Name: Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-11T12:30:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Scopri come ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimali in vitro utilizzando impalcature liposomiali. Questa tecnica consente di studiare la dinamica mitocondriale e il ruolo dei lipidi accessori.

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Gli autori desiderano riconoscere il finanziamento ricevuto dall'American Heart Association (SDG12SDG9130039).

1. Ponteggio liposomi Preparazione NOTA: Idealmente, esperimenti iniziali dovrebbe usare un&#39;impalcatura relativamente semplice e informe (composto da DOPC (1,2-dioleoyl- SN -glycero-3-phosphocholine o PC) e DGS-NTA (Ni 2+) (1,2-dioleoyl - sn -glycero-3 - [(N - (5-ammino-1-carbossipentil) acido imminodiacetico) succinil]. (nickel sale)) Edificio fuori di questi esperimenti, carica lipidi, flessibilità e curvatura può essere introdotto come singoli fattori con il potenziale per alterare le interazioni membrana-prossimale. Queste modifiche possono essere realizzati aggiungendo quantità definite di specifici componenti lipidici, inclusi fosfatidilserina o cardiolipina (CL), fosfatidiletanolammina (DOPE o PE), o galactosyl ceramide (β). <ol><li> Combinare lipidi disciolti in cloroformio in una provetta di vetro pulito. Evaporare il solvente con azoto secco, mentre la rotazione del tubo per formare un sottile film lipidico. Rimuovere solvente residuo con una centrifugal evaporatore per 1 ora a 37 ° C. NOTA: Varie formulazioni di liposomi vengono utilizzati nei protocolli di seguito descritto: liposomi ponteggi (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 96,7 mol% DOPC), liposomi ponteggi con cardiolipina (3,3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10 mol% cardiolipina / 86,7 mol% DOPC), liposomi ponteggio flessibili con cardiolipina (3.3 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 10% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 51,7 mol% DOPC), e impalcatura arricchito liposomi (10 mol% DGS-NTA (Ni 2+) / 15% mol cardiolipina / 35 mol% DOPE / 40 mol% DOPC). </li><li> Aggiungere tampone A (25 mM HEPES (4- (2-idrossietil) -1-acido piperazineethanesulfonic), 150 mM KCl, pH regolato a 7,5 con KOH) preriscaldato a 37 ° C in modo che la concentrazione di lipidi finale 1 - 2 mM. Incubare 30 minuti a 37 ° C con vortex occasionale per risospendere completamente la miscela lipidica (Figura 1a). </li><li> Trasferire in una provetta di plastica, porre il tubo in azoto liquido fino a completo congelamento (roughly 30 s), e posto in un bagno d&#39;acqua C 37 ° fino a quando completamente scongelati (circa 1 - 2 min). Ripetere per un totale di 4 cicli di gelo-disgelo (Figura 1B). </li><li> Preparare un estrusore lipidico immergendo 4 supporti del filtro e un filtro di policarbonato in tampone e assemblare l&#39;estrusore secondo le istruzioni del produttore. Estrudere la soluzione lipidica attraverso il filtro 21 volte. Utilizzare dolce, pressione costante per garantire una distribuzione di dimensione omogenea (Figura 1c). NOTA: Per tutti gli esperimenti descritti in questo protocollo, un filtro 1,0 micron in policarbonato è stato utilizzato per l&#39;estrusione. Interazione DRP1 con lipidi anionici può essere osservata con una varietà