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La spettroscopia a fluorescenza a raggi X, o XRF, è una tecnica analitica non distruttiva che viene utilizzata per eseguire analisi elementari di campioni a temperatura ambiente.
Gli analizzatori XRF possono essere applicati a un'ampia gamma di campioni, tra cui quelli biologici, forensi, ambientali e persino le opere d'arte. I campioni possono anche assumere una varietà di forme, come polveri, cristalli e liquidi. Nell'XRF, un campione viene bombardato con un fascio di raggi X che gli provoca l'emissione di raggi X secondari a un'energia inferiore, chiamati radiazioni fluorescenti.
Sebbene sia indicata come tecnica di fluorescenza, l'XRF differisce dalla microscopia a fluorescenza tradizionale in quanto non utilizza luce visibile a bassa energia o molecole attive alla luce.
Questo video introdurrà le basi dell'XRF e dimostrerà come raccogliere mappe elementari di un campione biologico.
Quando un fotone di energia sufficiente si scontra con un atomo, l'energia viene assorbita, eccitando uno degli elettroni del guscio esterno. Quando l'elettrone si rilassa, emette un fotone secondario, tipicamente di energia inferiore. Questo processo è noto come fluorescenza. A differenza dei fotoni a bassa energia, come quelli utilizzati nella microscopia a fluorescenza, i fotoni a raggi X sono abbastanza energetici da espellere completamente gli elettroni trattenuti da un guscio interno. Un elettrone proveniente da un guscio ad alta energia cadrà quindi nel vuoto. Viene rilasciato un fotone proporzionale alla differenza di energia tra i due gusci. Ogni elemento emette un insieme unico di fotoni, o spettro, che può essere utilizzato per identificare l'elemento e determinare la quantità presente. Questo fenomeno è noto come fluorescenza a raggi X.
Una volta raccolto uno spettro elementare, i segnali degli elementi di interesse possono essere isolati. Le misurazioni possono essere effettuate in più punti di un campione, generando un'immagine, un pixel alla volta. Questo processo è noto come scansione raster. Successivamente possono essere generate immagini di tutti gli elementi di interesse. Queste mappe elementari forniscono informazioni preziose sul campione. Con una comprensione dell'XRF, ora sei pronto per preparare un campione di cellule biologiche per generare mappe elementari.
Per iniziare, preparare e sterilizzare prima una finestra di nitruro di silicio, che manterrà il campione in posizione per la scansione. Fai attenzione, poiché sono molto fragili. Orientare la finestra in modo che sia con il lato piatto rivolto verso l'alto. Quindi posiziona la finestra in un piatto di coltura e incollala al piatto usando piccoli pezzi di nastro adesivo.
Infine, sterilizzare la finestra di nitruro di silicio con radiazioni UV per 1 ora.
Ora che la finestra è stata sterilizzata, il campione può essere fissato ad essa. Per prima cosa, tieni il piatto di coltura inclinato e aggiungi il terreno sul lato del piatto. Scaricare lentamente l'inclinazione per rivestire la finestra. Aggiungere le cellule al piatto allo stesso modo e incubare.
Osservare periodicamente le cellule al microscopio ottico fino a quando non sono pronte per l'uso.
In una cappa a flusso laminare, aspirare delicatamente il fluido dalla capsula.
Quindi, sciacquare le cellule con soluzione salina tamponata con fosfato per rimuovere il terreno in eccesso.
Aspirare il PBS e fissare le cellule con paraformaldeide. Dopo 20 minuti, rimuovere la miscela e smaltirla come rifiuto pericoloso.
Rimuovi la finestra dal piatto e tampona rapidamente i bordi e la rientranza posteriore della finestra con un Kimwipe. Posiziona la finestra su una superficie pulita per asciugarla.
Una volta che il campione è asciutto, verificare la presenza di cellule sulla finestra con un microscopio ottico.
Usando lo smalto trasparente, fissa la finestra a un supporto in alluminio.
Inserire il portacampione nel supporto dello strumento, quindi posizionare il supporto sul tavolino di posizionamento dei microscopi a raggi X.
Posizionare la finestra del campione nel punto focale dell'ottica del microscopio a raggi X, con un angolo di 45 gradi rispetto al raggio incidente.
Uscire dall'area dello strumento ed eseguire i passaggi rimanenti da remoto per ridurre al minimo l'esposizione ai raggi X.
Apri l'otturatore e usa l'ottica per focalizzare il fascio di raggi X monocromatico fino a una dimensione del punto inferiore al micrometro.
La posizione dello spot può essere ripresa con una fotocamera precalibrata. Utilizzando le fasi di posizionamento, determinare la larghezza e l'altezza appropriate necessarie per rasterizzare il campione.
Raccogli uno spettro di test dell'elemento di interesse con un tempo di permanenza di 1 ? 2 secondi.
Dallo spettro di test, scegliere un tempo di scansione appropriato per fornire un rapporto segnale/rumore sufficiente per gli elementi di interesse.
Quindi, determinare la risoluzione necessaria per il campione. La risoluzione deve essere inferiore alle caratteristiche di interesse, ma maggiore della dimensione dello spot. Infine, programmare la scansione nel software di scansione e raccogliere l'immagine.
In questo esperimento, è stata eseguita una mappa elementare di una cellula per diversi elementi. Molti metalli, come il rame, il ferro e lo zinco, sono nutrienti importanti nella cellula e sono stati chiaramente identificati all'interno della cellula.
Determinando dove si trova ogni metallo nella cellula, è possibile chiarire informazioni preziose sui suoi normali processi cellulari. Inoltre, le malattie a base di metalli possono essere comprese.
La fluorescenza a raggi X è utilizzata in un'ampia gamma di campi scientifici. La natura non distruttiva dell'XRF ne consente l'uso nello studio di manufatti storici. Gli storici dell'arte utilizzano la tecnica per determinare i pigmenti originariamente utilizzati nelle opere d'arte. Questo può chiarire le informazioni sull'opera, come la provenienza, i colori che sono sbiaditi nel tempo e l'autenticità. Gli scienziati forensi utilizzano anche l'XRF nelle indagini sulla scena del crimine. Quando si spara con un'arma, l'area circostante viene ricoperta da residui di colpi di pistola. I residui di colpi di pistola contengono polvere da sparo, innesco di accensione e metallo dall'involucro e dal proiettile. Le informazioni raccolte con XRF possono identificare il colpevole e l'arma utilizzata.
Un altro campo di studio che si presta alla fluorescenza a raggi X è la paleontologia. Qui, le informazioni elementari vengono raccolte da un fossile di trilobite, un artropode marino vissuto oltre 250 milioni di anni fa.
Caratterizzando la composizione elementare dei fossili, si possono ottenere nuove informazioni sulla vita estinta da lungo tempo. I campioni meglio conservati possono persino fornire la composizione dei tessuti molli che si sono deteriorati molto tempo fa.
Hai appena visto l'introduzione di JoVE alla fluorescenza a raggi X. A questo punto dovresti comprendere la teoria della spettroscopia a raggi X e come raccogliere informazioni elementari da un'ampia gamma di fonti.
Grazie per l'attenzione!
