Name: Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare In Vivo Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-19T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 40 s
Description: Scopri la spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo-31 per misurare la capacità di fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano in vivo. Questa tecnica non invasiva consente studi longitudinali ripetuti.

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Questo lavoro è stato supportato in parte da un Davis Heart and Lung Research Institute Trifit Award, così come dal Programma di Ricerca Intramurale del NIH National Institute on Aging.

Questo protocollo è approvato dalla e segue le linee guida della Institutional Review Board Ohio State University per la sperimentazione umana. E 'estremamente importante che tutte le procedure che coinvolgono attrezzature MR vengono eseguite da personale adeguatamente addestrato che aderiscono ai più alti standard di sicurezza MR 59. 1. Materiali e preparazione <ol><li> Assicurarsi che tutti i materiali necessari sono disponibili prima dell'esperimento (Figura 2). </li><li> Inserire la bobina 31 P nel connettore bobina-tabella alla fine della tabella esame più vicino al foro. Mettere un grande cuscino di schiuma triangolo vicino alla testa del tavolo esame RM, ma non direttamente sulla bobina 31 P. Posizionare un cuscino capo all'altro capo del tavolo dell'esame MR, lontano dal foro, per il comfort soggetto. </li></ol> 2. Fatte salve di posizionamento (Figura 3a) <ol><li> Istruire il soggetto a mentire in posizione supina, piediprima sul tavolo MR. Posizionare un cuscino di schiuma sotto le ginocchia per sostenere la gamba in una posizione parzialmente flessa. </li><li> Posizionare il soggetto vicino al lato destro della tabella (destra del soggetto) per centrare il più fedelmente la coscia sinistra alla isocentro magnete possibile, garantendo così l'omogeneità B0 ottimale nel muscolo della coscia in esame. Fornire l'argomento con tappi per le orecchie e / o cuffie. </li><li> Posizionare la bobina RF 31 P sul quadricipite sinistro a circa il punto medio tra la rotula e la testa del femore, e fissare alla gamba utilizzando cinghie. Posizionare la bobina sulla porzione laterale della gamba, sopra vasto laterale. </li><li> Fissare l'olio bambino al mediale della coscia con le stesse cinghie utilizzate per fissare la bobina alla gamba. Questo facilita la localizzazione di scansione. </li><li> Legate gambe del soggetto insieme con una cinghia posto sotto la bobina e sopra il ginocchio. Fissare le gambe del soggetto al tavolo MR con Stra aggiuntivops, uno sopra il ginocchio e uno a metà strada tra il ginocchio e la caviglia. </li><li> Utilizzare la guida di luce laser per delineare il centro della bobina e spostare la tavola all'isocentro magnete utilizza questo centraggio riferimento. </li></ol> 3. Esercizio protocollo <ol><li> Spiegare al soggetto che il protocollo di esercizio si compone di tre fasi: una fase della linea di base iniziale; una breve, fase di esercizio intenso; e una fase di recupero. </li><li> Istruire il soggetto a restare immobile e rilassare i muscoli delle gambe durante le fasi iniziali e recupero dell'acquisizione spettroscopia per minimizzare artefatti da movimento. </li><li> Fornire un conto alla rovescia per il soggetto che indica l'inizio di esercizio. A questo punto, ha il soggetto avviare ginocchio estensione / flessione come forza e il più rapidamente possibile contro la resistenza delle cinghie. NOTA: I muscoli quadricipiti sono usati per spostare la parte inferiore della gamba sinistra su e giù, fino incaricato di fermare. </li><li> Termina esercizio dopo un calo del 30%in altezza del picco PCr. <ol><li> Osservare l'altezza del picco PCr nella finestra di visualizzazione di acquisizione, ed anche vederlo al termine della sequenza di esercizio. NOTA: Una linea guida generale è che un approssimativo diminuzione del 30% in PCr altezza del picco corrispondente a un picco Pi che è il 50% dell'altezza del picco PCr. Se l'esaurimento la PCR non sta avvenendo abbastanza rapidamente per ottenere un calo del 30% durante la fase di esercizio della prova, di incoraggiare il soggetto a calciare più forte o più veloce durante l'attività fisica. NOTA: cessazione di esercizio è determinata monitorando l'altezza di picco della PCr e durata di esercizio. Ciò può dar luogo a diverse durate di esercizio di diversi pazienti e può essere rappresentato nell'analisi. </li></ol></li></ol> 4. Protocollo di scansione <ol><li> Acquisire un localizzatore tri-plane per verificare il corretto posizionamento soggetto e identificare la posizione della bobina 31 P. NOTA: La sequenza localizzatore inizia automaticamente e centra al indicposizione ated utilizzando la guida di luce laser (passo 2,9) </li><li> Acquisire