di diametri di liposomi che variano da 50 nm a 400 nm 12 o superiore 13. Quindi, la dimensione del filtro di 1 micron è stato scelto per essere ideale sia GTPasi attività e per la microscopia elettronica. Se altri diametri di liposomi sono desiderati, preparazione dei giganti vescicole unilamellari 14,15 (GUVs) o piccolo unilamellar vescicole 16 (SUV) può essere utilizzato. Diffusione della luce dinamica può essere utilizzato per valutare l&#39;eterogeneità liposomi dimensioni 13. </li><li> Conservare liposomi estrusi a 4 ° C e scartare dopo 3-5 d. </li></ol> 2. L&#39;utilizzo di ponteggi liposomi per la Proteina Analisi Binding <ol><li> Preparazione del campione <ol><li> Incubare His-tag MffΔTM (5 micron finale) con liposomi ponteggi (40 mol% PC / 35 mol% PE / 15 mol% CL / 10 mol% DGS-NTA (Ni 2+); 50 um finale) per almeno 15 min a RT in tampone a + BME (25 mM HEPES, 150 mM KCl, 10 mM β-mercaptoetanolo (BME), pH regolato a 7,5 con KOH). Per un controllo QFP-libera, incubare liposomi con il suo tag-proteina di controllo (come la GFP) per legare e scudo esposto NTA (Ni 2+). NOTA: MffΔTM è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio 2. GFP è stato purificato in modo analogo, ma il passo di scambio ionico è stato omesso. BME è stato richiesto per questi experiments perché DRP1 è sensibile all&#39;ossidazione, che possono modificare le sue proprietà di attività e di assemblaggio. </li><li> Aggiungere DRP1 (2 mM finale) e incubare per 1 ora a temperatura ambiente. NOTA: DRP1 è stato espresso e purificato come descritto in un precedente studio 2. Dopo incubazione con DRP1, l&#39;effetto vincolante per deformazione della membrana nucleotide può essere studiata incubando un&#39;altra ora con 2 mM MgCl 2 e sia 1 mM GTP, 1 mM GMP-PCP, o tampone A + BME. </li></ol></li><li> Negativo Stain microscopia elettronica a trasmissione (EM) Analisi <ol><li> Transfer 5 microlitri di campione ad un foglio di pellicola di laboratorio, e stabilire una griglia Cu / Rh carbonio rivestito sul campione. Incubare la griglia 1 min sul campione, cancellare via il liquido in eccesso su carta da filtro, e trasferire ad un calo del 2% acetato di uranile. Incubare 1 min, tamponare l&#39;eccesso macchia sulla carta da filtro, e trasferire a una casella della griglia. Conservare sotto vuoto O / N per garantire la piena essiccazione. </li><li> campioni di immagine utilizzando un microsc elettronico a trasmissioneope a 18.500 - 30,000X ingrandimento per osservare i cambiamenti ultrastrutturali di proteine e di liposomi morfologie 17. Nota: le modifiche ultrastrutturali possono essere quantificati utilizzando immagine software di analisi, come ad esempio ImageJ 13 (http://imagej.nih.gov/ij/). decorazione di proteine ​​può essere misurata se confrontato con i modelli di lipidi nudi. Inoltre, i diametri dei segmenti tubolari possono essere misurati dalla porzione più esterna dei complessi 13. Un&#39;analisi più dettagliata può essere effettuata utilizzando crio-microscopia elettronica 17. Questo metodo può essere usato per immagini complessi proteina-lipidi nativi in ​​solvente senza l&#39;uso di coloranti metalli pesanti che rivestono il campione. In questo modo, le caratteristiche strutturali dettagliate non apparenti macchia negativo, inclusi i cambiamenti nella morfologia