Name: Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-12-28T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 57 s
Description: Scopri come allevare Dermestes maculatus e applicare l'RNAi embrionale e parentale per studiare la funzione genica. Questo metodo innovativo permette di analizzare fenotipi e sviluppare nuovi modelli entomologici.

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Ringraziamo i dottori Alison Heffer e Yong Lu per aver creato l'apparato di microiniezione e aver condiviso la loro inestimabile conoscenza ed esperienza con l'RNAi degli insetti. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (da R01GM113230 a L.P.).

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Mentre un piccolo numero di sistemi modello sofisticati (topi, mosche, vermi) sono stati sviluppati nel corso del 20 ° secolo, il 21 ° secolo ha visto un&#39;ondata di nuovi sistemi di animali in fase di sviluppo nei laboratori di tutto il mondo. Questi nuovi sistemi consentono agli scienziati di affrontare comparativi, domande evolutive che non può essere sondato utilizzando solo gli &#39;standard&#39; sistemi modello. Questa distribuzione di nuovi modelli richiede il rapido sviluppo di metodi per...

Nel 1998, Fuoco e Mello hanno riferito che a doppio filamento di RNA (dsRNA) può indurre inibizione della funzione del gene in Caenorhabditis elegans 1. Questa risposta innescato da dsRNA è stato chiamato interferenza dell'RNA (RNAi), e tale silenziamento genico RNAi-mediata è stato segnalato per essere conservato in animali, piante e funghi 2-7. In piante e alcuni animali, funzioni RNAi sistemica, il che significa che l'effetto può diffondersi ad altre cellule / tessuti dove dsRNA non viene introdotto direttamente (rivisto nel 8-10). Gli scienziati hanno fatto uso di questo endogena risposta RNAi cellulare progettando dsRNAs di indirizzare i geni di interesse, battendo così giù la funzione del gene senza manipolare direttamente il genoma (rivisto nel 11-14). RNAi è un potente strumento per studi funzionali causa dei seguenti vantaggi. In primo luogo, anche con il minimo informazioni sequenza del gene, un gene può essere mirata utilizzando RNAi. Ciò è particolarmente importante per studies di organismi non-modello privi di dati genomici e trascrittomica. In secondo luogo, negli organismi dove la risposta RNAi è robusta sistemica RNAi mediata knockdown gene può essere effettuata in quasi ogni stadio di sviluppo. Questa funzione è molto utile per studiare la funzione dei geni pleiotropici. In terzo luogo, in alcuni casi, effetti RNAi diffuso ai gonadi e discendenti, in modo tale che i fenotipi si osservano nella prole 15,16. Questo fenomeno, noto come genitori RNAi (pRNAi), è particolarmente vantaggioso per i geni che influenzano lo sviluppo embrionale, come numerosa prole prodotta da un solo genitore iniettato può essere esaminato, senza manipolazione diretta di uova. Per queste ragioni, pRNAi è il metodo di scelta. Tuttavia, se pRNAi è inefficace, ad esempio per i geni necessari per la oogenesi, allora embrionale RNAi (eRNAi) deve essere utilizzato. Quarto, RNAi può essere utilizzato per generare l'equivalente di una serie allelica dal fatto che la quantità di dsRNA consegnato può essere variata su un intervallo di produrre debole per difetti forti. Tale gradazione di fenotipi può essere utile per comprendere la funzione del gene quando il gene è coinvolto in un processo complesso e / o completa perdita di funzione è letale. In quinto luogo, la consegna di dsRNA è generalmente facile e fattibile, soprattutto negli animali che mostrano solide risposte RNAi sistemiche. dsRNA può essere introdotto da microiniezione 1,5, alimentazione / ingestione 17,18, ammollo, 19,20 e il virus / batteri-mediata consegna 21,22. Sesto, a differenza di alcuni metodi di targeting / modifica dei geni, non vi è alcuna necessità di screening per gli organismi che trasportano la mutazione o di effettuare incroci genetici per generare omozigoti quando si usa RNAi. Pertanto, rispetto a molte altre tecniche per studiare la funzione del gene, RNAi è veloce, poco costoso, e può essere applicato per schermi di grandi dimensioni 23-25. L'ampio programma di utilità di RNAi fornisce i mezzi per effettuare studi funzionali in una vasta gamma di organismi, ampliando la gamma di specie disponibili per lo studio beyond i sistemi modello tradizionali per i quali sono stati sviluppati strumenti genetici. Ad esempio, gli studi che utilizzano sistemi non-modello sono tenuti a dare intuizioni l'evoluzione dei geni e reti geniche confrontando le funzioni di