un secondo localizzatore tri-aereo. <ol><li> Aprire la vista fetta su le prime immagini localizzatore tri-aereo. NOTA: Questo processo può essere diverso per i diversi sistemi software e hardware. </li><li> Centro e ruotare l'orientamento fetta sinistro del mouse e tenendo premuto sul gruppo fetta. Ruotare il gruppo fetta. Assicurarsi che l'orientamento finale di fette coincide con la posizione del bambino dell'olio. </li><li> Nella finestra di routine di sequenza, aumentare il numero di fette di coprire l'intera gamba in immagini assiali e sagittali (Figura 3b). </li></ol></li><li> 31 P sequenza spettroscopia: <ol><li> Utilizzare i seguenti parametri della sequenza non localizzato impulsi acquisire: TR: 1,000 msec; TE: 0,34 msec; larghezza spettrale: 2.000 Hz; flip angle: 90 gradi; punti di dati acquisiti: 1.024; 4 medie risultanti in una risoluzione temporale di spettro 1 ogni 6 sec. </li></ol></li><li> 31 P spessore box posizionamento: <ol><li> Utilizzo di un mouse, trascinare le seconde immagini triplane localizzatore nella finestra di visualizzazione nella parte superiore dello schermo. Trascinare la sequenza di spettroscopia nella finestra di protocollo e fare doppio clic per aprire. </li><li> Utilizzare la barra degli strumenti di posizione per visualizzare la voxel spessore (selezionare il rettangolo nero con linee orizzontali). Dopo aver selezionato questa opzione, osservare una scatola verde sulle immagini localizzatore. NOTA: Questo è il voxel spessore. </li><li> Spostare il voxel sinistro del mouse e tenendo premuto il voxel nel centro. Modificare le dimensioni e ruotare l'orientamento del voxel sinistro del mouse e tenendo premuto il voxel all'angolo della scatola. Posizionare la scatola spessore in modo da garantire l'omogeneità B0 campo direttamente sotto la bobina e parallelo al piano del quadricipite. NOTA: Questo per garantire una corretta shimming nella regione sensibile sotto la bobina, che è il volume di tessuto direttamente sotto il centro della bobina. </li><li> Utilizzare le immagini tri-plane localizzatore per individuare il sensitive regione della bobina e regolare la casella shim per comprendere questa regione all'interno del muscolo quadricipite. NOTA: La scatola spessore può essere lunga superiore alla copertura della bobina di superficie al fine di garantire l'omogeneità B0 ai acquisizione dati voxel (figura 3c). </li><li> Acquisizione di prova 31 P: <ol><li> Aprire la finestra di visualizzazione di acquisizione e selezionare l'icona testa nella barra degli strumenti di acquisizione. Ciò consentirà per la visualizzazione di acquisizione spettroscopia in tempo reale. </li><li> Dopo il posizionamento del 31P spessore voxel, eseguire la sequenza per ottenere un singolo spettro facendo clic sul pulsante "Esegui" nella parte superiore della finestra del protocollo. </li><li> Esaminare la qualità della B0 shimming. Osservare lo spettro risultante nella finestra di acquisizione. Osservare un importante picco di PCr centrato a 0 ppm e nessun rumore significativo (figura 4a, a sinistra). NOTA: Risoluzione dei problemi: Se lo spettro appare rumorosa, assicurarsi che la casella di spessore è collocato all'interno del muscolo. Anno Dominisolo la dimensione e la posizione della casella shim per migliorare il rapporto segnale-rumore. Ripetere l'acquisizione di test come necessario. </li><li> Per vedere l'altezza del picco PCr, aprire lo spettro nello strumento di spettroscopia ( "Applicazioni" → "spettroscopia"). Aprire la cartella del paziente (cartella albero icona), selezionare la scansione appropriata, e fare doppio clic per caricare lo spettro. </li></ol></li></ol></li><li> immagine T1 pre-esercizio: <ol><li> Ottenere un'immagine T1 pesate assiali singola slice al centro di una bobina. </li></ol></li><li> 31 P acquisizione pre-esercizio: <ol><li> Copiare la sequenza dal punto 4.4 (che ha prodotto la migliore qualità spettrale) sinistro del mouse e trascinando la sequenza nella finestra di protocollo. Utilizzare questa sequenza per tutte le misurazioni successive. </li><li> Nella finestra di routine di sequenza, aumentare il numero di misurazioni da 1 a 10. Selezionare run acquisire 10 misurazioni mentre il soggetto è a riposo. </li></ol></li><li> 31 &lt;/ Sup&gt; P acquisizione esercizio: NOTA: Prendere nota dei tempi di inizio e di fine esercizio, in quanto questo sarà importante per l'analisi. <ol><li> Riposo: Applicare le impostazioni shim dalla scansione precedente e impostare la sequenza di acquisire 20 misure. Istruire il soggetto di iniziare a calci dopo un conto alla rovescia. Istruire il soggetto a restare a riposo per 2 misure. </li><li> Esercizio: Chiedi al soggetto di eseguire l'esercizio estensione del ginocchio per ~ 30 sec (o il tempo necessario per ottenere una riduzione del 30% nel picco di ampiezza PCr). Dopo che il soggetto raggiunge