dei lipidi di fondo, possono essere esaminate e quantificati. </li></ol></li></ol> 3. L&#39;uso del ponteggio liposomi per enzimatica Assay Nota: A colorisaggio GTPase metrica 18 è stato utilizzato per misurare la liberazione di fosfato tramite GTP idrolisi. Saggi GTPasi alternativi sono disponibili 19 e possono essere implementati in base alle esigenze. <ol><li> Incubare His-tag MffΔTM (QFP), Fis1ΔTM (Fis1), o GFP (5 micron finale per tutti) con liposomi ponteggio (150 micron finali) per 15 minuti a temperatura ambiente in tampone A + BME (volume = 30 ml). Aggiungere DRP1 (500 nM finale) e incubare un ulteriore 15 minuti a temperatura ambiente (volume = 80 ml). NOTA: Fis1 è stato purificato in modo analogo a MFF 2, ma la fase di cromatografia a scambio ionico è stato omesso. Lo scopo della sua tag-GFP è quello di proteggere il NTA (Ni 2+) headgroups e prevenire le interazioni di carica non specifiche con altre proteine. Se nessun effetto si osserva in assenza di GFP, allora questo controllo può non essere necessaria. Alternativi proteine ​​bloccaggio (di dimensioni paragonabili alla proteina di interesse) possono essere usati pure, ma GFP permette la visualizzazione diretta delle interazioni con scafpiegare liposomi. </li><li> Tubi Trasferire un termociclatore impostato a 37 ° C, e avviare le reazioni di aggiunta di GTP e MgCl 2 (1 mM e 2 mM finale, rispettivamente; volume = 120 ml). </li><li> A intervalli di tempo desiderati (cioè T = 5, 10, 20, 40, 60 min), trasferire 20 microlitri di reazione nei pozzetti della micropiastra contenente 5 ml di 0,5 M EDTA per chelare Mg 2+ e fermare la reazione. </li><li> Preparare una serie di standard di fosfato diluendo KH 2 PO 4 in tampone A + BME per calibrare i risultati. Un utile set di standard è 100, 80, 60, 40, 20, 10, 5 e 0 pM. Aggiungere 20 ml di ciascuno per pozzetti contenenti 5 ml di 0,5 M EDTA. </li><li> Aggiungere 150 ml di malachite verde reagente (1 mm di malachite verde carbinolo, 10 mM ammonio molibdato tetraidrato, e 1 N HCl) in ogni pozzetto, e leggere OD 650 5 min dopo l&#39;aggiunta. NOTA: GTP è acido labile e si idrolizzano in presenza di reagente verde malachite. Assicurarsi che tha il tempo tra l&#39;aggiunta del reagente di malachite e la lettura è costante per garantire la riproducibilità dei risultati. </li><li> Generare una curva standard tracciando OD 650 degli standard in funzione della concentrazione di fosfato. Utilizzare la regressione lineare per determinare la relazione tra OD 650 e la concentrazione di fosfato in un campione. </li><li> Utilizzando la regressione lineare, convertire la OD 650 dei campioni di reazione proteina mM fosfato. Determinare la velocità di generazione di fosfato per ciascuna miscela di reazione riportando concentrazione di fosfato in funzione del tempo, e convertire k cat dividendo il tasso dalla concentrazione DRP1 (0,5 mM). NOTA: Solo la velocità lineare iniziale dovrebbe essere usato per determinare la velocità di generazione di fosfato, e un minimo di 3 punti di dati deve essere utilizzato. Se la velocità di reazione è sufficientemente rapida che i primi tre punti di dati non sono lineari (cioè la r 2 del fit lineare è inferiore a 0,9) di un segnoNaturalmente tempo ificantly breve con almeno 3 punti di tempo deve essere eseguita. </li></ol>

