Ingegneria fattori artificiali per manipolare in modo specifico l'alternanza di splicing nelle cellule umane

L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di ingegnerizzare fattori di splicing artificiali in grado di manipolare in modo specifico lo splicing alternativo di un determinato bersaglio. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo dell'elaborazione dell'RNA, come la regolazione e la cattiva regolazione dello splicing alternato nelle cellule tumorali. Il vantaggio principale di questa tecnica è la sua flessibilità.

Siamo in grado di progettare fattori artificiali che promuovono o inibiscono diversi tipi di splicing alternativo in un dato gene. A dimostrare questa procedura saranno Huan-Huan, un ricercatore associato del mio laboratorio, e Qianyun, un postdoc del mio laboratorio. Il DNA PUF wild-type viene utilizzato come modello per generare lo scaffold del dominio PUF personalizzato.

Utilizzare primer PCR contenenti sequenze PUF che riconoscono in modo specifico diversi nucleotidi di RNA in ciascuna posizione. Per ogni ripetizione PUF, utilizzare quattro diversi inneschi per riconoscere una base diversa in ogni posizione. Nel primo round PCR, utilizzare le coppie di primer mostrate per generare sequenze di codifica per quattro ripetizioni PUF, frammenti di ponte universale e frammenti di cappuccio.

Nel secondo round, utilizzare i prodotti PCR generati nell'ultimo passaggio come modelli con le combinazioni di primer mostrate per generare sequenze codificanti per i codici di riconoscimento dell'RNA da R-uno a R-quattro e da R-cinque a R-otto. Nel terzo round, utilizzare i prodotti del secondo round e collegare il quarto al quinto come modelli con il primer diretto R-one e il primer inverso R-eight per generare sequenze di codifica da R-one a R-eight senza cappucci. Nel quarto round PCR, utilizzare da R-1 a R-8, il tappo terminale a cinque numeri primi e il tappo terminale a tre numeri primi come modelli, per generare sequenze di codifica per domini PUF completi.

Per iniziare la trasfezione delle cellule HEK-293T, mescolare il reagente di trasfezione liposomiale capovolgendo delicatamente i flaconi. Quindi diluire due microlitri di reagente di trasfezione liposomiale in 50 microlitri di terreno sierico ridotto per trasfezione. Mescolare delicatamente e poi incubare per cinque minuti a temperatura ambiente.

Successivamente, diluire 04 microgrammi di vettore di espressione del dominio ricco di glicina e 0,2 microgrammi del plasmide reporter di splicing modulare in 50 microlitri di terreno sierico ridotto in una provetta sterile. Quindi diluire 0,4 microgrammi di vettore di espressione del dominio effettore RS e 0,2 microgrammi di plasmide reporter PGZ-3 in 50 microlitri di terreno sierico ridotto. Infine, diluire 0,4 microgrammi di vettore di espressione PGL-RS-PUF e 0,2 microgrammi di plasmidi reporter PEZ-1B o PEZ-2F in 50 microlitri di terreno sierico ridotto in una provetta sterile.

Dopo cinque minuti di incubazione a temperatura ambiente, mescolare delicatamente il reagente di trasfezione liposomiale diluito con le miscele plasmidiche diluite. Incubare le miscele finali per 20 minuti a temperatura ambiente. Quindi aggiungere le miscele di trasfezione contenenti i vettori di espressione a ciascun pozzetto di una piastra a 24 pozzetti seminata con cellule HEK-293 e incubare per almeno 12 ore in un incubatore umidificato a 37 gradi Celsius e 5% di anidride carbonica.

Dopo 12 ore di incubazione, raccogliere le cellule trasfettate mediante tripsinizzazione e centrifugazione. Dopo la centrifugazione, scartare il terreno e aggiungere 0,5 millilitri di tampone di estrazione dell'RNA per provetta. Aggiungere 0,1 millilitri di cloroformio per 0,5 millilitri di tampone di estrazione dell'RNA a ciascun campione.

Dopo l'incubazione, centrifugare le provette per 15 minuti a 12.000 volte G e quattro gradi Celsius. Quindi trasferire la base acquosa in una provetta nuova. Aggiungere 0,25 millilitri di isopropanolo per 0,5 millilitri di tampone di estrazione dell'RNA utilizzato nell'omogeneizzazione iniziale.

Mescolare a vortice e incubare a temperatura ambiente per 10 minuti. Dopo una centrifugazione come prima, il precipitato di RNA è solitamente visibile sul fondo della provetta. Scartare il surnatante e lavare il pellet di RNA con 0,5 millilitri di etanolo al 75% per 0,5 millilitri di tampone di estrazione dell'RNA.