esaurimento PCr sufficiente, chiedere loro di riposare. </li></ol></li><li> 31 P post-esercizio acquisizioni: <ol><li> Acquisire ulteriori 20 misurazioni a riposo. Assicurarsi che le acquisizioni di post-esercizio iniziano subito dopo la sequenza di esercizio, senza pause o spessori (figura 4a, a destra). NOTA: La suddivisione del periodo di recupero in due distinte operazioni consente di analizzare l'initial 20 spettri dinamica durante l'acquisizione del secondo 20 spettri dinamico, consentendo all'operatore di evitare l'acquisizione del periodo di recupero completo se l'esercizio deve essere ripetuta. </li></ol></li><li> Garantire la qualità esercizio: <ol><li> Confrontare le altezze dei picchi PCr all'inizio e alla fine dell'esercizio. sessioni di esercizio di alta qualità producono un ~ diminuzione del 30% della concentrazione PCr. </li><li> Verificare che l'altezza del picco PCr è uguale all'inizio di riposo e al termine del recupero (tipicamente, &lt;10% di differenza è desiderato). Ciò assicura che non vi era trascurabile perdita di campo omogeneità durante l'acquisizione. NOTA: Se la ripartizione PCR è insufficiente, o se vi è stata una perdita di campo omogeneità, quindi ripetere la porzione di esercizio / recupero della prova (avendo cura di evitare l'affaticamento), assicurarsi che la bobina e le cinghie sono fissate in modo sicuro, e si estendono la durata di esercizio e / o incoraggiare l'esercizio più vigorosa (Figura 4b). NONE: Il confronto delle immagini ottenute nei passaggi 6 e 11 permessi di un passo ulteriore controllo di qualità di visualizzare qualsiasi spostamento della coscia e la bobina per effetto dell'esercizio, assicurando così che il movimento minimo si è verificato durante il protocollo, che potrebbero influenzare in modo significativo i dati acquisiti . </li></ol></li><li> A seguito di imaging T1 post-esercizio, ripetere il pre-esercizio assiale di imaging T1 (passo 4,5) utilizzando gli stessi parametri di acquisizione. <ol><li> Oltre a sufficiente deplezione di PCr, misurare l'esercizio pH finale garantire che l'esercizio non induce acidosi del muscolo. </li><li> Eseguire questa misurando lo spostamento chimico tra Pi e PCR (Ap i) e utilizzando la seguente equazione 60: pH = 6.77 + log [(Ap i -3.29) / (5,68-Ap i)] NOTA: Il pH dovrebbe rimanere superiore a 6.8 61. Se la ripartizione PCr è sufficiente ma il pH è troppo basso, ripetere l'esercizio per un breve periodoer durata e / o con una ridotta intensità. </li></ol></li><li> Salvataggio dei dati: <ol><li> Salva tutti gli spettri acquisiti come file DICOM ed esportarli per l'elaborazione utilizzando JMRUI. </li><li> Se si utilizza uno scanner, selezionare tutte le acquisizioni di spettroscopia nella finestra "Navigator". </li><li> In "Applicazioni", selezionare "Strumenti Dicom" → "Esporta MR spettroscopia", e salvare i file DICOM (* .dcm) a C: / user / MedCom / temp / CDROFFLINE (Lo strumento sceglie automaticamente questa posizione). </li><li> In "Transfer", selezionare "Esporta in linea." Salvare nella posizione desiderata. </li></ol></li></ol> 5. Elaborazione dati e analisi 62 <ol><li> Analizzare la MR spettri con il software JMRUI liberamente disponibile (versione 5.2; http://www.jmrui.eu/). </li><li> Apodize e sfasamento gli spettri per garantire l'uniformità di tutti i punti temporali acquisiti (Figura 5). Il picco PCR sarà centrato unt 0 ppm negli spettri. </li><li> Utilizzare l'algoritmo amares incorporato per quantificare l'ampiezza del picco PCr in ogni spettro acquisito. L'ampiezza di picco rappresenta la concentrazione della PCr nella regione sensibile della bobina di superficie in quel particolare punto di tempo. </li><li> Nel software computazionale, tracciare le concentrazioni PCr in funzione del tempo di acquisizione. Utilizzando il built-in strumento di curva-fit software di calcolo, si adattano i dati periodo di recupero PCR per la seguente equazione 52, 63: <img alt="Equazione 1" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq1.jpg"></li><li> Registrare i valori della linea di base PCr ( <img alt="Equazione 2" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq2.jpg"> ), Il più basso PCr ( <img alt="Equazione 3" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq3.jpg"> ), E il tempo di recupero ( <img alt="Equazione 4" src="/files/ftp_upload/54977/54977eq4.jpg"> . </li><li> Assicurarsi che le condizioni appropriate siano soddisfatte durante il Exersessione CISE calcolando l'esaurimento PCr, la differenza percentuale tra la linea di base PCR e il più basso PCR. sessioni di esercizio ideale si ottiene un 20 - deplezione 50%. NOTA: La qualità del montaggio di curva può essere assicurata verificando che il valore R 2 è maggiore di 0,75. R 2 valori vengono calcolati automaticamente dal software di montaggio. </li></ol>

Gli autori non hanno nulla da rivelare.

