Name: Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 29 s
Description: Impara a indurre lesioni da ischemia-riperfusione nella pelle dell'orecchio del topo per l'imaging multiphoton intravitale. Questo metodo consente di studiare le risposte immunitarie in vivo in tempo reale.

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Ringraziamo Thomas Graf per averci fornito i topi LysM-eGFP.

Tutti gli esperimenti che si occupano di animali vivi sono stati condotti in conformità a tutte le uso animale pertinente e linee guida e regolamenti per la cura. 1. Scelta di topi reporter fluorescente <ol><li> Utilizzare da 6 a 12 settimane di età LysM-eGFP 11 topi (senza preferenza per maschi o femmine). Nota: L&#39;uso di vari topi reporter fluorescente specifiche delle celle consente la visualizzazione di diverse cellule immunitarie in vivo. In questo ceppo, neutrofili (cellule GFP HI) circolanti, monociti (cellule GFP LO) e macrofagi dermici (cellule GFP LO) circolanti possono essere visualizzati. Con i parametri di imaging utilizzati, verranno rilevati solo i segnali luminosi da neutrofili GFP-positive. Nota: un elenco di ceppi fluorescente reporter di topo specifico per cellule immunitarie adatte per questo tipo di studio di imaging pelle può essere trovato in riferimento 8. Nota: E &#39;altamente raccomandato che i topi albini essere utilizzato per l&#39;imaging, come pigmentopi ted sono più inclini a fotodanneggiamento. Questo è perché la pelle dell&#39;orecchio pigmentata è molto più sensibile alla pezzatura indotta da laser (indicativa della combustione del tessuto). Come risultato, il reclutamento di neutrofili e accumulo possono essere osservati anche durante lo stato stazionario 8,12. </li><li> Mantenere i topi in specifici (SPF) condizioni esenti da organismi patogeni con cicli di luce-buio di 12 h. </li></ol> 2. mouse Anestesia <ol><li> Anestetizzare il mouse con un&#39;iniezione intraperitoneale di ketamina-xylazina (8 microlitri g -1 di peso corporeo), composto da una miscela di 15 mg mL -1 ketamina e 1 mg mL -1 xilazina disciolto in acqua sterile. </li><li> Posizionare il mouse su una piastra elettrica per mantenere la sua temperatura corporea a 37 ° C durante tutta la procedura di preparazione. Verificare la presenza di anestesia sufficienti osservando l&#39;assenza di un riflesso punta pizzico. Nota: Dopo la prima ora, dosi successive quarti di anestetico dovranno essere somministrato per via sottocutanea unad avrà una durata di circa 0,5 ore ciascuna. La contrazione di baffi o la coda può anche indicare che l&#39;anestesia indossa fuori e che è necessario un top-up. </li><li> Utilizzare lubrificante oftalmica sugli occhi per prevenire la secchezza mentre sotto anestesia. </li></ol> 3. Depilazione <ol><li> Applicare con attenzione crema depilatoria per i due terzi superiori del padiglione auricolare dorsale del mouse utilizzando applicatori di cotone-punta. </li><li> Attendere 2 - 3 minuti prima di togliere la crema utilizzando bagnato applicatori di cotone punta in maniera approfondita ma gentile. Nota: Non permettere crema depilatoria per rimanere sull&#39;orecchio del mouse per troppo tempo, in quanto potrebbe indurre l&#39;infiammazione 13,14. </li></ol> 4. L&#39;induzione di ischemia e riperfusione <ol><li> Utilizzare dorati, N42-grade magneti al neodimio spessi, diametro di 12 mm x 2 mm, e con un rating Gauss di circa 3.000 per indurre ischemia nella pelle dell&#39;orecchio mouse. Nota: In questo caso, la faccia fossette dei magneti Denotes suo polo nord. </li><li> Slot i magneti nelle loro singole guide in plastica. Nota: La guida di plastica serve per facilitare il posizionamento e la separazione dei magneti ad alta resistenza. Grazie alla loro forza magnetica ancora bassa resistenza alla rottura, non posizionare singoli magneti in stretta vicinanza l&#39;uno all&#39;altro o altri metalli. Rottura e frammentazione può verificarsi se la tirano verso l&#39;altro. </li><li> Posizionare la prima (dorsale) magnete tale che solo il bordo è a contatto con il secondo (ventrale) magnete (Figura 3a) Nota: Questo impedisce i magneti da scattare insieme prima che siano stati posizionati correttamente. </li><li> Posizionare entrambi i magneti in modo tale che il magnete ventrale adagiata su un orecchio (Figura 3a). Nota: Prima di ischemia è indotto, assicurarsi che il mouse viene mantenuta a 37 ° C e che l&#39;anestesia sufficiente è mantenuta (vedi passo 2.2). </li><li> Una volta pronto, lasciate accuratamente i magneti si incontrano (Figura 3a </strong&gt;). Nota: Per scopi di imaging, morsetto solo la metà dell&#39;orecchio in modo che si possono osservare un IR e non IR regione. </li><li> Dopo 1,5 h di ischemia, rimuovere i magneti ruotando i magneti distanti utilizzando le guide di plastica, permettendo riperfusione avvenire. Nota: Si deve prestare attenzione per evitare