Fluorescenza a raggi X (XRF)

1. Preparazione delle finestre in nitruro di silicio

1. Usa una pinzetta inversa per raccogliere una finestra (le finestre in nitruro di silicio si frantumano se cadono).
2. Posiziona la finestra su una diapositiva di vetro, lato piatto verso l'alto.
3. Aderisci a piccoli pezzi di scotch ai lati della finestra e usali per far aderire le finestre sul fondo del piatto di cultura.
4. Sterilizzare le finestre nei piatti di coltura con radiazioni UV. Ciò può essere ottenuto con l'impostazione di reticolazione automatica su un armadio di reticolazione UV, seguita da un'ulteriore irradiazione UV sotto la lampada UV nella cappa a flusso laminare per circa 1 ora.

2. Placcatura delle celle sulle finestre sterilizzate in nitruro di silicio

1. Tenere il piatto con esso inclinato di circa 45 °.
2. Aggiungere il supporto mediante pipettaggio verso il lato del piatto e alleviare lentamente l'angolo di inclinazione per rivestire la finestra con il supporto.
3. Aggiungi le cellule al piatto di coltura, allo stesso modo, e incuba.
4. Osservare le cellule di tanto in tanto usando un microscopio ottico per determinare quando sono pronte per l'uso.

3. Fissazione e asciugatura delle cellule

1. In una cappa a flusso laminare, rimuovere il supporto mediante aspirazione delicata mentre si inclina il piatto come descritto sopra.
2. Aggiungere PBS, pipettare verso il lato del piatto tenendolo ad angolo. Alleviare lentamente l'angolo di inclinazione per rivestire la finestra con PBS.
3. Rimuovere il PBS con un'aspirazione delicata.
4. Pipettando verso il lato del piatto e tenendolo ad angolo, aggiungere il 4% di PFA / PBS, pH 7 per coprire le cellule. Conservare in questa soluzione per 20 minuti a temperatura ambiente.
5. Rimuovere la miscela PFA/PBS e smaltire come materiale pericoloso.
6. Aggiungere PBS, pipettaggio come descritto sopra.
7. Ripetere due volte i passaggi 3.5 e 3.6.
8. Rimuovere il PBS mediante aspirazione delicata.
9. Aggiungere 20 mM PIPES, 200 mM saccarosio, pH 7.
10. Rimuovere i TUBI/saccarosio mediante delicata aspirazione.
11. Ripetere due volte i passaggi 2.8 e 2.9.
12. Tamponare rapidamente i bordi e la rientranza posteriore della finestra con un Kimwipe, quindi impostare la finestra su una superficie pulita, come un tappetino griglia di gomma, per asciugare.

4. Imaging a fluorescenza a raggi X delle cellule

1. Una volta che il campione è asciutto, verificare la presenza di cellule sulle finestre utilizzando un microscopio ottico.
2. Utilizzare lo smalto per fissare le finestre a un supporto in alluminio fornito dalla beamline.
3. Inserire il supporto in alluminio in un supporto cinematico, quindi posizionarlo in posizione nel punto focale dell'ottica nel microscopio a raggi X e con un angolo di circa 45 ° rispetto al fascio di raggi X incidente, montato sugli stadi di nanoposizionamento del campione.
4. Uscire dall'area dello strumento del microscopio a raggi X (di solito una gabbia fatta di pareti di piombo) e aprire l'otturatore. Eseguire i passaggi rimanenti da remoto.
5. Utilizzando una piastra di zona o specchi Kirkpatrick-Baez, focalizzare il fascio di raggi X monocromatico (di solito 10 keV di energia) fino a una dimensione dello spot sub-micron.
6. Utilizzando gli stadi del campione di nanoposizionamento e visualizzando la posizione del fascio di raggi X sul campione con una telecamera scintillatore a valle pre-calibrata, determinare la larghezza e l'altezza appropriate della scansione raster per acquisire i dati del campione.
7. Con il rivelatore di deriva del silicio dispersivo a 90 ° dal fascio incidente e a circa 3 mm o meno dal campione, raccogliere uno spettro di prova con un tempo di permanenza di 1-2 secondi.
8. Visualizzando lo spettro di prova, scegliere un tempo di permanenza appropriato per la scansione, per fornire un segnale-rumore sufficiente per gli elementi di interesse.
9. Scegliere una risoluzione appropriata per la scansione, che non sia significativamente più piccola della dimensione dello spot del fascio sul campione, né più grande delle caratteristiche di interesse nel campione.
10. Programmare la scansione nel software di scansione e raccogliere l'immagine.