Name: Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico lalternanza di splicing nelle cellule umane (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-04-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 6 s
Description: Scopri come progettare fattori di splicing artificiali per manipolare l'alternanza di splicing in cellule umane. Questo metodo flessibile utilizza domini PUF personalizzati per studiare la regolazione dell'RNA nelle cellule tumorali.

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Questo lavoro è stato supportato dal NIH concedere R01-CA158283 e NSFC concedere 31.400.726 di ZWYW è finanziato dal programma Talents Giovani Mille e la National Science Foundation naturali della Cina (borse di studio 31471235 e 81422038). XY è finanziato dalla fondazione post-dottorato di scienza della Cina (2015M571612).

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<li>McCabe, B. C., Gollnick, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+levels+of+trp+RNA-binding+attenuation+protein+in+Bacillus+subtilis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bacteriol%22%5BJournal%5D)">Cellular levels of trp RNA-binding attenuation protein in Bacillus subtilis.</a> J Bacteriol. 186 (15), 5157-5159 (2004).</li>
<li>Wang, Y., Ma, M., Xiao, X., Wang, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Intronic+splicing+enhancers%2C+cognate+splicing+factors+and+context-dependent+regulation+rules%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Intronic splicing enhancers, cognate splicing factors and context-dependent regulation rules.</a> Nat Struct Mol Biol. 19 (10), 1044-1052 (2012).</li>
<li>Choudhury, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+splicing+activator+DAZAP1+integrates+splicing+control+into+MEK%2FErk-regulated+cell+proliferation+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">The splicing activator DAZAP1 integrates splicing control into MEK/Erk-regulated cell proliferation and migration.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li>
<li>Xiao, X., Wang, Z., Jang, M., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Coevolutionary+networks+of+splicing+cis-regulatory+elements%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Coevolutionary networks of splicing cis-regulatory elements.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 104 (47), 18583-18588 (2007).</li>
<li>Wang, Z., Xiao, X., Van Nostrand, E., Burge, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((General+and+specific+functions+of+exonic+splicing+silencers+in+splicing+control%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">General and specific functions of exonic splicing silencers in splicing control.</a> Mol Cell. 23 (1), 61-70 (2006).</li>
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<li>Shapiro, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+EMT-Driven+Alternative+Splicing+Program+Occurs+in+Human+Breast+Cancer%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">An EMT-Driven Alternative Splicing Program Occurs in Human Breast Cancer.</a> PLoS Genet. 7 (8), 1002218(2011).</li>
<li>David, C. J., Manley, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alternative+pre-mRNA+splicing+regulation+in+cancer%3A+pathways+and+programs+unhinged%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Alternative pre-mRNA splicing regulation in cancer: pathways and programs unhinged.</a> Genes Dev. 24 (21), 2343-2364 (2010).</li>
<li>Ladomery, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aberrant+alternative+splicing+is+another+hallmark+of+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Cell+biol%22%5BJournal%5D)">Aberrant alternative splicing is another hallmark of cancer.</a> Int J Cell biol. 2013, (2013).</li>
<li>Karni, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+gene+encoding+the+splicing+factor+SF2%2FASF+is+a+proto-oncogene%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">The gene encoding the splicing factor SF2/ASF is a proto-oncogene.</a> Nat Struct Mol Biol. 14 (3), 185-193 (2007).</li>
<li>Anczukòw, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SRSF1-regulated+alternative+splicing+in+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+cell%22%5BJournal%5D)">SRSF1-regulated alternative splicing in breast cancer.</a> Mol cell. 60 (1), 105-117 (2015).</li>
</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo rapporto fornisce una descrizione dettagliata per la progettazione e la costruzione di fattori di splicing artificiali che possono specificatamente manipolare splicing alternativo di un gene bersaglio. Questo metodo sfrutta la modalità di legame dell&#39;RNA unico PUF ripete per produrre un ponteggio RNA-binding con specificità personalizzato. Può essere utilizzato per attivare o reprimere splicing. Il passaggio critico in questo protocollo è la generazione del dominio PUF reprogramed...