Questo documento descrive un protocollo standard per l&#39;esame 31 PMRS che permette la misurazione di serie e non invasiva in vivo del muscolo scheletrico funzione mitocondriale. Il protocollo tiene notevole appeal quando si considera l&#39;ampiezza delle indagini rivolte al crescente peso della sindrome metabolica e la sua morbilità e mortalità che ne deriva. Questo protocollo 31 PMRS richiede una quantità minima di tempo scanner e può essere incorporato in indagini metaboliche globali ...

L&#39;obiettivo di questo lavoro è quello di delineare un metodo riproducibile per misurare in modo non invasivo in vivo funzione mitocondriale nel muscolo scheletrico in persone fisiche che hanno una vasta gamma di abilità. insufficienza mitocondriale aberrante è un segno distintivo di una vasta gamma di sindromi metaboliche e le malattie genetiche, dalle condizioni comuni come l&#39;invecchiamento e il diabete di malattie rare come l&#39;atassia di Friedreich. Sindrome metabolica e disfunzione mitocondriale La sindrome metabolica è stato indicato per interrompere la funzione mitocondriale, deprimere scheletrico OXPHOS muscolare, e portare a stoccaggio dei lipidi ectopica nel muscolo scheletrico 1, 2. Organelli come critici che regolano metabolismo e l&#39;omeostasi energetica, i mitocondri sono implicati nella fisiopatologia dell&#39;obesità 3, 4, 5 insulino-resistenza </sup&gt;, Diabete di tipo 2 (DM2) 6, 7, correlata al diabete micro 8, 9, 10, 11 e complicanze macrovascolari 12, 13, e non alcoliche malattia del fegato grasso (NAFLD) 14, 15, 16, tra gli altri, .Insulin resistenza è caratterizzato da profondi cambiamenti nel muscolo scheletrico attività mitocondriale, tra cui diminuito mitocondriale degli acidi tricarbossilici (TCA) tasso di flusso, il tasso di sintesi di ATP e citrato sintasi e NADH: O 2 attività ossidoreduttasi 5. Una ipotesi è che queste alterazioni potrebbero essere dovute all&#39;accumulo di acidi grassi liberi (FFA) metaboliti nel muscolo, che vengono notevolmente aumentata durante l&#39;obesità e altri obesità-rmalattie euforico 2, 17. L&#39;esposizione del muscolo FFAs elevati e intermedi lipidici può diminuire l&#39;espressione di geni nella via ossidativa dei lipidi e il ciclo TCA e catena di trasporto degli elettroni (ETC) 18. Questa riduzione mitocondriale scheletrico capacità OXPHOS muscolare nella cornice di un sovraccarico di lipidi è accompagnata da una diminuzione del (contenuto e la biogenesi dei mitocondri) quantitativa 19 e la funzione qualitativa dei mitocondri dei muscoli scheletrici 20. Esponendo muscolo scheletrico e miociti a FFAs porta a grave resistenza all&#39;insulina, e una maggiore assorbimento di FFA nel muscolo è associata alla resistenza all&#39;insulina in entrambi gli esseri umani e roditori 21. Il intermedi lipidici ceramide e diacilglicerolo (DAG) hanno dimostrato di inibire direttamente la via di segnalazione dell&#39;insulina alterando l&#39;attività di chinasi, come la proteina chinasi C e protein chinasi B 21. Pertanto, molecole lipidiche di derivazione sembrano svolgere un ruolo di primo piano nello sviluppo della scheletrico insulino-resistenza muscolare e diabete di tipo 2. Tuttavia, non è chiaro se i cambiamenti nella capacità mitocondriale sono una causa o una conseguenza di insulino-resistenza 22. Atassia e mitocondriale disfunzione di Friedrich OXPHOS Diminuzione possono anche derivare da difetti genetici. L&#39;atassia di Friedrich (FA), la forma più comune di atassia ereditaria, è una malattia genetica causata da una mutazione nel fratassina (FXN) gene, con conseguente accumulo di ferro intra-mitocondriale, la produzione di specie reattive dell&#39;ossigeno, e anomalie della fosforilazione ossidativa 23, 24, 25, 26. Questa importante scoperta ha portato allo sviluppo di terapie mirate, which obiettivo di migliorare la funzione mitocondriale a livello sub-cellulare. Nonostante questa comprensione, vi è stato limitato sviluppo in vivo, biomarcatori riproducibili per la ricerca clinica FA. In realtà, una barriera critica nella valutazione efficace delle terapie mirate in FA è l&#39;incapacità di tenere traccia delle modifiche in funzione mitocondriale. misure funzionali attuali, per esempio, può identificare diminuzione della gittata cardiaca; tuttavia, sono incapaci di determinare il livello a cui avviene il erettile (Figura 1). Lo sviluppo di un indicatore affidabile della funzione mitocondriale che può essere utilizzato per identificare e valutare la progressione della malattia in atassia di Friedrich è fondamentale per valutare il relativo impatto meccanicistica di terapie mirate. OXPHOS deteriorate e disfunzione cardiaca Aberrant funzione mitocondriale, sia acquisita o genetica, potrebbe contribuire allo sviluppo o la progressione di cardiLa disfunzione ac. Nelle condizioni di sovraccarico di pressione e di insufficienza cardiaca, l&#39;energia primaria passa substrato di preferenza da FFA al