Identificazione affidabile di vita neuroni dopaminergici in Culture Midbrain Utilizzando RNA Sequencing e TH-promotore-driven eGFP Expression

L'obiettivo generale di questa procedura è identificare in modo affidabile i neuroni dopaminergici viventi in colture mesencefaliche utilizzando l'espressione di eGFP guidata dalla tirosina idrossilasi, la raccolta di singole cellule e la generazione di librerie di sequenziamento dell'RNA. Questo metodo può aiutare a rispondere a domande chiave nel campo della malattia di Parkinson e della tossicodipendenza, perché rende possibile l'esecuzione di saggi di espressione genica ed elettrofisiologici su neuroni dopaminergici viventi identificati in coltura. Il vantaggio di questa tecnica è che fornisce un mezzo per identificare in modo affidabile i neuroni dopaminergici viventi piuttosto che fissi nelle colture mesencefaliche ventrali primarie.

A dimostrare la prima parte della procedura sarà Charlene Kim, un tecnico del laboratorio di Henry Lester. Inizia stabilizzando la testa di un embrione di topo con una pinza saldamente posizionata sul muso, in modo che la superficie dorsale sia accessibile. Usando una pinza tenuta nell'altra mano, pizzicare lo strato di pelle e il cranio appena prima della cresta del mesencefalo e staccare la pelle e il cranio caudelly lungo la linea mediana.

Posiziona la pinza attorno alla cresta con una punta tra la corteccia e il mesonicefalo e l'altra sopra il cervelletto. Pizzica e rimuovi l'intero mesencefalo. Posizionare il mesencefalo in una capsula di Petri con HBSS freddo al microscopio da dissezione.

Sotto il microscopio da dissezione, capovolgere il segmento cerebrale in modo che il lato ventrale sia ora accessibile. Ora ci sono quattro quadranti visibili. Rimuovere tutte le meningi e il sistema vascolare afferrando delicatamente le meningi con una pinza e tirando verso l'alto lontano dal cervello.

Quindi, posiziona una pinza nel ventricolo approssimativamente al centro del segmento. Quindi, per separare il mesencefalo, fai un pizzico dorsalmente, quindi pizzica medialmente su ciascun lato. Prendi i due quadranti inferiori facendo dei tagli laterali su entrambi i lati.

L'area tegmentale ventrale e la substantia nigra pars compacta si trovano nella sezione ventrale inferiore, che appare densa. Posizionare il tessuto sezionato contenente sia il VTA che l'SNC in HBSS fresco in un'area separata della piastra di Petri. Dopo aver sezionato tutti i segmenti cerebrali, utilizzare una pinza e un bisturi numero 11 per suddividere ogni sezione del mesencefalo in pezzi di dimensioni approssimativamente uguali.

Quindi, utilizzare una punta per pipetta P1000 a foro largo per trasferire tutti i segmenti del mesencefalo inquartati in una provetta conica da 15 millilitri. Dopo aver lasciato depositare il tessuto e rimosso l'HBSS, aggiungere 500 microlitri di soluzione di papaina. Incubare a bagnomaria a 37 gradi Celsius per 15 minuti.

Dopo l'incubazione, utilizzare una punta P1000 a foro largo per trasferire solo i segmenti del mesencefalo in un'aliquota da un millilitro di soluzione di DNasi I e lasciare che i segmenti si depositino sul fondo della provetta. Quindi, trasferire solo i segmenti mesencefalici in una provetta da 15 millilitri contenente un millilitro di soluzione di arresto freddo. Sostituire il secondo risciacquo con un millilitro di soluzione di arresto fresca e pipettare su e giù sette volte con un puntale per pipetta P1000 per triturare le cellule.

Quindi appoggiare la sospensione cellulare pipettando lentamente 200 microlitri di soluzione al 4% di BSA sul fondo della provetta. Dopo la centrifugazione a 280 x g per sei minuti, aspirare il surnatante con un P1000 e risospendere le cellule in un millilitro di terreno di placcatura. Eseguire una conta cellulare utilizzando l'emocitometro e quindi diluire la sospensione cellulare a 1000 cellule per microlitro con terreno di placcatura.

Piastra 120 microlitri di sospensione cellulare su piastre di coltura rivestite di poli-D-lisina, poli-L-ornitina e laminina subito dopo l'aspirazione della laminina, per garantire che il rivestimento non si asciughi e formi una superficie irregolare. Quindi, dopo un'ora di incubazione, aggiungere con cura tre millilitri di terreno di coltura in un'area non seminata della piastra di coltura per ridurre al minimo la rottura delle cellule. Dopo tre settimane di coltura, sciacquare la capsula di coltura con due millilitri di PBS di Dulbecco senza RNasi.