La maggior parte dei geni umani subiscono splicing alternativo (AS) per produrre molteplici isoforme con attività distinte, che ha notevolmente aumentato la complessità di codifica del genoma 1, 2. AS fornisce un meccanismo importante per regolare la funzione del gene, ed è strettamente regolata attraverso percorsi diversi in diverse fasi cellulari e dello sviluppo 3, 4. Perché splicing misregulation è una comune causa di malattie umane 5, 6, 7, 8, il targeting regolamentazione splicing sta diventando un percorso terapeutico attraente. Secondo un modello semplificato di regolazione di splicing, AS è controllata principalmente mediante splicing Regulatory cis -Elementi (SRE) in pre-mRNA che funziona come enhancers splicing o silenziatori di esoni alternativi. thEse SRE specificamente reclutano vari fattori proteici trans- attivi ( cioè fattori di splicing) che promuovono o sopprimono la reazione di splicing 3 , 9 . La maggior parte dei fattori di splicing trans- attivi dispongono di domini specifici di sequenza RNA specifici di sequenza per riconoscere i loro obiettivi e domini effettivi per controllare la splicing. Gli esempi più noti sono i membri della famiglia di proteine ​​ricca di serina / arginina (SR) che contengono N-terminali RNA Recognition Motifs (RRMs) che legano gli enzimi di splicing esoni e domini RS-terminali RS che promuovono l&#39;inclusione di esone 10 . Al contrario, hnRNP A1 si lega ai silenziatori esogeni di splicing attraverso i domini RRM e inibisce l&#39;inclusione di esone attraverso un dominio C-terminale ricco di glicina 11 . Utilizzando tali configurazioni modulari, i ricercatori dovrebbero essere in grado di progettare fattori di splicing artificiali combinando un determinato dominio RNA-binding (RBD) con differenti effecDomini che attivano o inibiscono lo splicing. La chiave di un tale progetto è quella di utilizzare un RBD che riconosca determinati target con specificità di legame di RNA programmabile, che è analogo al modo di legame del DNA del dominio TALE. Tuttavia, la maggior parte dei fattori naturali di splicing contengono domini RRM o K Homology (KH), che riconoscono elementi di RNA corti con debole affinità e quindi non dispongono di un &quot;codice&quot; di riconoscimento di proteine ​​RNA predittivo 12 . Il RBD delle proteine ​​di ripetizione PUF ( ovvero il dominio PUF) ha una modalità di riconoscimento RNA unico, consentendo la ridefinizione dei domini PUF per riconoscere in modo specifico diversi target RNA 13 , 14 . Il dominio PUF canonico contiene otto ripetizioni di tre α-eliche, ciascuno riconoscendo una singola base in un target RNA a 8 nt. Le catene laterali di amminoacidi in determinate posizioni della seconda elica a forma di legami idrogeno specifici con il bordo di Watson-CrickBase RNA, che determina la specificità di binding di RNA di ogni ripetizione ( Figura 1A ). Il codice per il riconoscimento base di RNA della ripetizione del PUF è sorprendentemente semplice ( Figura 1A ), consentendo la generazione di domini PUF che riconoscono qualsiasi possibile combinazione di 8 basi (riesaminate da Wei e Wang 15 ). Questo principio di progettazione modulare consente la generazione di un Fattore di Splicing Engineered (ESF) costituito da un dominio PUF personalizzato e da un dominio di modulazione di splicing ( cioè un dominio SR o un dominio ricco di Gly). Questi ESF possono funzionare come attivatori di splicing o come inibitori per controllare vari tipi di eventi di splicing e si sono dimostrati utili come strumenti per manipolare la splicing di geni endogeni legati alla malattia umana 16 , 17 . Ad esempio, abbiamo costruito ESF di tipo PUF-Gly per alterare in modo specifico la splicing del gene Bcl-x, Convertendo la lunga isoforma anti-apoptotica (Bcl-xL) per il pro-apoptotica breve isoforma (Bcl-XS). Spostando il rapporto tra la Bcl-x isoforma era sufficiente per sensibilizzare varie cellule tumorali a più farmaci chemioterapici anti-cancro 16, suggerendo che questi fattori artificiali possono essere utili come potenziali reagenti terapeutici. Oltre a controllare splicing con noti domini effettori splicing (ad esempio, un RS o Gly-ricca dominio), i fattori ingegnerizzati PUF possono anche essere utilizzati per esaminare le attività dei nuovi fattori di splicing. Ad esempio, utilizzando questo approccio, abbiamo dimostrato che il dominio C-terminale di diverse proteine SR può attivare o inibire splicing quando associa alle regioni differenti 18 pre-mRNA, che il motivo ricco-alanina di RBM4 può inibire splicing 19, e che il motivo ricco di prolina di DAZAP1 può migliorare splicing 20, 21 &lt;/ Sup&gt;. Questi nuovi domini funzionali possono essere usati per costruire altri tipi di fattori artificiali per perfezionare splicing.

