa. Tuttavia, questo metodo richiede sia l&#39;acquisizione di un numero sufficiente di cellule staminali e l&#39;induzione di queste cellule a subire differenziazione condrogenico. Il midollo osseo (BM) è stato ampiamente utilizzato come fonte di cellule staminali, ma l&#39;isolamento delle cellule da BM ha due principali svantaggi: invasività e di rendimento insufficiente. A causa della sua facilità di acquisizione, tessuto adiposo è fonte preferibile di cellule staminali. Studi precedenti hanno dimostrato la fattibilità di isolare cellule staminali dal tessuto adiposo e indurre la differenziazione condrogenica in queste cellule con citochine, come TGF-β1 1, 2. Questi metodi sono efficaci ma costosi. Come un più basso costo alle citochine, stress meccanico può essere utilizzato perindurre la differenziazione condrogenico. Carico meccanico gioca un ruolo fondamentale nel mantenimento della salute della cartilagine articolare 3, e può indurre fenotipi condrogeniche in varie cellule. Ad esempio, la pressione idrostatica induce fenotipi condrogeniche in cellule progenitrici derivate dal sinovio attraverso la via MAP chinasi / JNK 4, e la compressione meccanica induce condrogenesi nelle cellule staminali mesenchimali umane (MSC) per upregulating geni chondrocytic 5. Inoltre, shear stress contribuisce alla espressione della matrice extracellulare chondrogenesis legati (ECM) di MSC umani 6. Gravità centrifugo (CG), uno stress meccanico facilmente applicata e controllata generato per centrifugazione, può indurre l&#39;espressione genica differenziale in cellule 7. Ad esempio, nelle cellule di carcinoma epiteliale polmonare, l&#39;espressione di interleuchina (IL) -1 ter è upregulated per centrifugazione 8. Therefore, come sollecitazioni meccaniche sperimentalmente inducibile, CG può essere utilizzato per indurre l&#39;espressione genica in cellule staminali chondrocytic. Tuttavia, non è chiaro se CG può indurre la differenziazione delle cellule staminali condrogenica. In questo studio, abbiamo scoperto che CG ha indotto la upregulation di SOX9, un regolatore maestro di condrogenesi, in ASC umani, causando la sovraespressione di geni chondrocytic. Inoltre, abbiamo confrontato gli effetti di CG su chondrogenesis con quelli di TGF-β1, il fattore di crescita più comunemente utilizzati per indurre in vitro condrogenesi nelle cellule staminali.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Plasticware</td></tr><tr><td>100 mm Piatto</td><td>TPP</td><td>93100</td><td></td></tr><tr><td>Piatto da 60 mm</td><td>TPP</td><td>93060</td><td></td></tr><tr><td>50 mL Tubo cornico</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>15 mL Tubo cornico</td><td>SPL</td><td>50015</td><td></td></tr><tr><td>10 mL Pipetta monouso</td><td>Falcon</td><td>7551</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Pipetta monouso</td><td>Falcon</td><td>7543</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">ASC Materiali per terreni di coltura</td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Life Technologies</td><td>14190-144</td><td></td></tr><tr><td>DMEM Tecnologie per la vita a basso contenuto di glucosio</td><td></td><td>11885-084</td><td>terreni di base per la crescita</td></tr><tr><td>Penicilina Streptomicina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr> <tr><td>Siero fetale bovino</td><td>Life Technologies</td><td>16000-044</td><td>10%</td></tr><tr><td>PBS/1 mM EDTA</td><td>Life Technologies</td><td>12604-039</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Materiali per terreni di differenziazione condrogenica</td></tr><tr><td>DMEM High glucose</td><td>Life Technologies</td><td>11995</td><td>mezzi di base per differenziazione condrogenica</td></tr><tr><td>Soluzione di aminoacidi non essenziali MEM (100x)</td><td>Life Technologies</td><td>11140-050</td><td></td></tr><tr><td>Desametasone</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2915</td><td>100 nM</td></tr><tr><td>Penicilina Streptomicina</td><td>Life Technologies</td><td>P4333</td><td>1%</td></tr> <tr><td>Fetale Siero Bovino Life</td><td>Technologies</td><td>16000-044</td><td>1%</td></tr> <tr><td>Ascorbato-2-fosfato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8960</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>L-prolina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P5607</td><td>50 &#956; g/mL</td></tr><tr><td>ITS</td><td>BD</td><td></td> 354352 <td>1%</td></tr><tr><td>TGF&beta umano; 1</td><td>Peprotech</td><td>100-21</td><td>10 ng/mL</td></tr><tr><td colspan="4">Materials</td></tr><tr><td>18 mm Vetro di copertura</td><td>Superior</td><td>HSU-0111580</td><td></td></tr><tr><td>4% Paraformaldyhyde</td><td>Tech & Innovazione</td><td>BPP-9004</td><td></td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>BIOSESANG</td><td>T1027</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina</td><td>vettoriale Lab</td><td>SP-5050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Collagene II anticorpo</td><td>abcam&nbsp;</td><td>ab34712</td><td>Anticorpo</td></tr><tr><td>secondario IgG (H+L) anti-coniglio 1:100, Alexa Fluor 594 Sonda molecolare coniugata</td><td></td><td>A-11037</td><td>Sonda molecolare DAPI 1:200</td></tr><tr><td></td><td>D1306</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Reagente antidissolvenza in oro prolungato</td> Vetro per vetrini <td>Invitrogen</td><td>P36934</td><td></td></tr>, <tr><td>rivestito</td><td>Hyun Il Lab-Mate</td><td>HMA-S9914</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Invitrogen</td><td>15596-018</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>366919</td><td></td></tr><tr><td>Isopripilalcol</td><td>Millipore</td><td>109634</td><td></td></tr><tr><td>Etanolo</td><td>Duksan</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>RevertAid First Strand cDNA Kit di sintesi</td><td>Thermo Scientfic</td><td>K1622</td><td></td></tr><tr><td>i-Taq DNA polimerasi</td><td>iNtRON BIOTECH</td><td>25021</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10x TBE Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>15581-044</td><td></td></tr><tr><td>stella di carico</td><td>Dyne Bio</td><td>A750</td><td></td></tr><tr><td>Agarosio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>9012-36-6</td><td></td></tr><tr><td>1 kb (+) Marcatore a scala del DNA</td><td>Enzimiche</td><td>DM003</td><td></td></tr><tr><td>Cellule staminali umane di derivazione adiposa (ASC)</td><td>Cellule</td><td></td><td></td> MASTER cattoliche</tr></tbody></table>