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</ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo protocollo offre un metodo per studiare le interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine ​​integrali di membrana. Utilizzando un ponteggio liposoma modulare, investigatori sono in grado di valutare l&#39;attività di una o più proteine ​​in un ambiente lipidico-prossimale. Studi precedenti hanno dimostrato un metodo simile per gli enzimi del recettore della membrana plasmatica 24 - 26. Abbiamo ampliato questo metodo per incorporare cofattori lipidici ed esplorare le intera...

Studiare le interazioni proteina-proteina di membrana-prossimale è uno sforzo impegnativo a causa della difficoltà di ricapitolare l&#39;ambiente nativo delle proteine integrali di membrana coinvolte 1. Ciò è dovuto alla necessità di detersivo solubilizzazione e l&#39;orientamento incoerente delle proteine ​​in proteoliposomi. Per evitare questi problemi, abbiamo utilizzato una strategia quale i domini solubili di proteine integrali di membrana sono espressi come proteine di fusione His-tag, e questi frammenti solubili sono ancorati liposomi ponteggio tramite interazioni con NTA (Ni 2+) headgroups al lipide superficie. L&#39;utilizzo di questi ponteggi, interazioni proteina-lipidi prossimale possono essere indagati in un intervallo di lipidi e proteine ​​composizioni. Abbiamo effettivamente applicato questo metodo per studiare le interazioni critiche proteina-proteina che regolano il montaggio del complesso fissione mitocondriale ed esaminare le interazioni lipidi che modulano questo process 2. Durante la fissione mitocondriale, una conservata proteina rimodellamento della membrana, chiamata Dynamin-related protein 1 (DRP1) 3, viene reclutato per la superficie del mitocondriale esterna della membrana (OMM) in risposta a segnali cellulari che regolano l&#39;omeostasi energetica, segnale apoptotico, e molti altri processi mitocondriali integrali. Questo grande, GTPase citosolica viene reclutato alla superficie dei mitocondri attraverso le interazioni con proteine OMM integrali 4 - 8. Il ruolo di una tale proteina, mitocondriale fissione Factor (QFP), è stato difficile chiarire causa di una debole interazione evidente con DRP1 in vitro. Tuttavia, studi genetici hanno chiaramente dimostrato che QFP è essenziale per il successo 7,8 fissione mitocondriale. Il metodo descritto in questo manoscritto è stato in grado di superare le carenze precedenti introducendo le interazioni lipidi simultanee che promuovono le interazioni DRP1-QFP. Nel complesso, questo nuovo metodo di analisi REVEAportato interazioni fondamentali che guidano il montaggio del complesso fissione mitocondriale e ha fornito una nuova fase per gli studi strutturali e funzionali in corso di questa macchina molecolare essenziale. Fino ad oggi, l&#39;esame delle interazioni tra DRP1 e QFP sono state complicate dalla flessibilità intrinseca del QFP 9, l&#39;eterogeneità dei polimeri DRP1 2,10, e la difficoltà di purificazione e di ricostituzione full-length QFP con un dominio transmembrana intatto 11. Abbiamo affrontato queste sfide utilizzando liposomi NTA (Ni 2+) ponteggio per ricostituire His-tag QFP manca il suo dominio transmembrana (MffΔTM-His 6). Questa strategia è stata vantaggioso perché MffΔTM era estremamente solubile quando sovra-espresso in E. coli, e questa proteina isolata è stato facilmente ricostituiti in liposomi patibolo. Quando legato a questi modelli di lipidi, MFF ha assunto un identico, rivolto verso l&#39;esterno orientamento sulla superficie della membrana.Oltre a questi vantaggi, lipidi mitocondriali, come cardiolipina, sono stati aggiunti per stabilizzare QFP piegatura e di associazione con la membrana 11. Cardiolipin interagisce anche con il dominio variabile della DRP1 2,12 che può stabilizzare questa regione disordinato e facilitare il montaggio della macchina fissione. Questo metodo robusto è ampiamente applicabile per gli studi futuri che cercano di valutare le interazioni delle proteine ​​di membrana-prossimale. Attraverso l&#39;uso di ulteriori interazioni tethering / affinità, la sofisticazione di questi studi ricostituzione membrana può essere migliorato per imitare ulteriori complessità trovato alla superficie delle membrane all&#39;interno delle cellule. Allo stesso tempo, composizioni lipidiche possono essere modificati per imitare più accuratamente gli ambienti nativi di questi complessi macromolecolari. In sintesi, questo metodo fornisce un mezzo per esaminare i relativi contributi di proteine ​​e lipidi nel plasmare morfologie membrana a durante proc cellulare criticaesses.