glucosio. Questo è associato con diminuzione dell&#39;attività ETC e fosforilazione ossidativa 27. La fisiopatologia della bioenergetica mitocondriale nella disfunzione cardiaca può essere diverso a seconda della provenienza primaria del difetto mitocondriale. Diabete e sindrome metabolica risultati in alterazioni mitocondriali nel miocardio, come la biogenesi compromessa e il metabolismo degli acidi grassi, che portano ad una ridotta flessibilità del substrato, l&#39;efficienza energetica, e alla fine, la disfunzione diastolica 28, 29. In FA, invece, una carenza frataxin risultati in significativo accumulo di ferro mitocondriale in cardiomiociti 30, 31. Accumulo di ferro porta alla produzione di radicali liberi tramite la reazione di Fenton 32 &lt;/ Sup&gt; e aumenta la possibilità di danni dei radicali liberi indotti cardiomiociti. L&#39;accumulo di ferro intra-mitocondriale è anche associata ad una maggiore sensibilità allo stress ossidativo e una ridotta capacità ossidativa 30, 31. L&#39;accumulo di ferro e la successiva funzione mitocondriale aberranti, a causa della carenza di fratassina, possono quindi essere responsabile per l&#39;energetica cardiaca compromessa e cardiomiopatia osservati in FA 33, 34. E &#39;anche interessante notare che la capacità ossidativa ridotta nei mitocondri dei muscoli scheletrici parallela alla intolleranza esercizio e ridotta capacità metabolica nello scompenso cardiaco (HF) 35. Misurazione della scheletrico capacità OXPHOS muscolare, come specificato nel presente documento, è facilmente implementabile e robusto; accoppiato con il significato di OXPHOS muscolo scheletrico in HF, queste caratteristiche lo rendono un biomarker attraente in studi completi di sentiret malattia 36. OXPHOS deteriorate e la disfunzione cardiaca di accompagnamento non è un aspetto irrilevante di metabolica e malattia mitocondriale. I soggetti con diabete e malattie metaboliche sono a più alto rischio di sviluppare malattie cardiovascolari e hanno eccesso di mortalità dopo infarto miocardico (MI) 37, 38, 39, 40, 41; oltre la metà dei soggetti FA avere cardiomiopatia, e molti muoiono di aritmia cardiaca o insufficienza cardiaca 42. Pertanto, la quantificazione della riduzione OXPHOS potrebbe non solo permettere la diagnosi precoce e il trattamento della disfunzione cardiaca, ma potrebbe anche alleviare un grande onere clinica in queste malattie. terapie mirate per aumentare direttamente la capacità OXPHOS è un settore promettente per migliorare il trattamento di soggetti, whether la causa della disfunzione metabolica è genetica o acquisita. Attualmente, lo sviluppo di nuovi farmaci che alleviano o anormale funzione mitocondriale 43 o correggere il difetto genetico primario 44 in grado di migliorare la bioenergetica caratteristica squilibrato di FA mirati. Nel caso di disfunzione mitocondriale acquisita, aumento dell&#39;attività fisica può migliorare la funzione mitocondriale 45, 46, 47. 31 Fosforo spettroscopia di risonanza magnetica come biomarcatore non invasivo della funzione mitocondriale Indipendentemente dalla terapia testata, un integrato nella valutazione vivo di bioenergetica del muscolo scheletrico è uno strumento fondamentale per valutare l&#39;impatto degli interventi mirati, soprattutto nei soggetti con grave intolleranza esercizio fisico o l&#39;incapacità di subire metabo convenzionaletest lic. Spettroscopia di risonanza magnetica sintonizzato fosforo (31 PMRS), un nucleo endogena trovato in vari substrati ad alta energia all&#39;interno delle cellule in tutto il corpo, è stato utilizzato per quantificare la capacità ossidativa mitocondriale utilizzando una varietà di approcci, compreso a magnete protocolli esercizio recupero e stimolazione muscolare protocolli 48. I protocolli esercizio di recupero si basano su una serie di apparecchi che vanno in complessità da ergometri compatibili con la risonanza magnetica che regolano e misurano il carico di lavoro per semplici configurazioni di cinghie e tamponi che consentono di scoppio di tipo resistivo e l&#39;esercizio fisico quasi-statico. Uno degli obiettivi primari di qualsiasi di questi protocolli è quello di produrre uno squilibrio energetico per il quale la domanda di adenosina trifosfato (ATP) viene inizialmente soddisfatta attraverso la ripartizione enzimatica di fosfocreatina (PCR) attraverso la creatina chinasi reazione 49. Al momento della cessazione di esercizio, il tasso di produzione di ATP è dominata da pho ossidativosphorylation e rappresenta la massima capacità vivo dei mitocondri 50. Inoltre, OXPHOS durante il recupero post-esercizio può essere descritto da una reazione di primo ordine 51. Il recupero post-esercizio della PCR può quindi essere quantificata dal montaggio di una costante di tempo esponenziale (τ PCR), con i valori più bassi di τ PCr che rappresentano una maggiore capacità di sintesi di ATP ossidativo. Notevoli sforzi sono stati fatti per validare 31 PMRS contro