Agitare energicamente, quindi centrifugare a 7, 500 volte G per cinque minuti a quattro gradi Celsius. Dopo la centrifuga, rimuovere il surnatante e asciugare all'aria i pellet di RNA. Sciogliere gli RNA in 50 microlitri di acqua priva di RNasi.

Quindi, aggiungi due microlitri di cinque unità per microlitro di DNasi-uno, sette microlitri di tampone 10X e 11 microlitri di acqua a ciascuna soluzione di RNA da 50 microlitri. Dopo l'incubazione, riscaldare le soluzioni a 70 gradi Celsius per 15 minuti per inattivare la DNasi. Dopo aver eseguito una reazione di trascrittasi inversa per sintetizzare il cDNA da ciascun campione, aggiungere i componenti della reazione PCR marcata con il corpo nell'ordine mostrato sullo schermo alle provette PCR.

Preparare una reazione per campione. Eseguire il programma RT-PCR sul termociclatore. Infine, risolvere i prodotti della PCR mediante elettroforesi attraverso un gel di poliacrilammide al 10% con tampone TBE.

Utilizza uno scanner a fluorescenza per visualizzare i prodotti e misura la quantità di ciascuna isoforma giuntata utilizzando un software di densitometria. Per il test di immunofluorescenza per misurare l'apoptosi, preparare una miscela di trasfezione contenente plasmidi di espressione del dominio ricchi di glicina, come mostrato in precedenza, e trasfettare le cellule HeLa coltivate su vetrini di vetro rivestiti di polilisina, in una piastra a sei pozzetti. 24 ore dopo la trasfezione, fissare le cellule sui vetrini coprioggetti con un millilitro di paraformaldeide al 4% in 1x PBS per 20 minuti a temperatura ambiente.

Quindi lavare delicatamente le cellule sui vetrini coprioggetti con due millilitri di 1x PBS per cinque minuti. Successivamente, permeabilizzare le cellule con Triton X-100 allo 0,2% in 1x PBS per 10 minuti. Dopo aver lavato tre volte con 1x PBS come prima, bloccare il legame non specifico con il 3% di albumina sierica bovina in 1x PBS per 10 minuti.

Diluire l'anticorpo flag da uno a 1.000 in BSA al 3% in PBS e pipettare 30 microlitri di anticorpo flag diluito su foglio di parafilm. Usa una pinza per rimuovere un vetrino coprioggetti. Asciugare accuratamente il tampone in eccesso con salviette da laboratorio, quindi posizionare il vetrino coprioggetti con la cella rivolta verso il basso sulla soluzione anti-flag.

Incubare per un'ora a temperatura ambiente. Dopo l'incubazione, aggiungere circa 500 microlitri di 1x PBS sul lato cellulare del vetrino coprioggetti fino a quando non galleggia sopra la soluzione. Rimettilo nella piastra a sei pozzetti con 1x PBS nei pozzetti.

Incubare con l'anticorpo secondario sul parafilm come prima per 15 minuti. Lavare come prima, quindi montare i vetrini coprioggetto sui vetrini del microscopio utilizzando un supporto di montaggio contenente DAPI. Visualizza le cellule utilizzando un microscopio a fluorescenza e fotografale utilizzando una fotocamera digitale.

Utilizzando la microscopia a immunofluorescenza, molte cellule che esprimono Gly-PUF-531 avevano DNA nucleare frammentato, indicando che stavano subendo apoptosi. Come controllo, le cellule che esprimono Gly-PUF wild-type avevano un DNA nucleare meno frammentato rispetto alle cellule trasfettate Gly-PUF-531. Qui, la microscopia a immunofluorescenza che utilizza l'anticorpo anti-flag fuso con cellule colorate con DAPI, mostra che il Gly-PUF-531 è localizzato prevalentemente nei nuclei delle cellule trasfettate.

Gly-PUF wild-type localizzato anche nei nuclei delle cellule trasfettate, suggerendo che questi ESF si dissociano dai loro bersagli quando gli mRNA completamente splicati vengono trasportati nel citoplasma. La percentuale di cellule apoptotiche con DNA nucleare frammentato è stata misurata da campi scelti casualmente di immagini di microscopia a fluorescenza. Una volta padroneggiata, la costruzione di scaffold PUF con specificità di legame dell'RNA può essere eseguita in due giorni se eseguita correttamente.

Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come manipolare in modo specifico lo splicing alternativo nelle cellule umane ingegnerizzando fattori artificiali.