<table><tbody><tr><td>Fosfatidilcolina (DOPC)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>Fosfatidiletanolammina (DOPE)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>850725</td><td></td></tr><tr><td>DGS-NTA(Ni2+)Avanti</td> <td>Polar Lipids</td><td>790404</td><td></td></tr><tr><td>Bovine Heart Cardiolipina (CL)</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840012</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformio</td><td>Acros Organics</td><td></td><td></td>268320010</tr><tr><td>Estrusore di liposomi</td><td>Avanti Lipidi polari</td><td>610023</td><td></td></tr><tr><td>Cu/Rh Griglie di colorazione negative</td><td>Ted Pella</td><td>79712</td><td></td></tr><tr><td>Tubo per microfuga</td><td>Beckman</td><td>357448</td><td></td></tr><tr><td>GTP</td><td>Jena Biosciences</td><td>NU-1012</td><td></td></tr><tr><td>GMP-PCP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M3509</td><td></td></tr><tr><td>Strisce per piastre per microtitolazione</td><td>Thermo Scientific</td><td>469949</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Acros Organics</td><td>40993-0010</td><td></td></tr><tr><td>Colorante Coomassie blu istantaneo</td><td>Expedeon</td><td>ISB1L</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP310</td><td></td></tr><tr><td>BME</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M6250</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>P330</td><td></td></tr><tr><td>KOH</td><td>Fisher Scientific</td><td>P250</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro di magnesio</td><td>Acros Organics</td><td>223211000</td><td></td></tr><tr><td>4 - 20% SDS-PAGE Gel</td><td>Bio Rad</td><td>456-1096</td><td></td></tr><tr><td>4x Laemmli Caricamento colorante</td><td>Bio Rad</td><td>161-0747</td><td></td></tr><tr><td>HCL</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S</td><td></td></tr><tr><td>Malachite Carbinolo verde</td><td>Sigma</td><td>Aldrich 229105</td><td></td></tr><tr><td>Molibdato di ammonio Tetraidrato</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7302</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola da laboratorio</td><td>Parafilm</td><td>PM-996</td><td></td></tr><tr><td>Acetato di uranile</td><td>Polysciences</td><td>21447</td><td></td></tr><tr><td>Tecnai T12 100 keV Microscopio</td><td>FEI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optima MAX</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>TLA-55 Rotore</td><td>Beckman</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Refrigerato CentriVap Concentratore</td><td>Labconico</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mastercycler Pro Thermocycler</td><td>Eppendorf</td><td></td><td></td></tr><tr><td>VersaMax Lettore di micropiastre</td><td>Molecular Devices</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale in vitro

Using Scaffold Liposomes to Reconstitute Lipid-proximal Protein-protein Interactions In Vitro

Studi di proteine integrali di membrana in vitro sono spesso complicata dalla presenza di un dominio transmembrana idrofobico. A complicare ulteriormente questi studi, reintegrazione delle proteine ​​di membrana detergente-solubilizzato in liposomi è un processo stocastico in cui topologia di proteine ​​è impossibile da far rispettare. Questo articolo offre un metodo alternativo per queste tecniche impegnative che utilizza un ponteggio a base di liposomi. Protein solubilità è esaltata dalla delezione del dominio transmembrana, e questi amminoacidi sono sostituiti con un residuo tethering, ad esempio un His-tag. Questo tether interagisce con un gruppo di ancoraggio (Ni 2+ coordinato da acido nitrilotriacetico (NTA (Ni 2+)) per His-tag proteine), che impone una topologia proteine uniforme sulla superficie del liposoma. Un esempio è presentato in cui l&#39;interazione tra proteine ​​Dynamin legati 1 (DRP1) con una proteina integrale di membrana, mitocondriale fissione Factor (QFP), era investigated utilizzando questo metodo impalcatura liposomi. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di QFP di reclutare in modo efficiente DRP1 solubile alla superficie dei liposomi, che ha stimolato la sua attività GTPasi. Inoltre, DRP1 era in grado di tubulate il modello di lipidi MFF-decorato in presenza di lipidi specifici. Questo esempio dimostra l&#39;efficacia di liposomi impalcature utilizzando saggi strutturali e funzionali e mette in evidenza il ruolo del QFP nella regolazione dell&#39;attività DRP1.

Mentre l'interazione tra DRP1 e QFP ha dimostrato di essere importante per fissione mitocondriale, questa interazione è stato difficile ricapitolare in vitro. Il nostro obiettivo era quello di emulare meglio l'ambiente cellulare in cui DRP1 e del QFP interagiscono. A tal fine, liposomi contenenti concentrazioni limitanti del NTA (Ni 2+) headgroups sono stati preparati mediante reidratazione un film lipidico come descritto sopra. La soluzione lipidica inizialmente cost...