ortologhi da specie che rappresentano diverse modalità di sviluppo o esporre distinte caratteristiche morfologiche 26-29. Questi tipi di studi forniranno una migliore comprensione della diversità biologica, con conseguenze per la ricerca sia applicata e di base. Essendo il più grande gruppo di animali sul pianeta, gli insetti offrono una grande opportunità per esplorare i meccanismi alla base della diversità. Inoltre, gli insetti sono in genere piccole, hanno cicli di vita brevi, ad alta fecondità, e sono facili da dietro in laboratorio. Negli ultimi due decenni, RNAi è stato applicato con successo negli insetti che abbracciano gli ordini, tra cui Ditteri (vere mosche) 5, lepidotteri (farfalle e falene) 30, Coleotteri (coleotteri) 16,31, Imenotteri (sawfbugie, vespe, formiche e api) 32, Hemiptera (veri insetti), Isotteri (termiti) 34, Blattodea (scarafaggi) 35, ortotteri (grilli, cavallette, locuste e grilli) 36 e Phthiraptera (pidocchi) 37. Applicazione di successo di RNAi ha fornito dati funzionali per gli studi di patterning in embriogenesi precoce (asse anteriore-posteriore 32, dorso-ventrale asse 28, la segmentazione 26,38), determinazione del sesso, 39,40 chitina / cuticola biosintesi 41, ecdysone segnalazione 42, comportamento sociale 43, e altro ancora. Metodi RNAi sviluppati per diverse specie di insetti possono essere di ulteriore vantaggio in quanto sono suscettibili di essere utile per il controllo dei parassiti (rivisto nel 44-46). effetti RNAi saranno nonché specie-specifico gene-specifico, purché regioni non conservate sono scelti per il targeting. Per le specie di insetti utili come le api e bachi da seta, di targeting dei geni vitali per la sopravvivenza divirus o parassiti per controllare l'infezione possono fornire una nuova strategia per proteggere queste specie 47,48. Dermestes maculatus (D. maculatus), comune nome nascondere coleottero, è distribuito in tutto il mondo tranne che per l'Antartide. Come un insetto olometaboli, il ciclo di vita D. maculatus comprende embrionale, larvale, pupa, e stadi adulti (Figura 1). Perché si nutre di carne, D. maculatus è utilizzato nei musei per skeletonize animali morti e entomologi forensi può essere utilizzato per stimare momento della morte 49,50. D. maculatus si nutre di prodotti di origine animale, tra cui carcasse, carne secca, formaggio e le pupe / bozzoli di altri insetti e provoca così danni alle famiglie, alimenti conservati, e la seta, il formaggio, e industrie della carne 51,52. L'applicazione di RNAi in questo coleottero potrebbe fornire un modo efficiente ed ecologico per ridurre al minimo il suo impatto economico. Il nostro laboratorio ha utilizzato D. maculatus come nuovo model insetto per studiare la segmentazione 53. Oltre ad essere suscettibili di laboratorio allevamento, D. maculatus è di interesse per la ricerca di base in quanto è uno sviluppatore intermedio di germi, che lo rende una specie utili per studiare la transizione tra breve e di sviluppo a lungo germe. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/54976/54976fig1.jpg"> Figura 1: Ciclo di vita di D. maculatus. Fotografie di D. maculatus in diverse fasi della vita, come indicato. Il ciclo di vita da uovo ad adulto dura tre settimane a 30 ° C, ma più a lungo a temperature più basse. (A, F) embrioni appena deposte sono di colore bianco a giallo chiaro e ovali, circa 1,5 mm di lunghezza. Embriogenesi prende ~ 55 ore a 30 ° C. (B, C e G) larve hanno le strisce pigmentate scure e sono ricoperte di setole. Le larve passano attraverso diversi stadi a seconda dell'ambiente e la loro lunghezza può estendersi fino a oltre 1 centimetro. (D, H) (E, I) Poco dopo eclosion, pigmentazione scura appare sopra il corpo adulto coleottero. Gli adulti possono vivere fino a diversi mesi e una femmina può deporre centinaia di embrioni sopra il suo ciclo di vita. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54976/54976fig1large.jpg" target="_blank">Clicca qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> In precedenza, abbiamo dimostrato che RNAi è efficace nel abbattendo la funzione del gene in D. maculatus 53. Qui la nostra esperienza di allevamento colonie D. maculatus in laboratorio è condiviso con i protocolli passo-passo sia embrionale e genitori RNAi set-up, iniezione, cura post-iniezione, e l'analisi fenotipica. Il silenziamento genico e analisi metodi dsRNA-mediate introdotti qui non solo di fornire informazioni dettagliate per affrontare questioni in D. maculatus, ma hanno anche un significato potenziale foR applicazione di RNAi in altre specie non-modello scarabeo / insetto.