che le orecchie formazione di pieghe quando i magneti sono posti. Ischemia incompleta è evidente se i vasi sanguigni principali macroscopicamente visibili ri-nei profumi immediatamente (cioè, il sangue riempie i vasi immediatamente) dopo i magneti sono stati rimossi. Sebbene riperfusione non avviene immediatamente dopo la rimozione di magneti, occlusione del vaso sanguigno è solo transitoria. Come tale, è indispensabile per preparare l&#39;orecchio del mouse per l&#39;imaging più rapidamente possibile. </li></ol> 5. L&#39;iniezione di Vaso sanguigno Etichettatura Agents <ol><li> Subito dopo la rimozione del magnete, somministrare per via endovenosa (via retro-orbitale o iniezione vena della coda) blu Evans (10 mg mL -1in PBS o soluzione fisiologica; 1 ml g -1 di peso corporeo) o un altro agente etichettatura dei vasi sanguigni di scelta. Nota: Prima dell&#39;iniezione, assicurarsi che l&#39;anestesia sufficiente è ancora mantenuto effettuando dolce pizzicare punta. </li></ol> 6. Il posizionamento del orecchio sulla piattaforma di imaging <ol><li> Tagliare 2 pezzi di nastro adesivo 1,5 cm di lunghezza e 1,8 cm di larghezza. </li><li> Lasciare le parti adesive per stare insieme pur lasciando circa 1 mm di adesivo lungo la sua larghezza. </li><li> Tagliare il nastro adesivo in due, longitudinalmente, per accogliere il suo posizionamento all&#39;interno della fessura sulla piattaforma orecchio. </li><li> Inserire il nastro adesivo a metà attraverso la fessura, in modo che il lato adesivo rivolto verso l&#39;alto. </li><li> Posizionare il mouse sul tappetino di riscaldamento, in modo tale che l&#39;orecchio per essere ripreso è vicino alla striscia di nastro adesivo. </li><li> Utilizzando due PBS-inumidite applicatori di cotone punta, premere delicatamente l&#39;orecchio contro la striscia adesiva. </li><li> Utilizzando la striscia come una guida, portare l&#39;orecchio del mouseattraverso la fenditura e contemporaneamente regolare il mouse più stretta verso il palco. </li><li> Per rimuovere il nastro adesivo, prima aggiungere una goccia di PBS per ridurre l&#39;adesività del nastro. </li><li> Separare l&#39;orecchio mouse dal nastro adesivo il più delicatamente possibile utilizzare un pennello fine. </li><li> Appiattire l&#39;orecchio contro la piattaforma orecchio da dolci un umido applicatore di cotone-punta sopra l&#39;orecchio. </li><li> Mettere una goccia di PBS sotto il coprioggetto (che è tenuta in posizione sul supporto coprioggetto con grasso; figura 2) e delicatamente posizionarlo sopra l&#39;orecchio. Top con più PBS, se necessario. Nota: Il supporto coprioggetto aumenta la stabilità durante l&#39;imaging. </li><li> Inserire la sonda temperatura rettale e collegare i fili al sistema di riscaldamento in base alle istruzioni del produttore. Nota: impostare la temperatura della piastrina riscaldamento del corpo a 37 ° C e la piattaforma fase orecchio a 35 ° C. </li></ol> 7. Multiphoton Microscopio Sete imaging Parametri Nota: Questo protocollo utilizza un singolo fascio, multiphoton microscopio con un sintonizzabile (680 - 1.080 nm) laser Ti: Sa (3,3 W a 800 nm; lunghezza di impulso di 140 fs; 80 MHz frequenza di ripetizione) con un obiettivo 20X acqua (NA = 1.0) per studi di imaging intravitale. <ol><li> Aprire il software di imaging. </li><li> Allineare il laser secondo le istruzioni del produttore. </li><li> Regolare la lunghezza d&#39;onda di eccitazione di 950 nm. Nota: GFP e blu Evans può essere contemporaneamente eccitati a 950 nm. </li><li> Per anteprima, utilizzare le seguenti impostazioni: 500 micron 2 scanfield, risoluzione 505 x 505 pixel, e una frequenza di scansione di 800 Hz in una singola scansione di linea. Fai clic su &quot;Anteprima&quot;. </li><li> Alterna l&#39;attenuatore (laser) di potenza. Assicurarsi che tutti i segnali necessari vengono prelevati senza esporre il campo di imaging a quantità eccessive di potenza del laser, che possono indurre danni dovuti al calore. Nota: Iniziare a bassa potenza attenuatore e aumentare se la signal è scarsa. Come neutrofili saranno assenti dalla interstizio in fase precoce rileva post-riperfusione, macrofagi possono essere utilizzati come un misuratore per determinare la potenza minima necessaria, in quanto i primi sono dimmer di neutrofili. Nota: Se questa fase deve essere fatto per la prima volta, regolare le impostazioni nella zona non-ischemica, in cui si prevede l&#39;integrità vascolare intatto e faciliterà l&#39;impostazione della potenza attenuatore. In esperimenti successivi, queste impostazioni non richiedono modifiche molto meno che la potenza del laser è instabile. </li><li> Regolare le impostazioni PMT. Nota: Verificare con il produttore per la massima tensione di guadagno ottimale per la PMT. Impostazione della tensione PMT oltre la soglia raccomandata si tradurrà in un più alto rapporto segnale-rumore. La