<table><tbody><tr><td>DNA polimerasi ad alta fedeltà (Phusion High-Fidelity) con tampone PCR</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>DNA ligasi (T4 DNA ligasi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202L</td><td></td></tr><tr><td>Reagente di trasfezione liposomiale (Lipofectamine 2000)</td><td>Invitrogen</td><td>11668-019</td><td></td></tr><tr><td>Terreno sierico ridotto (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985-062</td><td></td></tr><tr><td>RNA tampone di estrazione (reagente TRIzol)</td><td>ambion</td><td>15596018</td><td>reagente TRIzol contiene fenolo, che può causare ustioni. Indossare i guanti quando si maneggia</td></tr><tr><td>PBS (1x)</td><td>Life Technologies</td><td>10010-031</td><td></td></tr><tr><td>SuperScript III Trascrittasi inversa (RT)</td><td>Invitrogen</td><td>18080044</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo caspasi-3</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9668</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo PARP</td><td>Tecnologia di segnalazione cellulare</td><td>9542</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo Bcl-x</td><td>BD</td><td>Bioscience 610211</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo beta-actina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5441</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo alfa-tubulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5168</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo FLAG</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F4042</td><td></td></tr><tr><td>membrana nitrocellulosica</td><td>Amersham-Pharmacia</td><td>RPN203D</td><td></td></tr><tr><td>ECL Western Blotting reagenti di rilevamento</td><td>Invitrogen</td><td>WP20005</td><td></td></tr><tr><td>Cy5-dCTP</td><td>GE Healthcare</td><td>PA55021</td><td></td></tr><tr><td>Selezionatore cellulare attivato da fluorescenza (FACS)</td><td>BD Bioscience</td><td>FACSCalibur&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco' s Aquila modificata' s Medium (DMEM)</td><td>GE Healthcare</td><td>SH30243.01</td><td></td></tr><tr><td>Siero fetale bovino (FBS)</td><td>Invitrogen</td><td>26140079</td><td></td></tr><tr><td>Ioduro di propidio (PI)</td><td>Sigma</td><td>P4170</td><td></td></tr><tr><td>Siero bovino Albumina (BSA)</td><td>Sigma</td><td>A7638-5G</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X100</td><td>Promega</td><td>H5142</td><td></td></tr><tr><td>Poli-L-Lisina&nbsp;</td><td>Sigma</td><td>P-4832</td><td>Filtrare-sterilizzare e conservare a 4 gradi C</td></tr><tr><td>Vettore pWPXLd</td><td>Addgene</td><td>12258</td><td></td></tr><tr><td>Vettore pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>12259</td><td></td></tr><tr><td>Vettore psPAX2</td><td>Addgene</td><td>12260</td><td></td></tr><tr><td>DNasi I (senza RNasi)</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td></td></tr><tr><td>Oligo(dT)18 Primer</td><td>Thermo Scientific</td><td>SO131&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpo secondario anti-topo (Anti-IgG di topo, anticorpo legato a HRP)</td><td>Cell Signaling Technology</td><td>7076S</td><td></td></tr></tbody></table>

ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

Engineering Artificial Factors to Specifically Manipulate Alternative Splicing in Human Cells

