Condrogenico Differenziazione induzione di cellule staminali derivate da tessuto adiposo per gravità centrifuga

L'obiettivo generale di questa procedura è indurre la differenziazione condrogenica degli ASC per la riparazione difettosa della cartilagine. Questo metodo consiste nell'indurre la differenziazione precondrogenica degli ASC utilizzando la forza di gravità centrifuga. Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulla differenziazione condrogenica degli ASC, può essere applicato anche ad altri sistemi, come la differenziazione osteogenica e fibrogenica.

Il vantaggio principale di questa tecnica è che la differenziazione condrogenica può essere facilmente indotta dalle cellule staminali senza trattare alcuna citochina. A dimostrare la procedura saranno Yeri Alice Rim e Yoojun Nam del mio laboratorio. Inizia raccogliendo l'80% di cellule staminali di derivazione adiposa confluente da un piatto di coltura da 100 millilitri, scartando il terreno e lavandolo con cinque millilitri di PBS.

Quindi, aggiungere un millilitro di PBS contenente un millimolare di EDTA e incubare per due minuti a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica. Dopo due minuti, picchiettare delicatamente la piastra di coltura, quindi aggiungere quattro millilitri di terreno fresco e trasferire le cellule in una provetta conica da 15 millilitri. Centrifugare le celle a 250 volte g per due minuti a temperatura ambiente.

Dopo la centrifugazione, rimuovere il surnatante senza disturbare il pellet. Quindi, risospendere il pellet in 10 millilitri di terreno. Contare le cellule utilizzando un emocitometro.

Per il caricamento centrifugo per gravità, trasferire 2,5 volte dieci alla quinta cella in un nuovo tubo conico da 15 millilitri e centrifugare a 2400 volte g per 15 minuti. Dopo la centrifugazione, procedere alla coltura in pellet o in micromassa. Immediatamente dopo la centrifugazione, aspirare il surnatante e a 500 microlitri di terreno di differenziazione condrogenico, o CDM, e 50 microgrammi per millilitro di acido L-ascorbico 2-fosfato appena preparato nel pellet.

Un controllo positivo, induce la differenziazione condrogenica e raccoglie le sue cellule aggiungendo CDM contenente 10 nanogrammi per millilitro di TGF-beta-1. Tappare le provette e incubare a 37 gradi Celsius in un incubatore umidificato contenente il 5% di anidride carbonica per tre settimane. Subito dopo la centrifugazione a caricamento per gravità, aspirare il surnatante e risospendere il pellet in 10 microlitri di CDM.

Per formare una micromassa, pipettare le cellule sospese al centro di un pozzetto di una piastra a 24 pozzetti e quindi posizionare la piastra nell'incubatore. Dopo due ore, aggiungere con cautela 500 microlitri di CDM al pozzetto, pipettando contro la parete della piastra per evitare di distruggere la micromassa. Come controllo positivo, eseguire una coltura di micromassa con cellule non centrifugate aggiungendo CDM contenente 10 nanogrammi per millilitro di TGF-beta-1.

Incubare la micromassa per tre settimane. Il giorno 21 dopo la formazione della micromassa, utilizzare una pipetta per raccogliere i pellet di sferoide, quindi lavare con 1X PBS. Fissare i pellet di sferoide mediante immersione in paraformaldeide al 4% per 24 ore.

Il giorno successivo, scartare il fissativo e sciacquare i pellet cellulari con acqua deionizzata. Posizionare uno strato di garza sulla cassetta dei fazzoletti e trasferire i pellet di sferoide fissati utilizzando una pipetta. Coprire il pellet piegando la garza e chiudere il coperchio della cassetta.

Successivamente, disidratare i pellet di sferoidi immergendoli in etanolo al 70% per cinque minuti a temperatura ambiente. Quindi, continua con una serie di concentrazioni di etanolo per cinque minuti ciascuna. Quindi immergere i pellet in xilene al 100% per 15 minuti.

Immergere i pellet di sferoidi in paraffina a 56 gradi Celsius per l'inclusione. Quindi, tagliare sezioni spesse cinque micron dal pellet cellulare incorporato nella paraffina utilizzando un microtomo rotante. Far galleggiare le sezioni in etanolo al 50%, quindi trasferirle in un bagno d'acqua a 50 gradi Celsius.

Montare le sezioni flottanti sui vetrini, quindi procedere con safranina o e blu alciano per la colorazione immunofluorescente. Per determinare una forza di gravità centrifuga adeguata, gli ASC sono stati fatti girare a gravità centrifuga di zero, 300, 600, 1, 200 e 2, 400 volte g per quindici minuti. L'espressione dell'mRNA SOX9 è stata valutata 24 ore dopo la stimolazione del CG.

Un CG di 2.400 volte g ha indotto significativamente l'espressione dell'mRNA di SOX9. Per valutare l'espressione dei geni correlati alla condrogenesi, l'RNA totale è stato estratto da ASC non stimolati, ASC che erano stati centrifugati o trattati con TGF-beta-one. Come si vede qui, la stimolazione CG induce l'espressione del collagene di tipo 2 e dell'aggrecano.

sovraespressione di collagene di tipo 2 negli ASC trattati con CG è stata confermata dall'immunofluorescenza utilizzando un anticorpo contro il collagene di tipo 2 in un anticorpo secondario coniugato Alexa Fluor 594. Per determinare l'effetto della CG sulla sovraespressione della ECM correlata alla condrogenesi, gli ASC sono stati trattati con TGF-beta-one come controllo positivo. Il controllo negativo era una coltura di pellet non sottoposta a caricamento CG o trattamento con TGF-beta-one.

La sovraespressione della ECM correlata alla condrogenesi è stata valutata in pellet di sferoidi costituiti da ASC centrifugati attraverso l'uso di safranina o e colorazione con blu di alciano. Il glicosaminoglicano, un componente importante della cartilagine articolare, è stato colorato di blu alciano o colorato di arancione con safranina o. Dopo 14 giorni di coltura di micromassa, la condensazione dei condrociti è stata valutata in base alla dimensione degli aggregati.

La dimensione di ciascun aggregato, generato da CG, era di circa 0,5 millimetri. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in 30 minuti, se eseguita correttamente. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come indurre la differenziazione conndogenica delle cellule staminali utilizzando la forza di gravità centrifuga.