raccomandazione generale è di impostare il guadagno di tensione PMT alla soglia raccomandata e di aumentare la potenza attenuatore necessaria se il segnale è troppo debole. </li><li> Selezionare una regione di imaging che è in prossimità diil bordo della ischemia, caratterizzata da una massiccia fuoriuscita blu Evans. </li><li> Raccogliere GFP e Evans segnali blu utilizzando 525/50 passa-banda (BP) e 655/40 filtri BP, rispettivamente. Per generazione di seconda armonica (SHG) segnali di fibre di collagene all&#39;interno del compartimento dermico, utilizzare un filtro di BP 475/42. </li><li> Creare una cartella in cui salvare le immagini in un formato compatibile per il software di analisi delle immagini disponibili. </li><li> Per acquisire, utilizzare le seguenti impostazioni: 500 micron 2 scanfield, risoluzione 505 x 505 pixel, e una scansione di frequenza 400 Hz in una singola scansione di linea. </li><li> Un 100-micron z-stack con un passo di 4 micron può essere acquisita più volte nel corso del tempo, ad intervalli di 1 minuto, per il monitoraggio dei neutrofili infiltrazione. Nota: Soprattutto per leucociti (ad esempio, neutrofili) con una velocità migratoria superiore, un intervallo che è più lungo di 1 min possono provocare difficoltà durante l&#39;analisi di inseguimento cellulare. In questo caso, l&#39;utente può ridurre lo spessore del acquisizione pila o aumentare la frequenza di scansione. Nota: Mentre la pila acquisizione desiderata della zona ischemica può apparire più piccole a causa della compressione (alternativamente caratterizzato da un&#39;intensità SHG superiore), la successiva riperfusione provocherà infiammazione massiccia che causa l&#39;orecchio a gonfiarsi. Si prevede derive significativi nella direzione Z. Come tale, l&#39;acquisizione di un gran z-stack è necessaria per accogliere la deriva. </li><li> Durante la formazione immagine, rabboccare il PBS e acqua regolarmente per mantenere l&#39;orecchio umido e la lente obiettivo immerso in acqua. Nota: un tipico esperimento di solito dura 2-4 ore. A seconda del disegno sperimentale, ed accoppiato con un regime di anestesia ben controllato, estendendo la durata di imaging è possibile. </li></ol> 8. Terminare l&#39;esperimento <ol><li> Eutanasia il mouse da anidride carbonica per asfissia secondo l&#39;dell&#39;istituzione Comitato Istituzionale cura degli animali e Usa (IACUC) procedures. Nota: eutanasia sempre il mouse con metodi approvati come determinato da norme, regolamenti e linee guida dell&#39;istituzione. Se è necessario ripetere l&#39;imaging, tenere il mouse sul tappetino di riscaldamento fino a quando l&#39;anestesia svanisce. Una volta che il mouse ha ripreso conoscenza sufficiente ed è mobile, riportare il mouse per la sua gabbia. </li></ol> Analisi 9. Immagine Nota: I dati generati dal esperimento di imaging possono essere visualizzati da diversi pacchetti software. <ol><li> Aprire il software di analisi delle immagini. </li><li> Sotto Surpass Mode, importare il file (Open → selezionare qualsiasi file nella cartella desiderata → Click &quot;open&quot;). </li><li> Modifica pseudo colori se i colori di default non si applicano (regolazione Modifica → Display → Sotto la scheda di canale, selezionare il colore desiderato dalla tavolozza dei colori). </li><li> Regolare la luminosità, il contrasto, e lo sfondo (Modifica → Display Regolazione → Toggle valori max e min). </li&gt; <li> Verificare che le dimensioni del file siano corretti (proprietà Modifica → Immagine → Nella scheda geometria, verificare la dimensione voxel. In questo protocollo, X = 0,99, Y = 0,99, e Z = 4). Nota: Derive X e Y dividendo la dimensione scanfield dal pixel di risoluzione. Z è lo spessore tra ogni fetta. Nota: L&#39;uscita di questi insiemi di dati può essere presentato come film di proiezione massima. Nota: l&#39;analisi di monitoraggio è necessario per caratterizzare completamente le attività cellulari e interazioni al fine di comprendere la loro funzione in vivo. Istruzioni dettagliate di monitoraggio cella utilizzando la funzione di posto disponibili nel software possono essere trovati nel protocollo di riferimento 15. Nota: Ci sono molti modi di migrazione dei leucociti quantificazione, i cui dettagli possono essere trovati nell&#39;articolo revisione in riferimento 16. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Importanza IR è una delle principali cause di ulcere da pressione pelle. Le fasi (I e II) di ulcere da pressione descrivono la condizione della pelle umana (rispetto ai tessuti sottocutanei sottostanti e muscoli). Tuttavia, una comprensione della eziologia immunologica è ancora carente. Qui, vi presentiamo un modello IR semplice e robusto sulla pelle orecchio mouse per colmare questa lacuna. Simuliamo ischemia fissando l&#39;orecchio mouse tra due magneti e successivamente studiare le risposte ...