ex vivo e misure più dirette di OXPHOS e dimostrare il potenziale applicabilità clinica di questa tecnica 52, 53, 54, 55. In particolare, il protocollo descritto in questo lavoro può essere implementato su scanner clinicamente disponibili, ed è stato ampiamente validato quale non invasivo biomarker of funzione mitocondriale 56. Tuttavia, un esercizio di 31 protocollo PMRS ottimizzato per l&#39;applicazione alle persone con diversi livelli di gravità della compromissione neuromuscolare o di mobilità non è stato ben definito 57. A ben definito, in generale, applicabile protocollo di esercizio e il 31 la tecnica PMRS sarebbero particolarmente utili nella valutazione delle patologie con anomalie fondamentali nella funzione mitocondriale. Diversi studi precedenti hanno esplorato le applicazioni di tecniche non invasive per quantificare la funzione mitocondriale nei soggetti. Per esempio, queste tecniche hanno dimostrato OXPHOS ridotta nei soggetti con diabete di tipo 2 36. Lodi et al. prima testato la fattibilità di tecniche PMRS in soggetti con FA ed ha trovato che 1) il difetto genetico fondamentale nella FA danneggia scheletrico OXPHOS muscolare e 2) il numero di GAA tripletta ripetizioni è inversamente proporzionale al muscolo scheletrico OXPHOS 33. Più recentemente, Nachbauer et al. PMRS usato come misura di esito secondario in un trial clinico di FA con 7 soggetti. I tempi di recupero PCR sono stati significativamente più lungo nei soggetti rispetto ai controlli, riaffermando precedente lavoro di Lodi e che indica che gli effetti di espressione frataxina aberrante in FA possono causare una diminuzione della capacità mitocondriale che è rilevabile con tecniche PMRS 58. Metodi affidabili per definire in modo adeguato in vivo funzione del muscolo scheletrico in un rapporto costo-efficacia, e modo riproducibile fattibile sono fondamentali per migliorare i risultati soggetti a una serie di malattie che colpiscono la funzione mitocondriale. Questo lavoro delinea una procedura affidabile per ottenere in vivo massima capacità ossidativa del muscolo scheletrico con 31 PMRS. Il protocollo di esercizio in-magnete è ben tollerato da individui che coprono una vasta gamma di fisica e functionaL capacità e offre una messa a punto soggetto semplificata utilizzando attrezzature poco costoso e ampiamente disponibili.

<table><tbody><tr><td>1.5 T MR Scanner</td><td>Il produttore Siemens</td><td></td><td>non influirà sui risultati</td></tr><tr><td>Bobina di trasmissione-ricezione da 10 cm 31P, 1.5T compatibile</td> con <td>il produttore PulseTeq</td><td></td><td>non influirà sui risultati</td></tr><tr><td>3 fl oz Olio per bambini</td><td>Johnson & Il produttore di Johnson</td><td>non influirà sui risultati</td>Cuscino triangolare in schiuma (ginocchio)Il produttore Siemens non influirà sui risultati(3) cinghie resistive con fibbia in plastica; da tavolo a tavolo Il produttore Siemens non influirà sui risultati(1) cinturino resistivo con fibbia in plastica; Siemens autoconnettivo <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare in vivo capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Phosphorus-31 Magnetic Resonance Spectroscopy: A Tool for Measuring In Vivo Mitochondrial Oxidative Phosphorylation Capacity in Human Skeletal Muscle

La capacità di fosforilazione ossidativa mitocondriale del muscolo scheletrico (OXPHOS), che è di fondamentale importanza per la salute e la malattia, può essere misurata in vivo e in modo non invasivo nell'uomo tramite spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo-31 (31PMRS). Tuttavia, l'approccio non è stato ampiamente adottato nella ricerca traslazionale e clinica, con variazioni nella metodologia e indicazioni limitate dalla letteratura. Una maggiore ottimizzazione, standardizzazione e diffusione dei metodi per la PMRS 31 in vivo faciliterebbe lo sviluppo di terapie mirate per migliorare la capacità di OXPHOS e potrebbe in ultima analisi avere un impatto favorevole sulla salute cardiovascolare. 31La PMRS produce una misura non invasiva e in vivo della capacità di OXPHOS nel muscolo scheletrico umano, al contrario delle misure alternative ottenute da mitocondri espiantati e potenzialmente alterati tramite biopsia muscolare. Si basa solo su una modesta strumentazione aggiuntiva oltre a quella già presente negli scanner a risonanza magnetica disponibili per la ricerca clinica e traslazionale nella maggior parte delle istituzioni. In questo lavoro, delineiamo un metodo per misurare in vivo l'OXPHOS del muscolo scheletrico. La tecnica viene dimostrata utilizzando uno scanner RM per tutto il corpo da 1,5 Tesla dotato dell'hardware e del software adatti per 31PMRS e spieghiamo un protocollo semplice e robusto per l'esercizio resistivo in-magnet per affaticare rapidamente il muscolo quadricipite. La riproducibilità e la fattibilità sono dimostrate sia nei volontari che nei soggetti con un'ampia gamma di capacità funzionali.