condrogenico differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

Chondrogenic Differentiation Induction of Adipose-derived Stem Cells by Centrifugal Gravity

La cartilagine compromessa non può guarire naturalmente. Attualmente, la terapia più avanzata per i difetti della cartilagine è il trapianto di condrociti differenziati da cellule staminali utilizzando citochine. Sfortunatamente, la differenziazione condrogenica indotta da citochine è costosa, dispendiosa in termini di tempo e associata a un alto rischio di contaminazione durante la differenziazione in vitro. Tuttavia, gli stimoli biomeccanici fungono anche da fattori regolatori cruciali per la condrogenesi. Ad esempio, lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, suggerendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. In questo studio, abbiamo dimostrato che la gravità centrifuga (CG, 2.400 × g), uno stress meccanico facilmente applicabile per centrifugazione, induce la sovraregolazione della regione Y che determina il sesso (SRY)-box 9 (SOX9) nelle cellule staminali di derivazione adiposa (ASC), inducendole ad esprimere fenotipi condrogenici. Le ASC centrifugate esprimevano livelli più elevati di marcatori di differenziazione condrogenica, come l'aggrecano (ACAN), il collagene di tipo 2 alfa 1 (COL2A1) e il collagene di tipo 1 (COL1), ma livelli più bassi di collagene di tipo 10 (COL10), un marcatore di condrociti ipertrofici. Inoltre, è stata osservata la formazione di aggregati condrogenici, un prerequisito per la condrogenesi, nelle ASC centrifugate.

gravità centrifuga induce la sovraespressione di marcatori di differenziazione condrogeniche in cellule staminali derivate da tessuto adiposo. Per determinare il grado di forza di gravità centrifuga atta ad indurre la differenziazione condrogenico, ASC sono state stimolate con diversi gradi di CG (0, 300, 600, 1200, e 2400 xg) per 15 min. Dopo la stimolazione, le ASC sono stati ri-seminate su piastre di coltura e coltivate per...

Lo stress meccanico può indurre la differenziazione condrogenica delle cellule staminali, fornendo un potenziale approccio terapeutico per la riparazione della cartilagine compromessa. Presentiamo un protocollo per indurre la differenziazione condrogenica di cellule staminali di derivazione adiposa (ASC) utilizzando la gravità centrifuga (CG). L'upregolazione di SOX9 indotta dalla CG porta allo sviluppo di fenotipi condrogenici.

Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

Impaired cartilage cannot heal naturally. Currently, the most advanced therapy for defects in cartilage is the transplantation of chondrocytes ...