danno da ischemia-riperfusione (IRI) si verifica quando vi è una ipossia transitoria causa l&#39;ostruzione del flusso sanguigno (ischemia) seguita da una successiva riossigenazione dei tessuti (riperfusione). Nella pelle, ischemia-riperfusione (IR) è pensato per essere uno dei fattori che contribuiscono alla fisiopatologia delle ulcere da pressione, dove prolungato riposo a letto predispone i pazienti in ospedale a lungo termine per infortunio. In questi pazienti, sia la pelle ed i muscoli sottostanti sono costantemente esposti alla pressione del peso esercitato sulle aree di prominenza ossea, con conseguente lesioni localizzate che, se non trattata, può diventare necrotico 1. I danni coinvolte in un IRI sono duplici. Durante l&#39;ischemia, l&#39;occlusione di vasi sanguigni porta ad un drastico calo di apporto di ossigeno ai tessuti. Ciò si traduce in una diminuzione di ATP e di pH, che inattiva ATPasi coinvolti nel metabolismo cellulare. A loro volta, i livelli di calcio cellulari picco, e ha sottolineato oc danneggiatiells apoptosi o necrosi 2. Il rilascio di contenuti intracellulari o danni associati modelli molecolari (grezzo), come HMGB1, contribuisce alla risposta infiammatoria 3. Il secondo insulto si verifica durante la riperfusione. Anche se i livelli di ossigeno e pH vengono ripristinati durante la riperfusione, ciò comporta la generazione di specie reattive dell&#39;ossigeno (ROS), che porta alla ossidazione dei lipidi intracellulari, DNA e proteine. Di conseguenza, i mediatori pro-infiammatori sono attivati, che scatena una risposta infiammatoria secondaria che prevede il reclutamento di cellule immunitarie al sito infiammatorio 2. Mentre la cascata di eventi biochimici che portano alla risposta infiammatoria è stata ben descritta, la regolazione spaziale e temporale delle attività delle cellule immunitarie non sono ben compresi. Qui, descriviamo un modello IR robusta sulla pelle orecchio del mouse utilizzando semplici bloccaggio magnete. Accoppiato con l&#39;imaging intravitale multiphoton (MP-IVM), abbiamostabilito un modello per studiare le risposte infiammatorie in vivo che si verificano dopo riperfusione avviene. La logica dietro lo sviluppo e l&#39;utilizzo di questa tecnica è quello di cercare di capire come sia cellule interstiziali e infiltranti rispondono a infrarossi in tempo reale. Modelli esistenti di IR utilizzando la tecnica di serraggio sul fianco pelle sono altamente invasiva, in quanto richiedono l&#39;impianto chirurgico di piastre di acciaio a fianco pelle, rendendoli meno che ideale per studi immunologici 4. Una tecnica di fissaggio non invasiva simile è stato descritto nel 5,6 topo pelle fianco. Tuttavia, a causa della incorporazione della componente di imaging intravitale in questo metodo, abbiamo invece scelto la pelle dell&#39;orecchio come sito IR mirato, come elude movimenti dovuti alla respirazione e offre stabilità durante l&#39;imaging 7,8. Inoltre, sottoinsiemi leucociti che abbracciano l&#39;interstizio sono identici tra la pelle orecchio e il fianco pelle, anche se lanumeri e proporzioni possono variare leggermente 9. Così, la pelle dell&#39;orecchio rappresenta un sito di imaging ideale. Inoltre, la maggior parte dei dati recuperati da questi modelli IRI sono limitati a valutazioni macroscopici (classificazione delle ulcere) e le analisi microscopiche di endpoint indicatori infiammatori 10. Utilizzando questo modello, visualizzazione in tempo reale della risposta cellulare dei neutrofili dopo riperfusione nella pelle di un topo reporter fluorescente è abilitato. Un modello di imaging intravitale orecchio precedentemente pubblicato viene utilizzato 8 con ulteriori modifiche (figure 1, 2).