Questo articolo descrive un metodo per valutare le interazioni e gli assemblaggi di proteine integrali di membrana in vitro con vari fattori partner in un ambiente lipidico-prossimale.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro

Studies of integral membrane proteins in vitro are frequently complicated by the presence of a hydrophobic transmembrane domain. Further complicating ...

L'obiettivo generale di questa tecnica è quello di catturare le interazioni lipidico-proteina prossimale in vitro. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande nel campo della dinamica mitocondriale, come ad esempio come le interazioni proteina-proteina nella membrana esterna mitocondriale possono essere influenzate dai lipidi accessori. Il vantaggio principale di questa tecnica è che il collegamento dei domini proteici solubili ai modelli lipidici garantisce che sia possibile ottenere una conferma più nativa.Inoltre, le complesse interazioni tra proteine solubili e i loro partner legati possono essere valutate in presenza di cofattori lipidici definiti. Sebbene utilizziamo questo metodo per studiare le interazioni proteiche nel macchinario di fissione mitocondriale, può anche essere applicato ad altri complessi proteici che si localizzano in diversi compartimenti di membrana. A dimostrare questa procedura sarà Ryan, uno studente laureato del mio laboratorio.Innanzitutto, combina le soluzioni di cloroformio dei lipidi desiderati in una provetta di vetro pulita. Far evaporare il solvente con azoto gassoso secco mentre si ruota il tubo per formare un sottile film lipidico. Quindi rimuovere il solvente residuo con l'evaporatore centrifugo per un'ora a 37 gradi Celsius.Successivamente, aggiungere il tampone A preriscaldato per ottenere una concentrazione lipidica finale di uno o due millimolari. Incubare per 30 minuti a 37 gradi Celsius con vortici occasionali per risospendere completamente la miscela lipidica. Dopo l'incubazione, trasferire la miscela lipidica in una provetta di plastica e immergerla in azoto liquido per circa 30 secondi fino a quando non sarà completamente congelata.Quindi posizionare il tubo in un bagnomaria a 37 gradi Celsius per uno o due minuti fino a quando non sarà completamente scongelato. Successivamente, preparare un estrusore lipidico immergendo quattro supporti filtranti e un filtro in policarbonato nel tampone A e assemblando l'estrusore secondo le istruzioni del produttore. Estrudere la soluzione lipidica attraverso il filtro 21 volte utilizzando una leggera pressione costante per garantire una distribuzione granulometrica omogenea.Durante l'estrusione, utilizzare una pressione lenta e costante per garantire l'omogeneità delle dimensioni dei liposomi. Con un filtro da un micron, questo è meno importante. Ma con filtri di dimensioni più piccole, può introdurre un'eterogeneità più apparente.Conservare i liposomi estrusi a quattro gradi Celsius. Incubare il fattore di fissione mitocondriale marcato con His-taged o Mff con liposomi scaffold per almeno 15 minuti a temperatura ambiente nel tampone A e BME. Per un controllo senza Mff, incubare i liposomi con una proteina di controllo marcata con His, come la GFP, per legare e schermare il nichel-NTA esposto.Aggiungere la proteina uno correlata alla dinamina o Drp1 alla miscela di liposomi e incubare per un'ora a temperatura ambiente. Quindi, trasferire cinque microlitri di campione su un foglio di pellicola da laboratorio e stendere una griglia di rame-rodio rivestita di carbonio sopra il campione. Dopo aver incubato per un minuto, rimuovere