<table><tbody><tr><td>Dermestes maculatus coleotteri vivi</td><td>Il nostro laboratorio o Carolina Biological Supply</td><td>#144168</td><td>Il nostro ceppo di laboratorio è stato verificato mediante codice a barre COI; la variazione del ceppo da Carolina non può essere esclusa</td></tr><tr><td>Cibo umido per gatti</td><td>Fancy Feast</td><td></td><td>Pezzi di carne con salsa. Può acquistare nella maggior parte dei negozi di alimenti per animali e alimentari</td></tr><tr><td>Cibo secco per cani</td><td>Purina Puppy Chow</td><td></td><td>Può acquistare nella maggior parte dei negozi di cibo per animali e alimentari</td></tr><tr><td>Gabbia per insetti (dimensioni medie, 30,5 x 19 x 20,3 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2260</td><td>Per il mantenimento della colonia. Può utilizzare una gabbia più grande, se necessario</td></tr><tr><td>Gabbia per insetti (dimensioni mini, 17,8 x 10,2 x 12,7 cm)</td><td>Exo Terra</td><td>PT2250</td><td>Per la raccolta di embrioni</td></tr><tr><td>Capsula di Petri</td><td>VWR</td><td>89038-968</td><td></td></tr><tr><td>Batuffolo di cotone</td><td>Fisher</td><td>22-456-883</td><td></td></tr><tr><td>Kit di trascrizione Megascript T7</td><td>Fisher</td><td>AM1334</td><td>Per 40 reazioni</td></tr><tr><td>Pompa pneumatica</td><td>WPI</td><td>PV830</td><td></td></tr><tr><td>Supporto capillare</td><td>WPI</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Micromanipolatore</td><td>NARISHIGE</td><td>MN-151</td><td></td></tr><tr><td>Carta da filtro nera (90&nbsp; mm)</td><td>VWR</td><td>28342-010</td><td></td></tr><tr><td>Colorante alimentare (verde)</td><td>McCormick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Capillare in vetro borosilicato</td><td>Hilgenberg</td><td>1406119</td><td></td></tr><tr><td>Estrattore per aghi (estrattore per micropipette)</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino per microscopio</td><td>WorldWide Life Sciences Division</td><td>41351157</td><td></td></tr><tr><td>Pellicola sigillante (Parafilm M)</td><td>Fisher</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>Modello 801 Siringa (10&nbsp; &micro; l)</td><td>Hamilton</td><td>7642-01</td><td></td></tr><tr><td>Ago (calibro 32)&nbsp;</td><td>Hamilton</td><td>7762-05</td><td></td></tr><tr><td>Soluzione di fissaggio (Pampel's)</td><td>BioQuip Products, Inc.</td><td>1184C</td><td>Tossico, deve essere maneggiato in cappa aspirante</td></tr><tr><td>Pinze (DUMONT #5)</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-30</td><td></td></tr><tr><td>Vetrino coprioggetti (24 x 50 mm, n. 1,5)</td><td>Globe Scientific</td><td>1415-15</td><td></td></tr><tr><td>Eppendorf Femtotips Puntale per pipetta Microloader</td><td>Fisher</td><td>E5242956003</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia da dissezione per iniezione di embrioni</td><td>Leica</td><td>M420</td><td></td></tr><tr><td>Microscopia da dissezione per la visualizzazione fenotipica larvale</td><td>Zeiss</td><td>SteREO Discover. Microscopia DIC V12</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Zeiss</td><td>AXIO Imager. M1</td><td></td></tr></tbody></table>

allevamento e rna a doppio filamento mediata silenziamento genico nel hide beetle, dermestes maculatus