La riproducibilità di studio Sei volontari (4 uomini e 2 donne, età media: 24,5 ± 6,2 anni) con nessun cuore auto-riportati, metabolica o malattia mitocondriale sono stati sottoposti a sessioni di esercizio e di imaging tecnica 31 PMRS descritto a 2 giorni diversi entro 1 settimana per valutare la tecnica riproducibilità (Figura 6a). Gli studi condotti su volontari sani confermano l...

Questo lavoro dimostra la fattibilità di una tecnica di spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo-31 in vivo (31PMRS) per quantificare la capacità di fosforilazione ossidativa mitocondriale (OXPHOS) nel muscolo scheletrico umano.

Fosforo-31 spettroscopia di risonanza magnetica: uno strumento per misurare In Vivo Capacità fosforilazione ossidativa mitocondriale nel muscolo scheletrico umano

Skeletal muscle mitochondrial oxidative phosphorylation (OXPHOS) capacity, which is critically important in health and disease, can be measured in vivo ...

L'obiettivo generale di questa tecnica di risonanza magnetica in vivo e del protocollo di esercizio è quello di stabilire un metodo robusto e standardizzato per la misurazione non invasiva della capacità di fosforilazione ossidativa mitocondriale. La capacità di fosforilazione ossidativa mitocondriale del muscolo scheletrico può essere misurata in modo non invasivo con la spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo 31 in vivo. Questa tecnica standardizzata faciliterà lo sviluppo di terapie mirate per migliorare la capacità di fosforilazione ossidativa.I principali vantaggi di questa tecnica sono che non è invasiva e consente un'indagine seriale e che è ben tollerata da individui che abbracciano un'ampia gamma di capacità funzionali. In generale, le persone che non conoscono questo metodo avranno difficoltà perché la configurazione dell'attrezzatura e il posizionamento del soggetto sono tecnicamente intensivi e di fondamentale importanza per ottenere buoni risultati. Prima dell'imaging, ottenere il consenso scritto e informato dal soggetto e sottoporlo a un accurato screening per la sicurezza della risonanza magnetica.Quindi, preparati per l'esperimento. Questo protocollo è dimostrato utilizzando un sistema Siemens Avanto 1.5 Tesla. Inizia la preparazione per l'imaging inserendo prima la bobina di fosforo 31 nel connettore della bobina da tavolo più vicino al foro.Quindi, posizionare un grande cuscino triangolare in schiuma vicino all'altra estremità del tavolo da visita dello scanner, ma non direttamente sulla bobina. Inoltre, posizionare un cuscino per la testa sul tavolo dell'esame RM più lontano dal foro, quindi istruire il soggetto a sdraiarsi supino con i piedi prima sul tavolo MR. Posiziona un cuscino di schiuma sotto le ginocchia per sostenere la gamba in una posizione parzialmente flessa.Assicurati di posizionare il soggetto vicino al lato destro del tavolo per centrare la coscia sinistra il più vicino possibile all'isocentro del magnete per garantire un'omogeneità ottimale di B0. Quindi, fornisci al soggetto tappi per le orecchie o cuffie per la protezione dell'udito. Posizionare la bobina di fosforo 31 sul quadricipite sinistro del soggetto approssimativamente nel punto medio tra la rotula e la testa del femore.Quindi, fissarlo alla gamba con le cinghie. La bobina dovrebbe essere sopra la porzione laterale della gamba, sopra il vasto laterale. Fissare un biberon di olio per bambini alla parte mediale della coscia con le stesse cinghie utilizzate per fissare la bobina alla gamba, quindi legare insieme le gambe del soggetto con una cinghia posta sotto la bobina e sopra il ginocchio.Fissare le gambe del soggetto al tavolo MR con cinghie aggiuntive, una sopra il ginocchio e una a metà strada tra il ginocchio e la caviglia. Consentire al soggetto di praticare l'esercizio isometrico per assicurarsi che le cinghie forniscano una resistenza sufficiente. Quindi, una volta che il soggetto si sente a proprio agio, utilizzare la guida di luce laser per contrassegnare il centro della bobina e spostare il tavolo sull'isocentro del magnete utilizzando il punto di riferimento di centraggio.Per la fase di base dell'acquisizione della spettroscopia, istruire il soggetto a sdraiarsi e rilassare i muscoli delle gambe per ridurre al minimo gli artefatti di movimento. Inizia acquistando un localizzatore triplano per verificare il posizionamento e identificare la posizione della bobina. Inoltre, acquisire un secondo localizzatore, ma aprire la vista sezioni sul primo localizzatore a tre piani.Quindi, impostare la sequenza di spettroscopia del fosforo 31 con i parametri di sequenza acquisiti da impulsi non localizzati, come mostrato qui. Centrare e ruotare l'orientamento della fetta facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e tenendo premuto il gruppo di fette e far corrispondere l'orientamento finale delle fette