il liquido in eccesso con carta da filtro e aggiungere una goccia di acetato di uranile al 2%.Dopo l'incubazione per un altro minuto, rimuovere la macchia in eccesso con carta da filtro e trasferire il campione in una scatola a griglia. Il giorno seguente, eseguire l'imaging dei campioni utilizzando un microscopio elettronico a trasmissione con un ingrandimento compreso tra 18, 500 e 30, 000X per osservare i cambiamenti ultrastrutturali nelle morfologie delle proteine e dei liposomi. Incubare Mff e Fis1 marcati con His-tagging con i liposomi dello scaffold per 15 minuti a temperatura ambiente nel tampone A e BME.Aggiungere Drp1 e incubare ogni miscela per altri 15 minuti a temperatura ambiente. Trasferire le provette al termociclatore impostato a 37 gradi Celsius e avviare le reazioni aggiungendo GTP e cloruro di magnesio. Al momento desiderato, trasferire 20 microlitri di ciascuna miscela di reazione nei pozzetti di una piastra per microtitolazione contenente cinque microlitri di EDTA 0,5 molari per chelare il magnesio e fermare la reazione.Successivamente, preparare una serie di standard di fosfato diluendo il fosfato di potassio nel tampone A e BME per calibrare i risultati. Aggiungere 20 microlitri di ogni standard ai pozzetti contenenti cinque microlitri di EDTA 0,5 molari. Aggiungere 150 microlitri di reagente verde malachite in ogni pozzetto.Infine, leggere l'OD 650 cinque minuti dopo ogni aggiunta. Il GTP si idrolizza lentamente in presenza del reagente verde malachite acido. Pertanto, questo reagente deve essere aggiunto a tutti i pozzetti del campione entro 10 minuti dalla misurazione dell'assorbanza per massimizzare il rapporto segnale/rumore.In assenza di Drp1, né Mff né GFP hanno provocato la deformazione della membrana. E solo liposomi privi di caratteristiche sono stati osservati per i liposomi di scaffold arricchiti decorati con GFP o ESL. Tuttavia, quando Drp1 è stato aggiunto ai modelli ESL decorati con Mff, il rimodellamento dei liposomi è stato evidente.Decorazione della SL con attività GTPasi migliorata da Mff. Al contrario, quando i gruppi di testa NTA esposti sono stati bloccati con GFP marcata con His, questa attività GTPasi aumentata è stata ablata. Anche il legame di Fis1, privo del suo dominio transmembrana con il SL, non è riuscito a suscitare una stimolazione dell'attività GTPasi di Drp1.Analogamente alla SL, l'aggiunta di SL/Cl a Drp1 ha provocato una leggera stimolazione dell'attività della GTPasi che è stata invertita legando His-tagged Fis1 o GFP ai liposomi. È stata osservata una sinergia tra Mff e cardiolipina poiché l'attività GTPasi di Drp1 è stata stimolata di 2,6 volte quando è stata incubata con SL/CL decorata con Mff. Quando i modelli SL/PE/CL sono stati decorati con Mff, l'attività di Drp1 è stata migliorata.La capacità di Drp1 di rimodellare i liposomi in tubuli lipidici è stata migliorata dall'aggiunta di PE ai liposomi dello scaffold. Una volta padroneggiati, questi scaffold possono essere preparati e utilizzati in poche ore se la procedura viene eseguita correttamente. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi di interazione tra proteine e lipidi come la sedimentazione e i saggi di diffusione della luce per caratterizzare le interazioni funzionali.L'applicazione di questa tecnica consente alle persone che esaminano la traslocazione delle proteine in una membrana biologica definita di esplorare le interazioni proteiche transitorie e l'impatto di specifici cofattori lipidici nella formazione e stabilizzazione di assemblaggi cellulari essenziali.