Rearing and Double-stranded RNA-mediated Gene Knockdown in the Hide Beetle, Dermestes maculatus

I progressi della genomica hanno sollevato la possibilità di sondare la biodiversità su una scala senza precedenti. Tuttavia, la sequenza da sola non sarà informativa senza strumenti per studiare la funzione genica. Lo sviluppo e la condivisione di protocolli dettagliati per la creazione di nuovi sistemi modello nei laboratori e per gli strumenti per effettuare studi funzionali, è quindi cruciale per sfruttare la potenza della genomica. I coleotteri (coleotteri) sono il più grande clade di insetti e occupano praticamente tutti i tipi di habitat del pianeta. Oltre a fornire modelli ideali per la ricerca di base, gli studi sui coleotteri possono avere un impatto sul controllo dei parassiti in quanto sono spesso parassiti delle famiglie, dell'agricoltura e delle industrie alimentari. Vengono presentati protocolli dettagliati per l'allevamento e il mantenimento delle colonie di laboratorio di D. maculatus e per l'esecuzione dell'interferenza mediata da dsRNA in D. maculatus. Vengono descritte sia le procedure RNAi embrionali che parentali, tra cui l'impostazione dell'apparecchiatura, la preparazione, l'iniezione e il recupero post-iniezione. Vengono inoltre presentati metodi per l'analisi dei fenotipi embrionali, tra cui la vitalità, i difetti di patterning nelle larve schiuse e le preparazioni delle cuticole per le larve non schiuse. Questi saggi, insieme all'ibridazione in situ e all'immunocolorazione per marcatori molecolari, rendono D. maculatus un sistema modello accessibile per la ricerca di base e applicata. Forniscono inoltre informazioni utili per stabilire procedure in altri sistemi modello di insetti emergenti.

Laboratorio degli autori ha utilizzato la tecnologia RNAi per studiare l'evoluzione funzionale dei geni che regolano la segmentazione negli insetti 53,55. Mentre tutti gli insetti sono segmentati, i geni che regolano questo processo sembrano aver discostato durante radiazioni insetti 26,38,56-63. Schermi genetiche in Drosophila hanno identificato una serie di nove geni di segmentazione coppia-di regole che sono responsabili per promuovere la formazione di s...

Qui, vi presentiamo i protocolli per l&#39;allevamento di un coleottero intermedio di germi, Dermestes maculatus (D. maculatus) in laboratorio. Condividiamo anche protocolli per embrionale e genitori RNAi e metodi per l&#39;analisi dei fenotipi embrionali per studiare la funzione dei geni in questa specie.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

Advances in genomics have raised the possibility of probing biodiversity at an unprecedented scale. However, sequence alone will not be informative ...

L'obiettivo generale di questa procedura è quello di esplorare la funzione genica in Dermestes maculatus, un nuovo sistema modello di insetti, che rappresenta il diverso clade di coleotteri, e facilita lo studio di questioni di ricerca di base e applicate. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della biologia dello sviluppo, della biologia evolutiva e oltre, rendendo possibile testare la funzione genica negli embrioni e negli adulti di Dermestes. Il vantaggio principale di questa tecnica è che l'interferenza dell'RNA può essere utilizzata per colpire qualsiasi gene, basandosi solo sulle informazioni di sequenza, anche in assenza di una sequenza completa del genoma.I metodi qui introdotti non solo forniscono un approccio per studiare la funzione genica in Dermestes. Possono anche essere applicati per sviluppare nuovi sistemi modello di insetti e potenzialmente per controllare gli insetti nocivi. Per preparare una gabbia di allevamento per un D. maculatus, stendere prima un sottile strato di trucioli di legno in una gabbia per insetti di medie dimensioni.Metti una sezione di polistirolo nella gabbia per consentire alle larve un ambiente in cui impuparsi. Ag

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In questo protocollo si combinano RNAi-mediato silenziamento genico con...

RNAi-mediato Knockdown Gene e<em&gt; In Vivo</em&gt; Saggio La diuresi in femmina adulta<em&gt; Aedes aegypti</em&gt; Le zanzare

In questo protocollo, si descrive due strategie che sopprimono contemporaneamente due geni (doppia knockdown gene) di api mellifere. Poi ci presentiamo come usare la risposta estensione proboscide (PER) test per studiare l'effetto di doppio knockdown gene sul miele d'api percezione gustativa.

