Inducendo ischemia-riperfusione lesioni in Ear pelle mouse per intravitale Multiphoton Imaging delle risposte immunitarie

L'obiettivo generale di questo esperimento è capire come le cellule immunitarie rispondono alla riperfusione ischemica attraverso l'imaging multifotonico intravitale della pelle dell'orecchio del topo. Questo metodo può aiutare ad affrontare alcune delle domande molto importanti nel campo dell'immunologia e della dermatologia per comprendere il comportamento dinamico delle cellule immunitarie. Il vantaggio principale di questa tecnica è che fornisce un robusto modello di imaging per lo studio delle attività cellulari nella pelle in stato di infiammazione o di riposo.

Sebbene questo metodo possa fornire informazioni sulle lesioni da riperfusione ischemica, può essere applicato anche ad altri sistemi come le reazioni di ipersensibilità e le infezioni. Per iniziare questa procedura, posizionare il mouse su un termoforo per mantenere la temperatura corporea a 37 gradi Celsius durante la procedura di preparazione. Confermare la profondità dell'anestesia dall'assenza del riflesso di pizzicamento delle dita dei piedi.

Successivamente, applicare il lubrificante oftalmico sugli occhi dell'animale per prevenire la secchezza durante l'anestesia. Successivamente, applicare con cura la crema depilatoria sui due terzi superiori dell'orecchio dorsale e attendere due o tre minuti. Quindi, rimuovere la crema utilizzando applicatori con punta di cotone bagnata in modo accurato ma delicato.

Ora, induci l'ischemia nella pelle dell'orecchio del topo usando i magneti al neodimio. A tal fine, inserire prima i magneti nelle loro guide di plastica individuali. Posizionare un magnete in modo tale che solo il bordo entri in contatto con un secondo magnete ventrale, che deve essere posizionato sotto il lato ventrale dell'orecchio con l'orecchio appoggiato sul magnete.

Una volta pronti, lascia che i magneti si uniscano con cura. Dopo 1,5 ore di ischemia, rimuovere i magneti ruotandoli l'uno dall'altro utilizzando le guide di plastica, consentendo la riperfusione. Immediatamente dopo la rimozione del magnete, somministrare Evans Blue o un altro agente di marcatura dei vasi sanguigni di scelta per via endovenosa.

In questo passaggio, taglia due pezzi di nastro adesivo. Lascia che i lati dell'adesivo aderiscano lasciando circa un millimetro di adesivo lungo la sua larghezza. Quindi, tagliare il nastro adesivo in due per adattarlo al suo posizionamento all'interno della fessura sulla piattaforma dell'orecchio.

Inserire questo nastro adesivo circa a metà della fessura in modo che il lato adesivo sia rivolto verso l'alto. Successivamente, posizionare il mouse sul termoforo in modo che l'orecchio da riprendere si trovi accanto alla striscia di nastro adesivo. Utilizzando due applicatori con punta di cotone inumidita PBS, premere delicatamente l'orecchio contro la striscia adesiva.

Usando la striscia come guida, porta l'orecchio del mouse attraverso la fessura e contemporaneamente regola il mouse più vicino al tavolino. Poiché la pelle dell'orecchio è molto fragile, questo passaggio deve essere eseguito con molta attenzione per evitare lesioni indotte dalla preparazione. Per rimuovere il nastro adesivo, aggiungere prima una goccia di PBS per ridurre l'adesività del nastro.

Quindi, separare l'orecchio del mouse dal nastro adesivo il più delicatamente possibile utilizzando un pennello fine. Appiattisci l'orecchio contro la piattaforma dell'orecchio facendo rotolare delicatamente un applicatore con punta di cotone umido sull'orecchio. Successivamente, metti una goccia di PBS sotto il vetrino coprioggetti e posizionalo delicatamente sopra l'orecchio.

Successivamente, inserire la sonda di temperatura rettale e collegare i fili all'impianto di riscaldamento secondo le istruzioni del produttore. Per acquisire le immagini, posizionare l'animale sotto il microscopio multifotone. Inizia con una regione di imaging che si trova in prossimità del bordo dell'ischemia caratterizzata da una massiccia perdita di blu di Evans.

Il diagramma schematico mostra il posizionamento dei magneti. Queste due foto mostrano un orecchio pre-ischemico e uno post-ischemico dopo il bloccaggio del magnete. In questo schema dell'orecchio indica la regione ripresa rispetto a dove era stato posizionato il magnete.

Questa sequenza time lapse di massima proiezione, mostra l'infiltrazione di neutrofili in risposta alla riperfusione nella pelle dell'orecchio di topo albino LysM-eGFPM dopo 1,5 ore di ischemia. In momenti precedenti, la mancanza del segnale blu di Evans indica un'occlusione temporanea del vaso dopo l'ischemia. Una volta padroneggiati, i preparativi per l'orecchio ischemico riperfuso per l'imaging possono essere eseguiti in meno di 30 minuti se eseguiti correttamente.

Durante l'esecuzione di questa procedura, è importante controllare costantemente la profondità dell'anestesia e la temperatura del topo. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come la colorazione dell'intero topo della pelle dell'orecchio del topo per avere una visione globale delle localizzazioni cellulari. Dopo gli sviluppi di questo protocollo, ha aperto la strada ai ricercatori nel campo dell'immunologia e della dermatologia per esplorare l'immunità innata nella pelle dell'orecchio del topo.

Dopo aver visto questi video, dovresti avere una buona comprensione di come stabilire un modello di imaging della pelle dell'orecchio del topo per studiare il danno da riperfusione ischemica. Non dimenticare che lavorare con il microscopio multifoto può essere pericoloso. E dovrebbero essere prese precauzioni come la formazione sulla sicurezza laser.