alla posizione della bottiglia di olio. Ora, posiziona la casella di spessore trascinando il secondo localizzatore triplane nella finestra di visualizzazione, quindi trascina la sequenza di spettroscopia nella finestra del protocollo e fai doppio clic per aprirla.Utilizzare la barra degli strumenti di posizione per visualizzare il voxel di spessore che apparirà sulle immagini del localizzatore. Il voxel può essere spostato facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e tenendolo premuto al centro della casella, e le sue dimensioni e la rotazione possono essere modificate facendo clic con il pulsante sinistro del mouse e tenendolo premuto nell'angolo della casella. Posizionare la scatola degli spessori direttamente sotto la bobina e parallelamente al piano dei quadricipiti per garantire l'omogeneità del campo B0.Utilizzare le immagini del localizzatore per identificare la regione sensibile della bobina e regolare la scatola di spessore in modo da comprendere questa regione all'interno del muscolo. Aprire la finestra del visualizzatore di acquisizione e selezionare l'icona della testa nella barra degli strumenti per consentire la visualizzazione dell'acquisizione della spettroscopia in tempo reale, quindi eseguire la sequenza per ottenere un singolo spettro di test. Successivamente, osserva lo spettro risultante ed esamina la qualità dello spessore B0.Cerca un picco di fosfocreatina prominente centrato a zero parti per milione senza rumore significativo. Se lo spettro appare rumoroso, riposizionare la scatola di spessore e riacquistare. Copiare la sequenza di spettroscopia di test con la migliore qualità spettrale e utilizzarla per tutte le misurazioni successive.Aumentare il numero di misurazioni da una a 10, quindi acquisire mentre il soggetto è a riposo. Successivamente, per l'acquisizione dell'esercizio, applicare le impostazioni dello spessore della scansione precedente e impostare la sequenza per acquisire 20 misurazioni. Istruire il soggetto a rimanere prima a riposo per due misurazioni, quindi fornire al soggetto un conto alla rovescia per indicare quando iniziare l'esercizio.A questo punto, il soggetto deve iniziare la flessione dell'estensione del ginocchio con la massima forza e il più rapidamente possibile contro la resistenza delle cinghie per circa 30 secondi. Dopo aver osservato un calo del 30% dell'altezza del picco della PCR, istruire il soggetto a terminare l'esercizio e a riposare. Quindi, acquisisci immediatamente 20 misurazioni aggiuntive dopo l'esercizio senza pause o spessori.Al termine delle acquisizioni, assicurati della qualità dell'esercizio confrontando le altezze di picco della fosfocreatina all'inizio e alla fine dell'esercizio. Questo grafico mostra il recupero della concentrazione di fosfocreatina dopo il suo esaurimento con l'esercizio rapido di estensione del ginocchio quasi statico. La linea rappresenta l'adattamento della funzione di recupero esponenziale.Un'analisi di Bland-Altman del tempo di recupero della fosfocreatina dimostra una differenza media e una deviazione standard di 1,03 più o meno 4,83 secondi e un coefficiente di variazione tra le prove di 4,66. Qui è mostrata una curva rappresentativa di recupero della fosfocreatina dall'esame di un soggetto non deambulante. Si noti che con questo protocollo di esercizio è stata raggiunta una deplezione di fosfocreatina del 64%.Infine, questo confronto dei tempi di recupero della fosfocreatina dimostra una capacità ossidativa mitocondriale sequenzialmente più scarsa nei soggetti di controllo, non diabetici e diabetici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in meno di 20 minuti se eseguita correttamente. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare sia di verificare che lo spettro abbia un segnale sufficiente prima dell'esercizio sia di assicurarsi che l'esercizio si traduca in una deplezione di fosfocreatina di almeno il 30%Dopo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'imaging di quantificazione del muscolo grasso per calcolare la massa muscolare e il contenuto di grasso, che sono anche importanti per la funzione generale del muscolo scheletrico.Questa tecnica può essere utilizzata per studiare molte malattie, tra cui l'atassia di Friedreich, dove ha permesso ai ricercatori di correlare i marcatori genetici della gravità della malattia nella capacità ossidativa mitocondriale. Dopo aver visto questo video, dovresti avere una buona comprensione di come eseguire una scansione con spettroscopia di risonanza magnetica al fosforo 31 in vivo e un protocollo di esercizio. Non dimenticare che lavorare con gli scanner a risonanza magnetica richiede rigorose misure di sicurezza e che tutti gli esperimenti di risonanza magnetica devono essere eseguiti da personale adeguatamente addestrato.

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