3D Whole-cuore Analisi tessuto miocardico

Narratore}L'obiettivo generale di questo protocollo è quello di facilitare un metodo strutturato e riproducibile per l'elaborazione 3D del tessuto cardiaco intero che può essere utilizzato per valutare l'accuratezza del targeting delle iniezioni intramiocardiche nella zona di confine dell'infarto. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della medicina cardiorigenerativa, come lo sviluppo della pratica e l'ottimizzazione delle tecniche di iniezione. Il vantaggio principale di questa tecnica è che offre un metodo standardizzato e riproducibile per l'elaborazione 3D del tessuto cardiaco intero.

Le implicazioni di questa tecnica si estendono allo sviluppo di terapie rigenerative cardiache e alla convalida dell'accuratezza dell'iniezione delle normali tecniche di somministrazione. Lo scopo di questa terapia con cellule staminali cardiache è quello di iniettare cellule nella zona di confine dell'infarto per la stimolazione della vasculogenesi locale e la protezione dei cardiomiociti. Catturare il cuore nella fase telediastolica richiede pratica e pazienza.

Una dimostrazione visiva di questi passaggi è fondamentale. Inizia separando il pericardio dal cuore iniettato con microsfere, mantenendo intatti gli atri e i ventricoli. Quando tutto il tessuto è stato rimosso, usa le forbici di Klinkenberg per sezionare l'aorta ascendente a circa un centimetro sopra la valvola aortica e taglia le vene inferiori cavali e polmonari a circa un centimetro dall'atrio.

Dopo aver fissato l'apice del cuore sul fondo del contenitore di plastica per evitare il galleggiamento, posizionare 2-0 punti di sutura attraverso la parte rimanente dell'aorta fino ai bordi del contenitore e fissare il cuore. Fare attenzione che il cuore sia centrato e non tocchi le pareti del contenitore. Quando l'organo è stato fissato in una geometria simile a quella dell'estremità diastolica, utilizzare pinze per zanzare per afferrare la vena cavale inferiore e utilizzare una siringa da 50 millilitri per iniettare lentamente l'agar appena preparato da 50 a 60 gradi Celsius nell'atrio destro attraverso la vena cavale superiore fino a quando sia l'atrio destro che il ventricolo sono completamente riempiti.

Per ottenere un cuore incorporato che assomigli il più possibile alla geometria telediastolica, fissare l'apice del ventricolo sinistro sul fondo del contenitore e riempire il ventricolo destro con agar mentre le vene polmonari sono bloccate. Successivamente, posizionare una pinza antizanzare sulle vene polmonari e passare delicatamente una nuova siringa da 50 millilitri riempita di agar in direzione retrograda attraverso le valvole aortiche. Iniettare lentamente la soluzione nel ventricolo sinistro fino a quando il ventricolo e l'atrio sinistro sono completamente pieni, bloccando l'aorta una volta che il ventricolo sinistro è stato riempito.

Ora, versare l'agar rimanente nel contenitore fino a coprire completamente il cuore e posizionare due tubi di plastica rigida all'interno del contenitore di inclusione che fungono da strutture di riferimento durante la registrazione dell'immagine. Quindi posizionare il cuore a una temperatura compresa tra due e sette gradi Celsius per almeno quattro ore per solidificare l'agar. Dopo la risonanza magnetica, capovolgere il contenitore e lasciare che l'aria tra l'agar e i lati del contenitore rimuova la soluzione solida di agar e il cuore dal contenitore.

Rimuovere le aste di plastica. Quindi utilizzare un'affettatrice per sezionare il blocco di agar e il cuore in fette di cinque millimetri dall'apice alla base del cuore, tagliando parallelamente al fondo del blocco di agar per mantenere l'angolazione delle fette uguale a quella delle immagini di risonanza magnetica acquisite. Quando tutte le fette sono state ottenute, colorare i campioni di tessuto in TTC.

Dopo 15 minuti, fotografare le fette su entrambi i lati con un angolo perpendicolare, quindi sciacquare accuratamente le sezioni con soluzione fisiologica allo 0,9%. Per visualizzare i campioni mediante microscopia a fluorescenza, selezionare l'imaging in modalità fluorescenza sullo scanner a modalità variabile e impostare la dimensione dei pixel su 100 x 100 micron. Per il primo blocco di filtri, selezionare un filtro passa-banda che si sovrapponga alla lunghezza d'onda di emissione della fluorescenza a microsfere nel canale uno, quindi al filtro passa-banda per il secondo blocco di filtri al di fuori della lunghezza d'onda di emissione nel canale due.

Quindi, selezionare il blocco filtro appropriato, impostare il tubo fotomoltiplicatore sulla tensione appropriata e il laser di eccitazione sulla lunghezza d'onda di eccitazione più vicina a quella delle microsfere iniettate. Dopo che tutte le immagini sono state ottenute, nell'appropriato software di post-elaborazione, segmentare il miocardio e i bordi del ventricolo sinistro endo-epicardico nelle immagini di risonanza magnetica, seguiti da una segmentazione simile del miocardio e dei siti di iniezione nelle immagini a fluorescenza. Quindi interpola linearmente i segmenti registrati dell'immagine da entrambi i lati delle fette per ricostruire lo spessore del campione originale e creare un modello 3D dei dati.

Con il cuore fissato in una geometria simile a quella diastolica finale, come appena dimostrato, in questo esperimento rappresentativo, l'agar ha aderito con successo al tessuto cardiaco consentendo di affettare il tessuto all'angolazione desiderata con uguali spessori di fetta. Sia nella fluorescenza 2D che nella risonanza magnetica, la cicatrice e i siti di iniezione sono chiaramente distinti. Le immagini di tessuto colorato TTC e di risonanza magnetica potenziata con gadolinio tardivo forniscono un controllo per la valutazione della cicatrice nell'imaging a fluorescenza.

L'imaging post-elaborazione consente la ricostruzione della geometria 3D del cuore ex vivo sulla base delle segmentazioni e delle immagini a fluorescenza, consentendo di valutare l'accuratezza dell'iniezione 3D. In questo studio, le deposizioni di iniezione e la zona di confine dell'infarto sono state protette sulla parete endocardica e sono state misurate le distanze tra le proiezioni sulla superficie endocardica. Dopo questa procedura, possono essere eseguiti altri metodi come una valutazione chirurgica, la quantificazione delle dimensioni dell'infarto o la convalida di altre modalità di imaging tridimensionale.

Abbiamo utilizzato questa tecnica per valutare l'accuratezza dell'iniezione nella zona di confine dell'infarto. Questa ricerca è stata condotta per migliorare la terapia cardiorigenerativa per l'insufficienza cardiaca. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come preparare il cuore, come incorporare ed elaborare il tessuto cardiaco e come eseguire l'imaging a fluorescenza di campioni di tessuto cardiaco.