Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di catturare le interazioni lipidico-proteina prossimale in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della dinamica mitocondriale, come ad esempio come le interazioni proteina-proteina nella membrana esterna mitocondriale possono essere influenzate dai lipidi accessori. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il collegamento dei domini proteici solubili ai modelli lipidici garantisce che sia possibile ottenere una conferma più nativa.

Inoltre, le complesse interazioni tra proteine solubili e i loro partner legati possono essere valutate in presenza di cofattori lipidici definiti. Sebbene utilizziamo questo metodo per studiare le interazioni proteiche nel macchinario di fissione mitocondriale, può anche essere applicato ad altri complessi proteici che si localizzano in diversi compartimenti di membrana. A dimostrare questa procedura sarà Ryan, uno studente laureato del mio laboratorio.

Innanzitutto, combina le soluzioni di cloroformio dei lipidi desiderati in una provetta di vetro pulita. Far evaporare il solvente con azoto gassoso secco mentre si ruota il tubo per formare un sottile film lipidico. Quindi rimuovere il solvente residuo con l'evaporatore centrifugo per un'ora a 37 gradi Celsius.

Successivamente, aggiungere il tampone A preriscaldato per ottenere una concentrazione lipidica finale di uno o due millimolari. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius con vortici occasionali per risospendere completamente la miscela lipidica. Dopo l'incubazione, trasferire la miscela lipidica in una provetta di plastica e immergerla in azoto liquido per circa 30 secondi fino a quando non sarà completamente congelata.

Quindi posizionare il tubo in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per uno o due minuti fino a quando non sarà completamente scongelato. Successivamente, preparare un estrusore lipidico immergendo quattro supporti filtranti e un filtro in policarbonato nel tampone A e assemblando l'estrusore secondo le istruzioni del produttore. Estrudere la soluzione lipidica attraverso il filtro 21 volte utilizzando una leggera pressione costante per garantire una distribuzione granulometrica omogenea.

Durante l'estrusione, utilizzare una pressione lenta e costante per garantire l'omogeneità delle dimensioni dei liposomi. Con un filtro da un micron, questo è meno importante. Ma con filtri di dimensioni più piccole, può introdurre un'eterogeneità più apparente.

Conservare i liposomi estrusi a quattro gradi Celsius. Incubare il fattore di fissione mitocondriale marcato con His-taged o Mff con liposomi scaffold per almeno 15 minuti a temperatura ambiente nel tampone A e BME. Per un controllo senza Mff, incubare i liposomi con una proteina di controllo marcata con His, come la GFP, per legare e schermare il nichel-NTA esposto.

Aggiungere la proteina uno correlata alla dinamina o Drp1 alla miscela di liposomi e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, trasferire cinque microlitri di campione su un foglio di pellicola da laboratorio e stendere una griglia di rame-rodio rivestita di carbonio sopra il campione. Dopo aver incubato per un minuto, rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro e aggiungere una goccia di acetato di uranile al 2%.

Dopo l'incubazione per un altro minuto, rimuovere la macchia in eccesso con carta da filtro e trasferire il campione in una scatola a griglia. Il giorno seguente, eseguire l'imaging dei campioni utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento compreso tra 18, 500 e 30, 000X per osservare i cambiamenti ultrastrutturali nelle morfologie delle proteine e dei liposomi. Incubare Mff e Fis1 marcati con His-tagging con i liposomi dello scaffold per 15 minuti a temperatura ambiente nel tampone A e BME.

Aggiungere Drp1 e incubare ogni miscela per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire le provette al termociclatore impostato a 37 gradi Celsius e avviare le reazioni aggiungendo GTP e cloruro di magnesio. Al momento desiderato, trasferire 20 microlitri di ciascuna miscela di reazione nei pozzetti di una piastra per microtitolazione contenente cinque microlitri di EDTA 0,5 molari per chelare il magnesio e fermare la reazione.

Successivamente, preparare una serie di standard di fosfato diluendo il fosfato di potassio nel tampone A e BME per calibrare i risultati. Aggiungere 20 microlitri di ogni standard ai pozzetti contenenti cinque microlitri di EDTA 0,5 molari. Aggiungere 150 microlitri di reagente verde malachite in ogni pozzetto.

Infine, leggere l'OD 650 cinque minuti dopo ogni aggiunta. Il GTP si idrolizza lentamente in presenza del reagente verde malachite acido. Pertanto, questo reagente deve essere aggiunto a tutti i pozzetti del campione entro 10 minuti dalla misurazione dell'assorbanza per massimizzare il rapporto segnale/rumore.

In assenza di Drp1, né Mff né GFP hanno provocato la deformazione della membrana. E solo liposomi privi di caratteristiche sono stati osservati per i liposomi di scaffold arricchiti decorati con GFP o ESL. Tuttavia, quando Drp1 è stato aggiunto ai modelli ESL decorati con Mff, il rimodellamento dei liposomi è stato evidente.

Decorazione della SL con attività GTPasi migliorata da Mff. Al contrario, quando i gruppi di testa NTA esposti sono stati bloccati con GFP marcata con His, questa attività GTPasi aumentata è stata ablata. Anche il legame di Fis1, privo del suo dominio transmembrana con il SL, non è riuscito a suscitare una stimolazione dell'attività GTPasi di Drp1.

Analogamente alla SL, l'aggiunta di SL/Cl a Drp1 ha provocato una leggera stimolazione dell'attività della GTPasi che è stata invertita legando His-tagged Fis1 o GFP ai liposomi. È stata osservata una sinergia tra Mff e cardiolipina poiché l'attività GTPasi di Drp1 è stata stimolata di 2,6 volte quando è stata incubata con SL/CL decorata con Mff. Quando i modelli SL/PE/CL sono stati decorati con Mff, l'attività di Drp1 è stata migliorata.

La capacità di Drp1 di rimodellare i liposomi in tubuli lipidici è stata migliorata dall'aggiunta di PE ai liposomi dello scaffold. Una volta padroneggiati, questi scaffold possono essere preparati e utilizzati in poche ore se la procedura viene eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi di interazione tra proteine e lipidi come la sedimentazione e i saggi di diffusione della luce per caratterizzare le interazioni funzionali.

L'applicazione di questa tecnica consente alle persone che esaminano la traslocazione delle proteine in una membrana biologica definita di esplorare le interazioni proteiche transitorie e l'impatto di specifici cofattori lipidici nella formazione e stabilizzazione di assemblaggi cellulari essenziali.