RNAi mediato doppia Gene atterramento e gustative Percezione misura di api mellifere (<em&gt; Apis mellifera</em&gt;)

Mentre dsRNA alimentazione in C. elegans è un potente strumento per valutare la funzione del gene, i protocolli attuali schermi di alimentazione su larga scala producono efficienze atterramento variabili. Descriviamo un protocollo migliorato per eseguire larga scala RNAi schermi alimentazione che si traduce in knockdown altamente efficace e riproducibile di espressione genica.

Su larga scala Knockdown Gene in<em&gt; C. elegans</em&gt; Utilizzo di librerie di alimentazione dsRNA per generare fenotipi Robusti Perdita di funzione

RNA interference (RNAi) tecniche di gene knockdown basati sono al centro della ricerca Tribolium. Qui, forniamo una panoramica della nostra tecnica larvale RNAi in Tribolium castaneum. Larvale RNAi è una tecnica semplice, ma potente che consente di accedere rapidamente alla perdita-di-funzione di fenotipi, consentendo ai ricercatori di studiare le funzioni del gene in contesti diversi.

Larvali interferenza RNA nella Red Farina Beetle, Tribolium castaneum

Qui si descrive un procedimento per inibire la funzione del gene in zanzare vettori di malattie attraverso l'uso di chitosano / RNA interferenti nanoparticelle che vengono ingeriti da larve.

Il chitosano / interferenti RNA nanoparticelle mediata silenziamento genico in Disease Vector Mosquito Larve

L'interferenza dell'RNA (RNAi) è uno strumento estremamente prezioso per scoprire la funzione genica. Tuttavia, la capacità di indirizzare i geni utilizzando l'RNAi durante gli stadi pre-adulti è limitata nel principale vettore umano della malaria, l'Anopheles gambiae. Descriviamo un protocollo RNAi per ridurre la funzione genica tramite iniezione diretta durante lo sviluppo della pupa.

RNAi trigger consegna in<em&gt; Anopheles gambiae</em&gt; Pupe

Qui presentiamo un protocollo per iniettare uova di cricket, una tecnica che serve come metodo fondamentale in molti esperimenti nel cricket, tra cui, ma non solo, l'interferenza dell'RNA e la manipolazione genomica.

Iniezione di uova di Gryllus bimaculatus

L'interferenza dell'RNA è una tecnica potente e ampiamente applicabile per manipolare l'espressione genica in fasi di sviluppo specifiche. Qui, descriviamo i passaggi necessari per l'implementazione di questa tecnica nel coleottero subacqueo acquatico Thermonectus marmoratus, dall'acquisizione di sequenze geniche al knockdown di geni che influenzano la struttura o il comportamento.

Interferenza dell'RNA nei Coleotteri acquatici come potente strumento per manipolare l'espressione genica in punti specifici del tempo di sviluppo

Forniamo un protocollo dettagliato per l'interferenza dell'RNA mediato dall'elettroporazione negli insetti dell'ordine Odonata (libellule e damselflies) usando il damselfly dalla coda blu (Ischnura senegalensis: Coenagironidae: Zygoptera) e la libellula skimmer pied(Pseudothemis zonata: Libellulidae: Anisoptera).

Metodo di interferenza dell'RNA mediato dall'elettroporazione in Odonata

Qui è presentato un protocollo di microiniezione embrionale Helicoverpa armigera (Hübner) e identificazione di mutanti knockout creati dall'editing del genoma CRISPR / Cas9. Gli insetti mutanti consentono ulteriori ricerche sulla funzione genica e sull'interazione tra diversi geni in vivo.

Microiniezione embrionale e identificazione di mutanti knockout di Helicoverpa Armigera (Hübner) modificata dal genoma CRISPR/Cas9

Il presente protocollo descrive le linee guida passo-passo per le tecniche operative RNAi in P. americana.

Applicazioni dell'interferenza dell'RNA nello scarafaggio americano

Scopri come allevare Dermestes maculatus e applicare l'RNAi embrionale e parentale per studiare la funzione genica. Questo metodo innovativo permette di analizzare fenotipi e sviluppare nuovi modelli entomologici.

Allevamento e RNA a doppio filamento mediata silenziamento genico nel Hide Beetle, Dermestes maculatus

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