Rimuovere il DPBS. Quindi sostituire con un millilitro di DPBS fresco per la raccolta. Utilizzare il set di filtri GFP e l'obiettivo 40X su un microscopio a epifluorescenza invertito per identificare i neuroni fluorescenti TH positivi nelle colture.

Utilizzare il micromanipolatore per la pipetta sul soma cellulare. Quindi utilizzare un tubo di plastica attaccato alla porta laterale del supporto della micropipetta per applicare un'aspirazione delicata al fine di aspirare il neurone nella micropipetta di vetro. Rimuovere immediatamente la micropipetta contenente la cellula dalla soluzione di bagno e posizionare la punta all'interno di una provetta PCR da 0,2 millilitri contenente un tampone di reazione.

Rompere la punta contro il lato del tubo vicino al fondo. Quindi posizionare un ago per siringa sterile calibro 21 nella parte posteriore del micorpipette e applicare pressione per espellere il liquido rimanente dalla punta rotta della micropipetta. Centrifugare la provetta di raccolta per cinque secondi utilizzando una microcentrifuga da tavolo e poi congelarla in ghiaccio secco.

Mentre si lavora nella camera PCR con i reagenti su ghiaccio o su un blocco di refrigerazione, preparare la prima miscela master di ceppo più il 10% di volume aggiuntivo a temperatura ambiente. E un microlitro di tre primer primari uno e un microlitro di punte di RNA quantificate al campione. Quindi incubare il campione nel termociclatore per tre minuti a 72 gradi Celsius e quindi posizionare i campioni direttamente sul rack di raffreddamento della PCR.

Quindi, aggiungere 5,5 microlitri della miscela master preparata alla provetta di reazione in un rack di raffreddamento per PCR e mescolare pipettando delicatamente. Dopo aver centrifugato la provetta per cinque secondi, incubare in un termociclatore impostato sui parametri ora mostrati sullo schermo. Per purificare il cDNA del primo filamento, aggiungere al campione 25 microlitri di perle magnetiche a temperatura ambiente vortexe.

Miscelare pipettando l'intero volume su e giù almeno 10 volte. Quindi incubare a temperatura ambiente per otto minuti per consentire al cDNA di legarsi alle perle. Quindi posizionare i campioni e le microsfere magnetiche sul dispositivo di separazione magnetica fino a quando il liquido appare completamente limpido e non sono rimaste perle nel surnatante.

Aspirare e scartare il surnatante. Far girare il campione per cinque secondi per raccogliere il liquido dal lato del tubo. Posizionare i campioni sul dispositivo di separazione magnetica per 30 secondi.

Quindi rimuovere tutto il surnatante rimanente con il pipettatore P10 per lasciare solo le perle con il DNA legato. Aggiungere 50 microlitri della miscela master PCR ds-cDNA e quindi eseguire il programma PCR di sintesi del secondo filamento per ottenere il cDNA a doppio filamento. Questo istogramma mostra il numero di geni codificanti proteine rilevati nelle librerie di sequenziamento dell'RNA dopaminergico a singola cellula generate da cellule TH-eGFP positive in frammenti per kilobase di trascrizione per milione di letture mappate.

Nelle librerie di singole cellule sono stati rilevati da 6.000 a 8.000 geni proteici. Una volta padroneggiata, questa tecnica può essere eseguita in quattro o cinque settimane, compreso il tempo per derivare le cellule, consentire la maturazione delle cellule in coltura, la raccolta delle cellule e le fasi di generazione della libreria, il sequenziamento delle librerie e l'analisi preliminare. Durante il tentativo di questa procedura, è importante ricordare di mantenere uno spazio di lavoro privo di RNAsi per la generazione della libreria di ricerca dell'RNA e la raccolta delle cellule, di mantenere le tecniche sterili attraverso la coltura cellulare e di realizzare pipette con diametro di dimensioni adeguate per la raccolta di singole cellule.

Non dimenticare che lavorare con la paraformaldeide può essere estremamente pericoloso e che è necessario prendere sempre precauzioni come l'uso di una cappa aspirante, evitare il contatto con la pelle e gli occhi, tenersi lontani da fonti di calore e fiamme libere e indossare indumenti protettivi individuali adeguati. Seguendo questa procedura, è possibile eseguire altri metodi come l'espressione genica e l'analisi della rete genica per rispondere a ulteriori domande, come ad esempio il modo in cui i trattamenti farmacologici influenzano l'espressione proteica nelle cellule dopaminergiche.