Il trattamento della maggior parte RNA eucariotici è mediata da RNA Binding Proteins (RBPs) con configurazioni modulari, tra cui un modulo di riconoscimento di RNA, che si lega specificamente al bersaglio pre-mRNA e un dominio effettore. In precedenza, abbiamo preso vantaggio della modalità di legame dell&#39;RNA unica del dominio PUF in pumilio umano 1 per generare un ponteggio programmabile vincolante RNA, che è stato utilizzato per progettare vari RBPs artificiali per manipolare il metabolismo dell&#39;RNA. Qui, un protocollo dettagliato è descritto per costruire fattori di splicing Engineered (ESFS) che sono specificamente progettati per modulare lo splicing alternativo di geni bersaglio. Il protocollo comprende come progettare e costruire un ponteggio PUF personalizzato per uno specifico bersaglio RNA, come costruire un plasmide di espressione FSE fondendo un designer dominio PUF e un dominio effettore, e come utilizzare ESFS per manipolare lo splicing di geni bersaglio. Nei risultati rappresentativi di questo metodo, abbiamo anche descritto i saggi comuniDelle attività di ESF che utilizzano reporter di splicing, l&#39;applicazione di ESF nelle cellule umane colte e l&#39;effetto successivo di cambiamenti di splicing. Seguendo i protocolli dettagliati in questa relazione, è possibile progettare e generare ESF per la regolazione di diversi tipi di Splicing Alternativo (AS), fornendo una nuova strategia per studiare la regolazione di splicing e la funzione di diverse isoforme di splicing. Inoltre, fondendo diversi domini funzionali con un dominio PUF progettato, i ricercatori possono progettare fattori artificiali che mirano a specificare gli RNA per manipolare varie fasi di elaborazione RNA.

Questo rapporto descrive il protocollo completo per la progettazione e la costruzione di ESF e reporter di splicing. Descrive anche l'ulteriore applicazione dei FSE nella manipolazione dell'AS dei geni endogeni 16 . Per illustrare i risultati tipici delle modifiche di splicing mediate da ESF, utilizziamo i dati del nostro lavoro precedente come esempio. I FSE con differenti domini funzionali possono essere utilizzati per promuovere o inibire l'inclusione dell'eson...

Questa relazione descrive un metodo bioingegneria per progettare e costruire nuovi fattori artificiali splicing (ASF) che specificamente modulano la giunzione di geni bersaglio in cellule di mammifero. Questo metodo può essere ulteriormente ampliata per progettare vari fattori artificiali di manipolare altri aspetti del metabolismo dell&#39;RNA.

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l&#39;alternanza di splicing nelle cellule umane

The processing of most eukaryotic RNAs is mediated by RNA Binding Proteins (RBPs) with modular configurations, including an RNA recognition module, which ...

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di ingegnerizzare fattori di splicing artificiali in grado di manipolare in modo specifico lo splicing alternativo di un determinato bersaglio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'elaborazione dell'RNA, come la regolazione e la cattiva regolazione dello splicing alternato nelle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua flessibilità.Siamo in grado di progettare fattori artificiali che promuovono o inibiscono diversi tipi di splicing alternativo in un dato gene. A dimostrare questa procedura saranno Huan-Huan, un ricercatore associato del mio laboratorio, e Qianyun, un postdoc del mio laboratorio. Il DNA PUF wild-type viene utilizzato come modello per generare lo scaffold del dominio PUF personalizzato.Utilizzare primer PCR contenenti sequenze PUF che riconoscono in modo specifico diversi nucleotidi di RNA in ciascuna posizione. Per ogni ripetizione PUF, utilizzare quattro diversi inneschi per riconoscere una base diversa in ogni posizione. Nel primo round PCR, utilizzare le coppie di primer mostrate per generare sequenze di codifica per quattro ripetizioni PUF, frammenti

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Genetica

È stato dimostrato che la regolazione alternativa dello splicing contribuisce alla transizione epitelio-mesenchimale (EMT), un programma cellulare essenziale in vari processi fisiologici e patologici. Qui descriviamo un metodo che utilizza un modello EMT inducibile per il rilevamento di splicing alternativo durante l'EMT.

Rilevamento di splicing alternativo Durante epiteliale-mesenchimale transizione

Qui si descrive un protocollo volto ad indagare l'impatto di aberrant splicing sulla resistenza ai farmaci nei tumori solidi e le neoplasie ematologiche. A questo scopo, abbiamo analizzato i profili trascrittomica dei modelli genitoriali e resistenti in vitro attraverso RNA-Seq e stabilito un metodo basato qRT-PCR per convalidare geni candidati.