<table><tbody><tr><td colspan="4">Mice ceins</td></tr><tr><td>Lysozyme-GFP C57BL/6</td><td>Thomas Graf, Center for Genomic Regulation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>C57BL/6-C2J</td><td>Jackson Laboratories</td><td>000058</td><td>Da incrociare con Lysozyme-GFP per generare lisozima-GFP albino per l'imaging</td></tr><tr> cutaneo<td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>PBS</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Viaflex 0,9% (wt/vol) soluzione salina</td><td>Baxter Healthcare</td><td>F8B1323</td><td></td></tr><tr><td>ketamina (100 mg mL&minus; 1 ketamina cloridrato</td><td>Parnell</td><td></td><td>La ketamina è una droga controllata e tutte le normative locali pertinenti devono essere seguite</td></tr><tr><td>Ilio xilazil-20 (20&nbsp; mg&nbsp; mL&minus; 1 xilazina cloridrato)</td><td>Troy Laboratories</td><td></td><td>Xylazil-20 è un farmaco controllato e devono essere seguite tutte le normative locali pertinenti.</td></tr><tr><td>Blu Evans (10&nbsp; mg&nbsp; mL&minus; 1 in PBS o soluzione fisiologica)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46160</td><td></td></tr><tr>Acqua <td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>ultrapurificata<td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Siringa da insulina con ago</td><td>BD</td><td>328838</td><td></td></tr><tr><td>Pipette di trasferimento</td><td>Biologix Research Company</td><td>30-0135</td><td></td></tr><tr><td>3 M nastro adesivo in carta</td><td>3M</td><td>2214</td><td></td></tr><tr><td>Deckglaser microscopio coperchio vetro (22 mm & volte; 32 mm)</td><td>Paul Marienfeld</td><td>101112</td><td></td></tr><tr><td>Pinze per schegge curve</td><td>Aesculap, B. Braun Melsungen</td><td>BD312R</td><td></td></tr><tr><td>Veet crema depilatoria</td><td>Reckitt Benckiser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Medical applicatori con punta in cotone</td><td>Puritan Medical Products Company</td><td>806-WC</td><td></td></tr><tr><td>Asciugamani piegati a C</td><td>Kimberly-Clark</td><td>20311</td><td></td></tr><tr><td>Salviette delicate Kimwipes</td><td>Kimtech Science</td><td>34155</td><td></td></tr><tr><td>Magneti al neodimio placcati in oro, grado N42, diametro 12 mm e spessore 2 mm&nbsp;</td><td>first4magnets</td><td>F656S</td><td></td></tr><tr><td>Guida in plastica, 10 cm per 1,5 cm (materiale in cloruro di polivinile)</td><td></td><td></td> <td>piegarsi a metà nel senso della lunghezza, legare con nastro adesivo e magnete a fessura in</td></tr><tr><td>grasso per alto vuoto</td><td>Dow Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Microscope</td></tr><tr><td>TriM Scope II microscopio a raggio singolo a due fotoni</td><td>LaVision BioTec</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Accordabile (680&ndash; 1.080 nm) Coherent Chameleon Ultra II One Box Laser Ti:zaffiro (&ge; 3,3 W a 800 nm; lunghezza dell'impulso di 140 fs, frequenza di ripetizione di 80 MHz)</td><td>Obiettivi coerenti</td><td></td><td></td></tr><tr><td>per immersione in acqua (20&volte;, NA = 1,0)</td><td>Olympus</td><td>XLUMPLFLN20xW</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Set di filtri e specchi per miscroscopio (per imaging GFP, SHG, Evans Blue)</td></tr><tr><td>495</td><td>Chroma</td> pass lungo <td>T495LPXR</td><td></td></tr><tr><td>560 lomg-pass</td><td>Chroma</td><td>T560LPXR</td><td></td></tr><tr><td>475/42 passa-banda</td><td>Semrock</td><td>FF01-475/42-25</td><td></td></tr><tr><td>525/50 passa-banda</td><td>Chroma</td><td>ET525/50m</td><td></td></tr><tr><td>655/40 