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Biochimica

Per verificare l'interazione di una proteina con la sua lipidi obiettivo abbiamo utilizzato MACS e sfere magnetiche annessina V-coniugati e vescicole lipidiche sintetizzato dal lipidi target e annessina V-binding fosfatidilserina. Le proteine ​​legate alla lipidi target sono co-purificati e analizzati dopo eluizione dal perline.

Vescicole lipidiche-mediata Cromatografia di affinità mediante Magnetic separazione delle cellule attivate (LIMACS): un nuovo metodo per l&#39;analisi delle interazioni proteina-lipide

Qui, vi presentiamo un protocollo per rilevare, eventi di fusione singoli SNARE-mediata tra liposomi e bistrati supportati in canali microfluidica utilizzando TIRFM polarizzata, con sensibilità singola molecola e ~ 15 risoluzione temporale msec. Lipidi e il rilascio del carico solubili possono essere rilevati simultaneamente. dimensioni liposomi, diffusività dei lipidi, e poro di fusione proprietà sono misurate.

Fusion SNARE-mediata del singolo proteoliposomi con bilayers Tethered supportati in una cella di flusso Microfluidic monitorati da polarizzata microscopia TIRF

Qui presentiamo due protocolli ultraveloce per la ricostituzione delle proteine di membrana in fusogena proteoliposomi e la fusione di tali proteoliposomi con lipidici di destinazione per la consegna senza detersivo di queste proteine di membrana nel bilayer del postfusion. La combinazione di questi approcci consente montaggio veloce e facile da controllare di sistemi complessi multi-componente della membrana.

Privo di detersivo ultraveloce ricostituzione delle proteine di membrana in lipidici utilizzando fusogena proteoliposomi complementari a carico.

Forniamo un protocollo per in vitro test di auto-organizzazione della mente e la mia su un doppio strato lipidico supportati in una camera aperta. Inoltre, descriviamo come racchiudere il dosaggio del lipido-clad PDMS microcompartments per simulare condizioni in vivo di confinamento di reazione.

In Vitro Ricostituzione di Self-Organizing pattern proteico su lipidici supportati

La fusione biologica della membrana è catalizzata da proteine di fusione specializzate. Misurare le proprietà fusogene delle proteine può essere ottenuto mescolando saggi. Vi presentiamo un metodo per purificare la Drosophila ricombinante atlastina, una proteina che media la fusione omotipica del ER, riconformandola in liposomi preformati e testando la capacità di fusione.

Ricostituzione assistita da detergenti della Drosophila ricombinante Atlastin in Liposomi per i saggi che mescolano i lipidi

La fusione mitocondriale è un'importante reazione omeostatica alla base delle dinamiche mitocondriali. Descritto qui è un sistema di ricostituzione in vitro per studiare la fusione mitocondriale interno-membrana che può risolvere il tethering della membrana, docking, emifusione, e l'apertura pore. Viene discussa la versatilità di questo approccio nell'esplorazione dei sistemi a membrana cellulare.

Una piattaforma di membrana modello per la ricostituzione delle dinamiche della membrana mitocondriale

Questo protocollo descrive un metodo efficiente privo di cellule per la produzione di proteoliosomi di alta qualità mediante metodo di dialisi a doppio strato utilizzando un sistema privo di cellule di grano e liposomi. Questo metodo fornisce mezzi adeguati per l'analisi funzionale delle proteine di membrana, lo screening dei bersagli farmacologici e lo sviluppo di anticorpi.

Produzione cell-free di proteoliposomi per l'analisi funzionale e lo sviluppo di anticorpi mirati alle proteine di membrana

Questo protocollo descrive la formazione di vescicole unilipidiche e multilipidiche, doppi strati lipidici supportati e doppi strati lipidici sospesi. Questi modelli in vitro possono essere adattati per incorporare una varietà di tipi di lipidi e possono essere utilizzati per studiare varie interazioni molecolari e macromolecole.

Assemblaggio di modelli di doppio strato lipidico supportati e sospesi per lo studio delle interazioni molecolari

In questo manoscritto, dimostriamo le tecniche sperimentali per incapsulare il citoscheletro F-actina in vescicole lipidiche unilamellari giganti (chiamate anche liposomi) e il metodo per formare uno strato di F-actina che imita la corteccia nel foglietto interno della membrana liposomiale.

In vitro Ricostituzione del citoscheletro di actina all'interno di vescicole unilamellari giganti

Questo articolo introduce una semplice ricostituzione one-pot di reti citoscheletriche all'interno di vescicole giganti separate in fase. Il metodo può essere generalizzato e applicato all'incapsulamento o al confinamento di un'ampia gamma di biomolecole.

In vitro Ricostituzione di reti citoscheletriche all'interno di vescicole unilamellari giganti separate di fase (GUV)

Scopri come ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimali in vitro utilizzando impalcature liposomiali. Questa tecnica consente di studiare la dinamica mitocondriale e il ruolo dei lipidi accessori.

Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale In Vitro

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