Utilizzando RNA-sequenziamento per rilevare Novel Splice varianti correlati alla resistenza ai farmaci in<em&gt; In Vitro</em&gt; modelli di cancro

È descritto un in situ (ISH) protocollo di ibridazione che utilizza brevi oligonucleotidi antisenso per rilevare modelli d'impionbatura alternativa pre-mRNA nelle sezioni del cervello del mouse.

Analisi quantitativa di impionbatura alternativo Pre-mRNA nelle sezioni del cervello del Mouse usando analisi di RNA In Situ di ibridazione

Cloniamo e analizziamo i geni dei reporter generando RNA circolari. Questi geni reporter sono più grandi dei costrutti per analizzare lo splicing lineare e contenere elementi Alu. Per studiare gli RNA circolari, i costrutti vengono trasfettati in cellule e l'RNA risultante viene analizzato utilizzando RT-PCR dopo la rimozione dell'RNA lineare.

Uso dell'elemento Alu contenente Minigenes per analizzare gli RNA circolari

Questo protocollo descrive la conversione dei fibroblasti cutanei in mioblasti e la loro differenziazione in miotubi. Le linee cellulari sono derivate da pazienti con disturbi neuromuscolari e possono essere utilizzate per indagare meccanismi patologici e testare strategie terapeutiche.

Riprogrammazione diretta dei fibroblasti umani in mioblasti per indagare le terapie per i disturbi neuromuscolari

Questo protocollo presenta uno strumento rapido e utile per valutare il ruolo di una proteina con funzione insolita nella regolazione dello splicing alternativo dopo il trattamento chemioterapico.

Utilizzo dello strumento Minigene E1A per studiare le modifiche allo splicing dell'mRNA

Lo splicing alternativo (AS) e la poliadenilazione alternativa (APA) espandono la diversità delle isoforme di trascrizione e dei loro prodotti. Qui, descriviamo i protocolli bioinformatici per analizzare i saggi di sequenziamento di massa dell'RNA-seq e 3' per rilevare e visualizzare AS e APA che variano in base alle condizioni sperimentali.

Identificazione di splicing alternativo e poliadenilazione in dati di RNA-seq

Questo protocollo descrive un minigene reporter assay per monitorare l'impatto delle mutazioni del sito di giunzione 5'-splicing sullo splicing e sviluppa snRNA U1 soppressore per il salvataggio dell'inibizione dello splicing indotta da mutazioni. I costrutti di snRNA U1 reporter e soppressore sono espressi in cellule HeLa e lo splicing viene analizzato mediante estensione di primer o RT-PCR.

Un test cellulare basato su reporter per il monitoraggio dell'efficienza di giunzione

Nuove strategie per modellare fedelmente le mutazioni somatiche nelle cellule staminali e progenitrici ematopoietiche (HSPC) sono necessarie per studiare meglio la biologia delle cellule staminali ematopoietiche e le neoplasie ematologiche. Qui, viene descritto un protocollo per modellare mutazioni eterozigoti con guadagno di funzione nelle HSPC combinando l'uso di CRISPR / Cas9 e la doppia trasduzione del donatore rAAV.

Ingegnerizzazione di mutazioni oncogeniche eterozigoti con guadagno di funzione in cellule staminali e progenitrici ematopoietiche umane

Questo protocollo descrive un metodo per trasfezione efficiente siRNA in appena isolate citotrofoblasti villi umani con microperforazione e identificando complessi DNA-proteina in queste cellule. cellule trasfettate possono essere monitorati da Western Blot e EMSA analisi durante il tempo della cultura di 4 giorni.

siRNA Transfection e l&#39;EMSA Analisi su appena isolate umani dei villi citotrofoblasti

Scopri come progettare fattori di splicing artificiali per manipolare l'alternanza di splicing in cellule umane. Questo metodo flessibile utilizza domini PUF personalizzati per studiare la regolazione dell'RNA nelle cellule tumorali.

Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l'alternanza di splicing nelle cellule umane

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