passa-banda</td><td>Chroma</td><td>NC028647</td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Piattaforma per palco per l'imaging della pelle (fare riferimento allo schema per il montaggio)</td></tr><tr><td>A piastra di base in metallo (126 mm &volte; 126 mm &volte; 1 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Una piattaforma in ottone per l'orecchio (79 mm & volte; 19 mm; 1 mm di spessore lateralmente, 0,5 mm di spessore al centro; <forte>Figura 1</forte>) con fessura (1,7 mm & volte; 1 mm; 1,5 mm di distanza dal bordo lungo)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Due blocchi di plastica (10 mm di altezza)... per l'isolamento</td><td></td><td></td><td></td>termico</tr><tr><td>Supporto curvo, per il posizionamento del termistore di controllo sulla piattaforma</td><td></td><td></td><td></td>auricolare</tr><tr><td>Cavo di interfaccia CC-28 con connettore DIN e termistori, uno per il controllo della temperatura e l'altro per il monitor della temperatura</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640106</td><td>collegare il cavo di interfaccia a entrambi i blocchi riscaldanti resistivi impostati a 35 &deg; C</td></tr><tr><td>Blocchi riscaldanti resistivi RH-2</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640274</td><td>I blocchi riscaldanti resistivi possono riscaldare la piattaforma dell'orecchio in ottone fino a oltre 100 gradi; C in pochi minuti. Assicurarsi che il termistore di controllo sia stato fissato correttamente nel supporto per evitare il surriscaldamento.</td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura TC-344B per la piattaforma dell'orecchio</td> <td>(Warner Instruments (Harvard Apparatus)</td><td>640101</td><td></td></tr><tr><td>Regolatore di temperatura TR-200 per tappetino riscaldante per mouse</td><td>L'unità Fine Science Tools</td><td>21052-00</td><td>non è più in vendita. Chiedi al produttore alternative</td></tr><tr><td>L'alimentatore per l'unità TR-200</td><td>Fine Science Tools</td><td>21051-00</td><td>non è più in vendita. Chiedi al produttore alternative</td></tr><tr><td>L'unità Heating Pad</td><td>Fine Science Tools</td><td>21060-00</td><td>non è più in vendita. Chiedi al produttore delle alternative.</td></tr><tr><td>Sonda rettale animale&nbsp;</td><td>L'unità Fine Science Tools</td><td>21060-01</td><td>non è più in vendita. Chiedi al produttore delle alternative. Dopo aver collegato la sonda rettale e il termoforo al termoregolatore TR-200, impostare la temperatura su 37 &deg; C</td></tr><tr><td colspan="4">Portavetrini</td></tr><tr><td>2 aste di plastica, 1 cm di diametro, 10 cm di lunghezza</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 adattatore di plastica con fori praticati per ospitare le aste (fare riferimento allo schema)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>3 viti di serraggio in plastica per mantenere le aste di plastica in posizione</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1 piastra metallica, 6 cm x 2,5 cm, con un taglio quadrato di 2 cm a 1 estremità, 2 mm di distanza dal bordo</td><td></td><td></td><td></td>corto</tr><tr><td>1 paio di dadi e bulloni per fissare la piastra metallica all'asta</td><td></td><td></td><td></td>di plastica</tr><tr><td>1 base acrilica (4 cm x 5 cm x 1,5 cm) con magnete per tenere il supporto del vetrino coprioggetti sulla piattaforma del tavolino per l'imaging della pelle. 1 asta è fissata in modo permanente sulla base.</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Software di analisi delle immagini</td></tr><tr><td>Imaris v8.1.2</td><td>Bitplane</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