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre la differenziazione condrogenica degli ASC per la riparazione difettosa della cartilagine. Questo metodo consiste nell'indurre la differenziazione precondrogenica degli ASC utilizzando la forza di gravità centrifuga. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla differenziazione condrogenica degli ASC, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la differenziazione osteogenica e fibrogenica.Il vantaggio principale di questa tecnica è che la differenziazione condrogenica può essere facilmente indotta dalle cellule staminali senza trattare alcuna citochina. A dimostrare la procedura saranno Yeri Alice Rim e Yoojun Nam del mio laboratorio. Inizia raccogliendo l'80% di cellule staminali di derivazione adiposa confluente da un piatto di coltura da 100 millilitri, scartando il terreno e lavandolo con cinque millilitri di PBS.Quindi, aggiungere un millilitro di PBS contenente un millimolare di EDTA e incubare per due minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica. Dopo due minuti, picchiettare delicatamente la piastra di coltura, quindi aggiungere quattro millilitri di terreno fresco e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 250 volte g per due minuti a temperatura ambiente.Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.Per il caricamento centrifugo per gravità, trasferire 2,5 volte dieci alla quinta cella in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 2400 volte g per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, procedere alla coltura in pellet o in micromassa. Immediatamente dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e a 500 microlitri di terreno di differenziazione condrogenico, o CDM, e 50 microgrammi per millilitro di acido L-ascorbico 2-fosfato appena preparato nel pellet.Un controllo positivo, induce la differenziazione condrogenica e raccoglie le sue cellule aggiungendo CDM contenente 10 nanogrammi per millilitro di TGF-beta-1. Tappare le provette e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica per tre settimane. Subito dopo la centrifugazione a caricamento per gravità, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 microlitri di CDM.Per formare una micromassa, pipettare le cellule sospese al centro di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e quindi posizionare la piastra nell'incubatore. Dopo due ore, aggiungere con cautela 500 microlitri di CDM al pozzetto, pipettando contro la parete della piastra per evitare di distruggere la micromassa. Come controllo positivo, eseguire una coltura di micromassa con cellule non centrifugate aggiungendo CDM contenente 10 nanogrammi per millilitro di TGF-beta-1.Incubare la micromassa per tre settimane. Il giorno 21 dopo la formazione della micromassa, utilizzare una pipetta per raccogliere i pellet di sferoide, quindi lavare con 1X PBS. Fissare i pellet di sferoide mediante immersione in paraformaldeide al 4% per 24 ore.Il giorno successivo, scartare il fissativo e sciacquare i pellet cellulari con acqua deionizzata. Posizionare uno strato di garza sulla cassetta dei fazzoletti e trasferire i pellet di sferoide fissati utilizzando una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudere il coperchio della cassetta.Successivamente, disidratare i pellet di sferoidi immergendoli in etanolo al 70% per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, continua con una serie di concentrazioni di etanolo per cinque minuti ciascuna. Quindi immergere i pellet in xilene al 100% per 15 minuti.Immergere i pellet di sferoidi in paraffina a 56 gradi Celsius per l'inclusione. Quindi, tagliare sezioni spesse cinque micron dal pellet cellulare incorporato nella paraffina utilizzando un microtomo rotante. Far galleggiare le sezioni in etanolo al 50%, quindi trasferirle in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius.Montare le sezioni flottanti sui vetrini, quindi procedere con safranina o e blu alciano per la colorazione immunofluorescente. Per determinare una forza di gravità centrifuga adeguata, gli ASC sono stati fatti girare a gravità centrifuga di zero, 300, 600, 1, 200 e 2, 400 volte g per quindici minuti. L'espressione dell'mRNA SOX9 è stata valutata 24 ore dopo la stimolazione del CG.Un CG di 2.400 volte g ha indotto significativamente l'espressione dell'mRNA di SOX9. Per valutare l'espressione dei geni correlati alla condrogenesi, l'RNA totale è stato estratto da ASC non stimolati, ASC che erano stati centrifugati o trattati con TGF-beta-one. Come si vede qui, la stimolazione CG induce l'espressione del collagene di tipo 2 e dell'aggrecano.La sovraespressione di collagene di tipo 2 negli ASC trattati con CG è stata confermata dall'immunofluorescenza utilizzando un anticorpo contro il collagene di tipo 2 in un anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 594. Per determinare l'effetto della CG sulla sovraespressione della ECM correlata alla condrogenesi, gli ASC sono stati trattati con TGF-beta-one come controllo positivo. Il controllo negativo era una coltura di pellet non sottoposta a caricamento CG o trattamento con TGF-beta-one.La sovraespressione della ECM correlata alla condrogenesi è stata valutata in pellet di sferoidi costituiti da ASC centrifugati attraverso l'uso di safranina o e colorazione con blu di alciano. Il glicosaminoglicano, un componente importante della cartilagine articolare, è stato colorato di blu alciano o colorato di arancione con safranina o. Dopo 14 giorni di coltura di micromassa, la condensazione dei condrociti è stata valutata in base alla dimensione degli aggregati.La dimensione di ciascun aggregato, generato da CG, era di circa 0,5 millimetri. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la differenziazione conndogenica delle cellule staminali utilizzando la forza di gravità centrifuga.

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