inducendo ischemia-riperfusione lesioni in ear pelle mouse per intravitale multiphoton imaging delle risposte immunitarie

Inducing Ischemia-reperfusion Injury in the Mouse Ear Skin for Intravital Multiphoton Imaging of Immune Responses

Il danno da ischemia-riperfusione (IRI) si verifica quando c'è ipossia transitoria dovuta all'ostruzione del flusso sanguigno (ischemia) seguita da una successiva riossigenazione dei tessuti (riperfusione). Nella pelle, l'ischemia-riperfusione (IR) è il principale fattore che contribuisce alla fisiopatologia delle ulcere da pressione. Mentre la cascata di eventi che portano alla risposta infiammatoria è stata ben studiata, le risposte spaziali e temporali dei diversi sottogruppi di cellule immunitarie a una lesione IR non sono ben comprese. I modelli esistenti di IR che utilizzano la tecnica di clampaggio sul fianco cutaneo sono altamente invasivi e inadatti per studiare le risposte immunitarie alle lesioni, mentre simili studi di clampaggio magnetico non invasivi nel fianco cutaneo sono tutt'altro che ideali per gli studi di imaging intravitale. In questo protocollo, descriviamo un robusto modello di IR non invasivo sviluppato sulla pelle dell'orecchio di topo, in cui miriamo a visualizzare in tempo reale la risposta cellulare delle cellule immunitarie dopo la riperfusione tramite imaging intravitale multifotone (MP-IVM).

Questo protocollo utilizza una piattaforma di imaging pelle dell&#39;orecchio su misura, come mostrato in Figura 1. Diverse caratteristiche di questa piattaforma sono progettati specificamente per facilitare l&#39;imaging, pur mantenendo le impostazioni fisiologici. Posizionando l&#39;orecchio sulla piattaforma ottone riscaldati non mantiene solo l&#39;orecchio ad una temperatura fisiologica di 35 ° C, ma anche ad isolare l&#39;orecchio da inevitabili movimenti dovuti al...

Questo protocollo descrive l&#39;induzione di un modello di ischemia-riperfusione (IR) sulla pelle orecchio mouse utilizzando magnete di bloccaggio. Utilizzando un modello di imaging intravitale custom-built, studiamo in vivo risposte infiammatorie post-riperfusione. La logica alla base dello sviluppo di questa tecnica è quello di estendere la comprensione di come leucociti rispondono al danno IR pelle.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

Ischemia-reperfusion injury (IRI) occurs when there is transient hypoxia due to the obstruction of blood flow (ischemia) followed by a subsequent ...

L'obiettivo generale di questo esperimento è comprendere come le cellule immunitarie rispondono all'ischemia da riperfusione mediante imaging intravitale a multiphoton del padiglione auricolare del topo. Questo metodo può contribuire a rispondere ad alcune domande fondamentali nel campo dell'Immunologia e della Dermatologia, permettendo di comprendere il comportamento dinamico delle cellule immunitarie. Il principale vantaggio di questa tecnica è che fornisce un modello di imaging solido per lo studio delle attività cellulari nella cute in condizioni infiammate o di riposo.Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle lesioni da ischemia-riperfusione, può essere applicato anche ad altri sistemi, come le reazioni di ipersensibilità e le infezioni. Per iniziare la procedura, posizionare il topo su un tappetino riscaldante per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius durante tutta la preparazione. Verificare la profondità dell'anestesia attraverso l'assenza del riflesso alla compressione delle dita dei piedi.Successivamente, applicare un lubrificante oftalmico sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'anestesia. In seguito, applicare con attenz

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Questo video mostra la tecnica di microscopia a fluorescenza intravitale per studiare la formazione di trombi in un modello murino. Al topo viene iniettato un polisaccaride marcato con fluoroforo per monitorare la circolazione sanguigna. Dopo l'illuminazione con una luce ad alta intensità, l'induzione fototossica di una lesione nella microvascolarizzazione dell'orecchio porta alla formazione di un trombo, che viene confermato visualizzando l'ostruzione nel flusso sanguigno.

Microscopia a fluorescenza intravitale per studiare la formazione di trombi microvascolari

La matrice extracellulare subisce sostanziale rimodellamento durante la guarigione delle ferite, l'infiammazione e tumorigenesi. Vi presentiamo un approccio immunofluorescenza intravitale romanzo per visualizzare le dinamiche di fibrillare come pure componenti della matrice maglia-come con alta risoluzione spaziale e temporale con epifluorescenza o microscopia a due fotoni.

A lungo termine intravitale immunofluorescenza Imaging di tessuto componenti della matrice con Epifluorescenza e due fotoni Microscopia

I meccanismi che regolano la motilità interstiziale di cellule CD4 T effettrici in siti di infiammazione sono relativamente sconosciuti. Presentiamo un approccio non invasivo per visualizzare e manipolare cellule CD4 T vitro -primed nel derma dell'orecchio infiammate, permettendo studio del comportamento dinamico di queste cellule in situ.

Imaging CD4 T cellule interstiziali migrazione nel derma infiammate

Questo protocollo attuale impiega reporter fluorescenti, marcatura in vivo e tecniche di imaging intravitale per consentire il monitoraggio del processo dinamico di priming dei neutrofili negli animali viventi.

Imaging intravitale di neutrofili adescamento Utilizzando IL-1b Promoter-driven DsRed topi reporter

Il modello orecchio del mouse SKH1-Hr hr hairless consente intravitale microscopia a fluorescenza del microcircolo e fototossico induzione trombo senza previa preparazione chirurgica nel letto microvascolare esaminato. Pertanto, l'orecchio del topo glabro è un eccellente modello in vivo per studiare le complesse interazioni durante la formazione di trombi microvascolare, l'evoluzione del trombo, e trombolisi.

Intravitale Microscopia e Trombo induzione nel lobo di un mouse Hairless

Abbiamo stabilito un protocollo chirurgico romanzo per l'imaging del due-fotone del fegato di topi dal vivo con l'invasione minima. Con questa tecnica, abbiamo identificato la struttura dettagliata del fegato durante il endotoxemia lipopolysaccharide indotta. Prevediamo che questo metodo può essere utilizzato per determinare l'efficacia del trattamento di reagenti vari per migrazione leucocitaria epatica.

Due-fotone videomicroscopia Imaging dei leucociti durante la risposta immunitaria nel fegato Lipopolysaccharide-trattati del topo

L'imaging in vivo è un potente strumento per lo studio della biologia in salute e malattia. Questo protocollo descrive l'imaging transpupillare della retina del topo con un microscopio standard a due fotoni. Dimostra anche diversi metodi di imaging in vivoimaging per marcare in modo fluorescente più coorti cellulari della retina.

Transpupillare Due fotoni In vivo Imaging della retina del topo

Il reclutamento di leucociti e piastrine costituisce una componente essenziale necessaria per l'efficace crescita delle arterie collaterali durante l'arteriogenesi. La microscopia multifotonica è uno strumento efficiente per tracciare la dinamica cellulare con alta risoluzione spazio-temporale in vivo e meno fototossicità per studiare il reclutamento e lo stravaso dei leucociti durante l'arteriogenesi.

Multiphoton Intravital Imaging per il monitoraggio del reclutamento dei leucociti durante l'arteriogenesi in un modello murino di arti posteriori

La migrazione dei neutrofili si basa sul rapido e continuo rimodellamento della membrana plasmatica in risposta al chemioattrattivo e alle sue interazioni con il microambiente extracellulare. Qui descritta è una procedura basata sulla microscopia subcellulare intravitale per studiare la dinamica del rimodellamento della membrana nei neutrofili iniettati nell'orecchio di topi anestetizzati.

Imaging della migrazione dei neutrofili nella pelle del topo per studiare il rimodellamento della membrana subcellulare in condizioni fisiologiche

Il protocollo presenta un nuovo strumento per semplificare l'imaging intravitale utilizzando la microscopia confocale invertita.

Approccio semplificato di imaging intravitale per il monitoraggio a lungo termine della dinamica del tessuto epiteliale su un microscopio confocale invertito

Questo studio presenta un approccio di imaging a due fotoni in vivo per visualizzare le strutture dei terminali assonici dei meccanorecettori (LTMR) a bassa soglia nella pelle delle zampe anteriori dei topi. Utilizzando immagini ripetute ad alta risoluzione di singoli assoni, questo metodo offre una nuova piattaforma per studiare la struttura e la funzione del circuito sensoriale cutaneo durante lo sviluppo e negli adulti.

Imaging a due fotoni intravitali della morfologia degli assoni sensoriali del tatto nella pelle del topo

Impara a indurre lesioni da ischemia-riperfusione nella pelle dell'orecchio del topo per l'imaging multiphoton intravitale. Questo metodo consente di studiare le risposte immunitarie in vivo in tempo reale.

Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

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